Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes
Summary
Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.
Abstract
La visualización de proteínas en células vivas utilizando GFP (proteína fluorescente verde) y otras etiquetas fluorescentes ha mejorado en gran medida la comprensión de la localización, la dinámica y la función de las proteínas. En comparación con la inmunofluorescencia, las imágenes en vivo reflejan con mayor precisión la localización de proteínas sin posibles artefactos que surjan de la fijación tisular. Es importante destacar que las imágenes en vivo permiten la caracterización cuantitativa y temporal de los niveles y la localización de proteínas, lo que es crucial para comprender los procesos biológicos dinámicos, como el movimiento o la división celular. Sin embargo, una limitación importante de los enfoques de marcado fluorescente es la necesidad de niveles de expresión de proteínas suficientemente altos para lograr una visualización exitosa. En consecuencia, no se pueden detectar muchas proteínas fluorescentes marcadas endógenamente con niveles de expresión relativamente bajos. Por otro lado, la expresión ectópica mediante promotores virales puede conducir a veces a una mala localización de proteínas o a alteraciones funcionales en contextos fisiológicos. Para abordar estas limitaciones, se presenta un enfoque que utiliza la detección de proteínas mediadas por anticuerpos de alta sensibilidad en embriones vivos, esencialmente realizando inmunofluorescencia sin necesidad de fijación tisular. Como prueba de principio, el receptor Notch marcado con GFP endógeno que apenas es detectable en embriones vivos se puede visualizar con éxito después de la inyección de anticuerpos. Además, este enfoque se adaptó para visualizar las modificaciones postraduccionales (PTM) en embriones vivos, lo que permitió detectar cambios temporales en los patrones de fosforilación de tirosina durante la embriogénesis temprana y reveló una nueva subpoblación de fosfotirosina (p-Tyr) debajo de las membranas apicales. Este enfoque puede modificarse para adaptarse a otros anticuerpos específicos de proteínas, específicos de etiquetas o específicos de PTM y debe ser compatible con otros organismos o líneas celulares modelo susceptibles de inyección. Este protocolo abre nuevas posibilidades para la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o PTM que antes eran difíciles de detectar con los métodos tradicionales de marcado fluorescente.
Introduction
La inmunofluorescencia es una técnica fundamental de la biología celular moderna desarrollada originalmente por Albert Coons, que permite la detección de moléculas en sus compartimentos celulares nativos y la caracterización de las composiciones moleculares de orgánulos o maquinarias subcelulares1. Junto con las manipulaciones genéticas, la inmunofluorescencia ayuda a establecer el concepto ahora bien aceptado de que la localización de proteínas es esencial parasu función. Aparte de los anticuerpos primarios específicos y los colorantes fluorescentes brillantes, el éxito de esta técnica se basa en un proceso preliminar llamado fijación y permeabilización, que preserva las morfologías celulares, inmoviliza los antígenos y aumenta la accesibilidad de los anticuerpos a los compartimentos intracelulares. Inevitablemente, el proceso de fijación y permeabilización mataría a las células y terminaría con todos los procesos biológicos3. Por lo tanto, la inmunofluorescencia solo proporciona instantáneas del viaje de la vida de las proteínas. Sin embargo, muchos procesos biológicos, como la migración y la división celular, son de naturaleza dinámica, lo que requiere la investigación del comportamiento de las proteínas de una manera resuelta espacio-temporalmente 4,5.
Para examinar la dinámica de las proteínas en los organismos vivos, se han desarrollado métodos de imagen en vivo basados en proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, como la proteína fluorescente verde (GFP)6 y microscopios confocales de alta velocidad. Brevemente, la proteína de interés puede ser manipulada genéticamente para ser fusionada con GFP7, y luego expresada ectópicamente a partir de promotores virales o de levaduras como el citomegalovirus (CMV)8 o la secuencia de activación ascendente (UAS)9. Debido a que la GFP es de naturaleza autofluorescente, no se requieren anticuerpos acoplados a fluoróforos para revelar la localización de las proteínas diana, lo que evita la necesidad de procesos preliminares de fijación o permeabilización. A lo largo de las últimas dos décadas, se han desarrollado etiquetas fluorescentes que abarcan todo el espectro de longitudes de onda10, lo que permite obtener imágenes en vivo multicolor de varias proteínas diana al mismo tiempo. Sin embargo, en comparación con los colorantes fluorescentes de ingeniería química como AlexaFluor o ATTO, la autofluorescencia de estas proteínas fluorescentes codificadas genéticamente es relativamente débil e inestable cuando se expresa a partir de promotores endógenos, especialmente durante la obtención de imágenes en vivo en escalas de tiempo más largas10. Si bien este déficit puede mitigarse mediante la sobreexpresión de proteínas diana marcadas con fluorescencia, muchas con actividades enzimáticas como quinasas y fosfatasas interrumpen gravemente los procesos biológicos normales si no se expresan a niveles fisiológicos.
Este protocolo presenta un método que permite la iluminación de dianas basada en anticuerpos fotoestables en una configuración de imagen en vivo, lo que esencialmente permite la inmunofluorescencia sin el proceso de fijación o permeabilización (Figura 1). A través de una simple reacción de amina primaria basada en NHS11, se pueden conjugar colorantes fluorescentes como AlexaFluor 488 o 594 con esencialmente cualquier anticuerpo primario o GFP/HA/Mycnanobody 12. Aprovechando una característica del desarrollo de que todas las células embrionarias de Drosophila comparten un citoplasma común durante la etapa13 de sincitio, se puede lograr la unión al antígeno y la iluminación en embriones enteros después de la inyección de anticuerpos conjugados con colorante. Con la expansión de las bibliotecas de proteínas marcadas endógenamente disponibles en Drosophila y otros sistemas modelo14, este método puede ampliar potencialmente las aplicaciones de estas bibliotecas al revelar la dinámica de las proteínas marcadas con fluorescencia de baja abundancia y otras proteínas marcadas con fluorescencia (marcadas con HA/Myc) en tejidos vivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento presentado describe el método especializado de marcaje de fluorescencia con anticuerpos personalizados y la posterior inyección en embriones de Drosophila en etapa temprana. Esta técnica facilita la visualización en tiempo real de proteínas o modificaciones postraduccionales que existen en pequeñas cantidades y que suelen ser difíciles de observar a través de los métodos convencionales de marcado GFP/mCherry.
Se debe tener precaución al extender este méto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a la Dra. Jennifer A. Zallen por proporcionar la línea Sqh-GFP Drosophila y el apoyo para el desarrollo inicial de esta técnica, y al Dr. Francois Schweisguth por proporcionar la línea Notch-GFP Drosophila . Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32270809) para H.H.Yu, el generoso apoyo financiero y de personal de la Escuela de Ciencias de la Vida, SUSTech, y el financiamiento a Y. Yan de la Comisión de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
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