세포 스페로이드의 대량 생산을 위한 3차원 음향 조립 장치
Summary
세포 스페로이드는 생물학적 응용 분야에서 하나의 잠재적 모델로 간주되어 왔습니다. 이 기사에서는 균일한 세포 스페로이드를 견고하고 신속하게 제조할 수 있는 효율적인 방법을 제공하는 3D 음향 조립 장치를 사용하여 세포 스페로이드를 확장 가능하게 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
Abstract
세포 스페로이드는 많은 생물학 분야에서 광범위하게 응용되고 있는 유망한 3차원(3D) 모델입니다. 이 프로토콜은 기동성 있는 절차를 통해 3D 음향 조립 장치를 사용하여 고품질 및 고처리량 세포 스페로이드를 제조하는 방법을 제시합니다. 음향 조립 장치는 3개의 PZT(납 지르콘산염 티타네이트) 변환기로 구성되며, 각 변환기는 정사각형 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 챔버의 X/Y/Z 평면에 배열됩니다. 이 구성을 사용하면 3개의 신호가 적용될 때 부상 음향 노드(LAN)의 3D 도트 어레이 패턴을 생성할 수 있습니다. 그 결과, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 용액의 세포를 LAN으로 유도하여 3차원에서 균일한 세포 응집체를 형성할 수 있습니다. 그런 다음 GelMA 용액을 UV 광경화 및 가교 결합하여 세포 응집체의 성장을 지원하는 스캐폴드 역할을 합니다. 마지막으로, 성숙된 스페로이드 덩어리를 얻어 온화한 조건에서 GelMA 스캐폴드를 용해시켜 회수합니다. 제안된 새로운 3D 음향 세포 조립 장치는 세포 스페로이드 및 오가노이드의 스케일업 제조를 가능하게 하여 생물학 분야에서 큰 잠재력을 가진 기술을 제공할 것입니다.
Introduction
기존의 2D 배양 모델에 비해 in vivo와 유사한 구조적 및 형태학적 특성을 더 많이 제공하는 3D in vitro 배양 모델은 조직 공학, 질병 모델링 및 약물 스크리닝과 같은 다양한 생물의학 응용 분야에서 유망한 시스템으로 인정받고 있습니다 1,2,3. 3D 배양 모델의 한 유형인 세포 스페로이드는 일반적으로 세포 응집을 의미하며, 향상된 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 특징으로 하는 3D 구상체 구조를 생성합니다 4,5,6. 따라서 세포 스페로이드 제조는 다양한 생물학적 연구를 가능하게 하는 강력한 도구가 되었습니다.
스페로이드를 얻기 위해 행잉 드롭(hanging drop)7, 비접착 플레이트(non-adhesive plate)8 또는 마이크로웰 장치(microwell device)9를 포함한 다양한 기술들이 개발되었다. 원칙적으로, 이러한 방법은 일반적으로 세포와 기판 사이의 상호 작용을 최소화하면서 중력과 같은 물리적 힘을 이용하여 세포 조립을 용이하게 합니다. 그러나 종종 노동 집약적인 공정이 포함되고 생산성이 낮으며 스페로이드 크기10,11을 제어하는 데 어려움이 있습니다. 중요한 것은 원하는 크기와 균일성을 가진 스페로이드를 충분한 양으로 생산하는 것이 특정 생물학적 응용 분야를 충족하는 데 가장 중요하다는 것입니다. 상술한 방법들과는 대조적으로, 음파는, 외력-구동 기술(12,13,14)의 한 유형으로서, 외력(15,16,17,18)을 통해 세포 응집을 강화하는 원리에 기초하여, 높은 품질과 처리량을 갖는 세포 스페로이드의 대량 제조에 대한 가능성을 보여주었다 . 전자기 또는 자기력과 달리 음향 기반 세포 조작 기술은 비침습적이고 표지가 없어 우수한 생체 적합성으로 스페로이드 형성을 가능하게 합니다19,20.
일반적으로, 스탠딩 표면 음향파(SAW) 및 벌크 음파(BOW) 기반 장치는 대응하는 스탠딩 음향장(21,22,23)에 의해 생성된 음향 노드(AN)를 활용하여 스페로이드를 생성하기 위해 개발되었다. 특히, BAW를 기반으로 하는 음향 조립 장치는 제조가 편리하고, 조작이 용이하며, 확장성이 우수하다는 장점이 있어 셀 스페로이드24,25 제조에 주목받고 있다. 우리는 최근에 높은 처리량을 가진 스페로이드를 생성할 수 있는 손쉬운 BAW 기반 음향 조립 장치를 개발했습니다26. 제안된 장치는 X/Y/Z 평면에 각각 배열된 3개의 지르콘산 납 티타네이트(PZT) 변환기가 있는 정사각형 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 챔버로 구성됩니다. 이러한 배열은 구동 셀 조립을 위한 공중 부양 음향 노드(LAN)의 3D 도트 어레이 패턴을 생성할 수 있습니다. ANs 27,28,29의 1D 또는 2D 어레이만을 생성할 수 있는 이전에 보고된 BAW 또는 SAW 기반 디바이스와 비교하여, 본 디바이스는 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 용액 내에서 신속한 세포 응집체 형성을 위한 LAN의 3D 도트 어레이를 가능하게 합니다. 그 후, 세포 응집체는 배양 3일 후 광경화된 GelMA 스캐폴드 내에서 생존력이 높은 스페로이드로 성숙되었습니다. 마지막으로, 균일한 크기의 많은 스페로이드를 다운스트림 응용 분야를 위해 GelMA 스캐폴드에서 쉽게 얻을 수 있었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D 음향 조립 장치와 같은 기술을 사용하여 높은 처리량으로 세포 스페로이드를 효율적이고 안정적으로 제조하는 것은 생물 의학 공학 및 약물 스크리닝을 발전시키는 데 큰 가능성을 가지고있습니다 1,2,3. 이 접근법은 간단한 절차를 통해 세포 스페로이드의 대량 생산을 단순화합니다.
그러나 이 음향 장?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(2022YFA1104600)과 중국 저장성 자연과학 재단(LQ23H160011)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
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