Summary
Das Protokoll beschreibt eine effiziente und zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Poly(A)-Länge des interessierenden Gens aus dem Drosophila-Nervensystem , die leicht an Gewebe oder Zelltypen anderer Spezies angepasst werden kann.
Abstract
Die Polyadenylierung ist eine entscheidende posttranskriptionelle Modifikation, bei der Poly(A)-Schwänze an das 3'-Ende von mRNA-Molekülen angehängt werden. Die Länge des Poly(A)-Schwanzes wird durch zelluläre Prozesse streng reguliert. Eine Dysregulation der mRNA-Polyadenylierung wurde mit abnormaler Genexpression und verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Krebs, neurologische Störungen und Entwicklungsstörungen. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Polyadenylierung von entscheidender Bedeutung, um die Komplexität der mRNA-Prozessierung und der posttranskriptionellen Genregulation zu entschlüsseln.
In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Poly(A)-Schwanzlängen in RNA-Proben vorgestellt, die aus Drosophila-Larvengehirnen und Drosophila-Schneider-S2-Zellen isoliert wurden. Wir verwendeten den Guanosin/Inosin (G/I)-Tailing-Ansatz, bei dem G/I-Reste enzymatisch am 3'-Ende der mRNA unter Verwendung von Hefe-Poly(A)-Polymerase hinzugefügt werden. Diese Modifikation schützt das 3'-Ende der RNA vor enzymatischem Abbau. Die geschützten Poly(A)-Schwänze in voller Länge werden dann mit einem universellen Antisense-Primer rückwärts transkribiert. Anschließend wird die PCR-Amplifikation mit einem genspezifischen Oligo durchgeführt, das auf das interessierende Gen abzielt, zusammen mit einem universellen Sequenzoligo, das für die reverse Transkription verwendet wird.
Dadurch werden PCR-Produkte erzeugt, die die Poly(A)-Schwänze des interessierenden Gens umfassen. Da die Polyadenylierung keine einheitliche Modifikation ist und zu unterschiedlich langen Schwänzen führt, weisen die PCR-Produkte eine Reihe von Größen auf, was zu einem Abstrichmuster auf Agarosegel führt. Abschließend werden die PCR-Produkte einer hochauflösenden Kapillargelelektrophorese unterzogen, gefolgt von einer Quantifizierung anhand der Größen der Poly(A)-PCR-Produkte und des genspezifischen PCR-Produkts. Diese Technik bietet ein einfaches und zuverlässiges Werkzeug zur Analyse von Poly(A)-Schwanzlängen, das es uns ermöglicht, tiefere Einblicke in die komplizierten Mechanismen der mRNA-Regulation zu gewinnen.
Introduction
Die meisten eukaryotischen mRNAs werden an ihrem 3′-Terminus im Zellkern durch Zugabe von nicht-template-Adenosinen durch kanonische Poly(A)-Polymerasen posttranskriptionell polyadenyliert. Ein intakter Poly(A)-Schwanz ist während des gesamten Lebenszyklus von mRNA von entscheidender Bedeutung, da er für den mRNA-Kernexportunerlässlich ist 1, die Interaktion mit Poly(A)-bindenden Proteinen erleichtert, um die Translationseffizienz zu verbessern2, und Resistenz gegen Abbauverleiht 3. In bestimmten Fällen kann der Poly(A)-Schwanz auch im Zytoplasma gedehnt werden, was durch nicht-kanonische Poly(A)-Polymerasen erleichtert wird4. Im Zytoplasma ändert sich die Poly(A)-Schwanzlänge dynamisch und beeinflusst die Lebensdauer des mRNA-Moleküls. Zahlreiche Polymerasen und Deadenylasen sind dafür bekannt, die Schwanzlänge zu modulieren 5,6,7. Zum Beispiel korreliert die Verkürzung der Poly(A)-Schwänze mit der translationalen Repression, während die Verlängerung der Poly(A)-Schwänze die Translation verstärkt 8,9.
Zunehmende genomische Studien haben die grundlegende Bedeutung der Poly(A)-Schwanzlänge in verschiedenen Facetten der eukaryotischen Biologie gezeigt. Dazu gehören Rollen bei der Keimzellentwicklung, der frühen Embryonalentwicklung, der neuronalen synaptischen Plastizität für Lernen und Gedächtnis und der Entzündungsreaktion10. Es wurden zahlreiche Methoden und Assays zur Messung von Poly(A)-Schwanzlängen entwickelt. Beispielsweise nutzt der RNase H/Oligo(dT)-Assay die Vorteile von RNase H in Gegenwart oder Abwesenheit von Oligo(dT), um die Poly(A)-Schwanzlänge zu untersuchen11,12. Andere Methoden zur Untersuchung des Poly(A)-Schwanzes umfassen die PCR-Amplifikation von 3'-Enden, wie z. B. die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, den Poly(A)-Test (RACE-PAT)12,13 und den Ligase-vermittelten Poly(A)-Test (LM-PAT)14. Weitere Modifikationen des PAT-Assays umfassen ePAT15 und sPAT16. Enzymatisches G-Tailing 17,18 oder G/I-Tailing des 3'-Endes sind weitere Variationen des PAT-Assays. Eine weitere Modifikation dieser Techniken umfasst die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern zusammen mit einer Kapillargelelektrophorese für hochauflösende Analysen, die als hochauflösender Poly(A)-Test (Hire-PAT)19 bezeichnet wird. Diese PCR-gesteuerten Assays ermöglichen eine schnelle und hochempfindliche Quantifizierung der Poly(A)-Länge.
Mit der Entwicklung der Next-Generation-Sequenzierung ermöglicht eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode wie PAL-seq20 und TAIL-seq21 Polyadenylierungsanalysen im transkriptomweiten Maßstab. Diese Methoden liefern jedoch nur kurze Sequenzierungs-Reads von 36-51 Nukleotiden. Daher wurde FLAM-Seq22 für die globale Schwanzlängenprofilierung von mRNA in voller Länge entwickelt und bietet lange Lesevorgänge. Die Nanoporentechnologie23 bietet PCR-unabhängige, direkte RNA- oder direkte cDNA-Sequenzierung für die Schätzung der Poly(A)-Schwanzlänge. Diese Hochdurchsatzmethoden sind jedoch nicht ohne Einschränkungen. Sie benötigen große Mengen an Ausgangsmaterialien, sind teuer und zeitaufwändig. Darüber hinaus kann die Analyse seltener Transkripte mit Hochdurchsatzmethoden äußerst anspruchsvoll sein, und PCR-basierte Methoden mit niedrigem Durchsatz bieten immer noch einen Vorteil, wenn eine kleine Anzahl von Transkripten analysiert werden muss, für Pilotexperimente und die Validierung anderer Methoden.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass Dscam1-mRNAs kurze Poly(A)-Schwänze in Drosophila enthalten, was eine nicht-kanonische Bindung des zytoplasmatischen Poly(A)-bindenden Proteins an Dscam1 3'UTR unter Verwendung der G/I-Tailing-Methode24 erfordert. Hier bieten wir ein optimiertes Verfahren zur Gewebepräparation und Quantifizierung der Poly(A)-Länge von mRNAs aus dem Drosophila-Nervensystem und Drosophila-S2-Zellen .
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Protocol
1. Aufzucht und Selektion von Drosophila-Larven
- Den Fliegenstamm (w1118, Wildtyp) auf Standard-Fliegenfuttermedium bei 25 °C in einem befeuchteten Inkubator pflegen/kultivieren.
- Wählen Sie 10 wandernde Larven des 3. Stadiums 72 h nach der Eiablage aus.
- Legen Sie die Larven in eine leere 35-mm-Petrischale und waschen Sie sie vorsichtig, indem Sie die Larven mit einer Pinzette in die neue Schale mit Leitungswasser geben. Tun Sie dies 2x, um restliche Lebensmittel zu entfernen.
2. Isolierung des Gehirns von Drosophila-Larven (Abbildung 1)
Abbildung 1: Sektion des Gehirns der Drosophila-Larve aus dem 3. Wanderstadium des Stadiums. (A) Schematische Zeichnungen der Drosophila-Larve. (B-G) Larven-Sezierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Legen Sie 10 Larven auf eine Sezierschale mit eiskaltem PBS.
- Legen Sie die Rückenseite der Larve nach oben (gekennzeichnet durch Trachealtuben, die entlang ihrer Länge verlaufen) und stecken Sie jedes Ende an den Boden der Schale, gefolgt von einem kleinen Schnitt an der Körperwand am hinteren Ende.
- Schneiden Sie die Körperwand entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des vorderen Endes mit einer Mikrodissektionsschere.
- Spülen Sie das Innere der Larve kurz mit einer Pasteurpipette 3x mit PBS in der Schale, um das Gehirn freizulegen.
- Lokalisieren und heben Sie das Gehirn mit der Pinzette an und isolieren Sie es vorsichtig mit einer Mikrodissektionsschere.
- Übertragen Sie die präparierten Gehirne in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit eiskaltem PBS auf Eis gefüllt ist. sammle alle Larvengehirne. Fahren Sie mit der RNA-Extraktion mit einem RNA-Microprep-Kit fort, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
HINWEIS: Führen Sie innerhalb von 15 Minuten eine Sektion von 10 Larven durch, um Gewebeschäden und RNA-Abbau zu vermeiden.
3. Drosophila S2 Schneider-Zellen
- Züchten Sie Drosophila S2-Zellen in Drosophila Schneiders Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) bei 25 °C in einem befeuchteten Inkubator auf eine Dichte von 8 × 106 bis 10 × 106 Zellen/ml mit einer Lebensfähigkeit von mindestens 90 %.
- In einem sterilen konischen 50-ml-Röhrchen werden die Zellen auf 2,5 × 106 Zellen/ml mit Schneider's Drosophila-Medium verdünnt, das mit 10 % FBS ergänzt wird, das auf 25 °C vorgewärmt wurde.
- 8 ml der Zellsuspension (20 × 106 Zellen) in eine 100-mm-Kulturplatte geben und 4 ml Medium hinzufügen, um 12 ml (Tag 1) zu erhalten.
- Inkubieren Sie die kultivierten Zellen bei 25 °C in einem befeuchteten Inkubator.
HINWEIS: Die Zellen haften nach 12-16 h (Tag 2) locker an der Platte. - Transfizieren Sie die Zellen mit geeigneten DNA-Plasmiden24.
- 48 Stunden in einem befeuchteten Inkubator inkubieren.
- Sammeln Sie nach der Inkubation Zellen, indem Sie 5 ml eiskaltes PBS durch sanftes Pipettieren (Tag 4) hinzufügen.
- Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 × g für 5 min bei 4 °C.
- Spülen Sie die Zellen 2x mit eiskaltem PBS durch schonendes Pipettieren und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1.000 × g für 5 min bei 4 °C.
- Führen Sie die RNA-Extraktion mit einem RNA-Miniprep-Kit durch.
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Laminar-Flow-Haube aus.
4. Gesamt-RNA-Extraktion aus Drosophila-Larven, Gehirn und S2-Zellen
- Larvengehirn: Entfernen Sie PBS durch kurzes Zentrifugieren (8 s kurzes Schleudern bei 5.000 × g).
- Fügen Sie 600 μl RNA-Lysepuffer hinzu und homogenisieren Sie 10x mit einem Kunststoffstößel. Überprüfen Sie das Röhrchen visuell unter einem Stereomikroskop, um eine vollständige Lyse sicherzustellen.
- Bei 1.000 × g 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um Gewebereste zu entfernen. Den geklärten Überstand in ein nukleasefreies Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Isolieren Sie RNA mit einem RNA-Microprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Die Verwendung eines RNA-Microprep-Kits ist für die Larvenhirnproben aufgrund der geringen Menge an RNA in den Proben unerlässlich. - S2-Zellen: Entfernen Sie PBS und isolieren Sie RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Messen Sie die RNA-Ausbeute und -Qualität durch Spektrophotometrie und Agarose-Gelelektrophorese.
- Bestimmen Sie die Reinheit und Menge der extrahierten RNA durch Messung der optischen Dichte der extrahierten RNA bei A260 nm bzw. A280 nm. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von A260 nm/Azu 280 nm ≥2,0 und die RNA-Konzentration >350 ng/μl für Downstream-Anwendungen beträgt.
HINWEIS: Eine typische RNA-Ausbeute von 10 Drosophila-Larvengehirnen beträgt ~500-800 ng/μl oder 2,5-4 μg in 5 μl. Für S2-Zellen beträgt die Ausbeute ~2-3 μg/μl (15-30 μg in 15 μl). Isolierte RNA kann bei -80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden.
- Bestimmen Sie die Reinheit und Menge der extrahierten RNA durch Messung der optischen Dichte der extrahierten RNA bei A260 nm bzw. A280 nm. Stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von A260 nm/Azu 280 nm ≥2,0 und die RNA-Konzentration >350 ng/μl für Downstream-Anwendungen beträgt.
5. Herstellung von RNA-Gel und Elektrophorese
- 1,5 % denaturierendes RNA-Gel (100 ml)
HINWEIS: Formaldehyd ist giftig durch Hautkontakt und Einatmen von Dämpfen; Behandeln Sie es in einem chemischen Abzug.- Lösen Sie drei Agarosetabletten (1,5 g) in 82 ml MOPS-Puffer (Supplemental File 1), bis die Tabletten vollständig zerfallen und feine Partikel bilden.
- Die Agarose-Aufschlämmung in der Mikrowelle erhitzen, bis die Lösung klar ist und sich alle Partikel vollständig aufgelöst haben.
- Die Lösung auf ~60 °C abkühlen lassen.
- Fügen Sie 18 ml 37% Formaldehyd hinzu und mischen Sie es durch sanftes Schwenken. Gießen Sie die Lösung in die Gießschale und lassen Sie sie in einem Abzug erstarren.
- RNA-Probenvorbereitung und Elektrophorese
- Verdünnen Sie die RNA-Probe auf 200 ng (in 5 μl) und fügen Sie 5 μl 2x RNA-Ladefarbstoff hinzu.
- Die Proben werden 5 Minuten lang in einem Trockenbad auf 70 °C erhitzt.
- Laden Sie 2 μl RNA-Leiter in die erste Spur und 10 μl Proben in die benachbarten Spuren.
- Führen Sie die Elektrophorese in MOPS-Puffer bei 100 V für 60 min für ein 5 x 6 cm großes Gel durch.
HINWEIS: Passen Sie die Elektrophoresebedingungen in Abhängigkeit von den Amplikongrößen an. - Visualisieren Sie das Gel auf einem UV-Transilluminator.
HINWEIS: Das Vorhandensein einer einzelnen Bande ~600 Nukleotidgröße weist auf eine intakte RNA-Präparation hin (siehe Abbildung 2A).
6. Messung der Poly(A)-Schwanzlänge
Abbildung 2: RNA-Probenvorbereitung und der Poly(A)-Schwanz-Assay. (A) Die RNA-Gel-Bilder zeigen die Gesamt-RNA aus dem Drosophila-Larvengehirn (links) und den S2-Zellen (rechts) auf einem 1,5%igen Formaldehyd-Agarose-Gel. Einzelsträngige RNA-Leitergrößen sind in Nukleotiden auf Spur M dargestellt. Beachten Sie eine Haupt-RNA-Bandierung bei ~600 nt, die von rRNA stammt. (B) Schematische Darstellung des Poly(A)-Schwanz-Assays. Abkürzung: G/I = Guanosin/Inosin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- GI-Tailing (Abbildung 2B)
- Lassen Sie die Reagenzien auf Eis und bereiten Sie die folgende Mischung (20 μl) vor: bis zu 14 μl Gesamt-RNA-Probe (1 μg), 4 μl 5x Tail-Puffermischung und 2 μl 10x Tail-Enzymmischung.
- Bei 37 °C 60 min in einem Thermocycler inkubieren.
- Fügen Sie 1,5 μl der Endanschlaglösung hinzu; 2 Minuten auf Eis halten.
HINWEIS: Fahren Sie mit der reversen Transkription fort oder lagern Sie die GI-tailed RNA-Proben bei -80 °C, bis Sie mit der reversen Transkription fortfahren können.
- Reverse Transkription und PCR-Amplifikation
- Synthetisieren Sie cDNA, indem Sie die Mischung vorbereiten und unter den in der Zusatzdatei 1 beschriebenen Bedingungen inkubieren.
- Verdünnen Sie die cDNA-Proben und führen Sie eine PCR durch, um die DNA zu amplifizieren, wie in der Zusatzdatei 1 angegeben.
7. PCR-Produktanalyse mittels Agarose-Gelelektrophorese
- Analysieren Sie eine kleine Portion (2-5 μl) der PCR-Produkte aus Schritt 6.2.2 auf einem 2,5%igen Agarosegel durch Elektrophorese bei 100 V für 45 min zur Qualitätskontrolle.
- Überprüfen Sie die Spezifität der PCR für gen- und schwanzspezifische Reaktionen durch Sequenzierung der gelextrahierten PCR-Banden.
8. Kapillarelektrophorese
- Führen Sie eine hochauflösende Gelelektrophorese an 1 μl PCR-Produkten (0,5-5 ng/μl) aus genspezifischer und poly(A)-spezifischer PCR mit dem Bioanalysator mit einem hochempfindlichen DNA-Kit durch. Suchen Sie nach gut aufgelösten Spitzen, die auf einen erfolgreichen Lauf hinweisen.
9. Datenanalyse: Poly(A)-Schwanzlängenmessung (Abbildung 3)
Abbildung 3: Messung der Poly(A)-Schwanzlänge und des Spitzenwerts. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Zugriff auf Daten
- Um auf die Daten zuzugreifen, öffnen Sie die xad-Datei in der Software.
- Wählen Sie den Beispielnamen oder den Kontaktplan im Strukturansichtsfenster aus.
HINWEIS: Dies zeigt das Ergebnis als Elektropherogramme oder gelartige Bilder für die ausgewählten Proben. Der untere Marker 35 Basenpaar (bp) und der obere Marker 10.380 bp sind die internen Standards, die verwendet werden, um die Kontaktplandaten (50-7.000 bp) mit den Daten aus den Probenvertiefungen abzugleichen. - Vergrößern und verkleinern Sie die Elektropherogramme und gelartigen Bilder, um die Details anzuzeigen.
- Durchführung von Peak- und Smear-Analysen
- Um die Peakgrößen zu erhalten, öffnen Sie das Elektropherogramm einer ausgewählten Probe.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Elektropherogramm und wählen Sie Manuelle Integration , um Peaks manuell auszuwählen, indem Sie die horizontale Linie ziehen.
- Beobachten Sie die Spitzenwerte in der Tabelle Peak. Identifizieren Sie den Peak mit der größten Peakhöhe. Dies ist ein Peak der Poly(A)-Schwanzlänge für eine einzelne Probe. Im gezeigten Beispiel sind es 346 bp.
- Aktivieren Sie das Symbol Sollwerte ein-/ausblenden im oberen Menü und warten Sie, bis auf der rechten Seite ein neues Fenster angezeigt wird.
- Wählen Sie Erweitert aus, scrollen Sie nach unten, um Abstrichanalyse durchführen zu finden, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen. Dadurch wird die Tabelle Region zur Registerkarte Elektropherogramm hinzugefügt.
- Wählen Sie ein Elektropherogramm aus einer Probe aus und wechseln Sie zur Tabelle Region, in der die Menüs Von [bp] und Bis [bp] angezeigt werden. Um den Start und das Ende [bp] festzulegen, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Elektropherogramm und wählen Sie Region , um Region hinzufügen hinzuzufügen.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Zelle in der Tabelle Region und wählen Sie Regionen ändern, um ein kleines neues Fenster zu öffnen, in dem benutzerdefinierte Regionen festgelegt werden können.
HINWEIS: Zum Beispiel haben wir einen Bereich von 300 bp bis 550 bp für GAPDH verwendet. Die genspezifische GAPDH-PCR ergab einen Peak von 265 bp. Der universelle Primer (Tabelle 1) verlängert die Länge der Poly(A)-PCR um 35 bp durch Annealing auf G/I-tailed RNAs. So beginnt das erste Adenin-Nukleotid auf GAPDH-RNA bei 300 bp (265 + 35). Wir haben die maximale Poly(A)-Schwanzlänge willkürlich auf 250 begrenzt (300 + 250 = 550). Aus der Regionstabelle gibt das Programm die durchschnittliche Größe innerhalb der Region mit 387 bp zurück. - Verwenden Sie Gleichung (1), um die Poly(A)-Schwanzlänge auf der interessierenden mRNA zu berechnen:
Poly(A) Schwanzlänge = (A - B - 35) (1)
Dabei ist A der durchschnittliche bp des poly(A)-spezifischen PCR-Produkts aus dem Elektropherogramm (d. h. 387 bp für GAPDH), B ist der maximale bp des genspezifischen PCR-Produkts aus dem Elektropherogramm (d. h. 265 bp für GAPDH) und "35" ist die Länge des universellen umgekehrten Primer-Tags.
HINWEIS: Aus der obigen Berechnung ergibt sich die durchschnittliche Poly(A)-Schwanzlänge von GAPDH von 387 - 265 - 35 = 87 bp.
10. Visualisierung der Poly(A)-Schwanzlängenverteilung
- Exportieren Sie Daten als CSV-Datei unter Datei | Exportieren | Beispieldaten , um Beispieldaten abzurufen.
HINWEIS: Die exportierte CSV-Datei zeigt auf der X-Achse die Laufzeit anstelle von bp an. - Gehen Sie zu einem Elektropherogramm einer Probe und aktivieren Sie Größen anzeigen auf der Registerkarte Elektropherogramm , um die Bereichstabelle in der Regionstabelle automatisch von bp in die Laufzeit zu konvertieren. Im Beispiel entsprechen 70,39 s bis 86,28 s 300 bp bis 550 bp.
- Öffnen Sie die CSV-Datei, und wählen Sie die Werte zwischen 70,39 s und 86,28 s Laufzeit aus, um ein Diagramm zu erstellen. Um die bp-Größen auf der X-Achse im Diagramm zu visualisieren, exportieren Sie das Elektropherogramm mit bp-Größen als Bilddatei und überlagern Sie es mit dem in der Tabelle generierten Diagramm. Dies entspricht den bp-Größen bei der Poly(A)-Schwanzverteilung.
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Representative Results
Hier analysierten wir die Poly(A)-Schwanzlänge von Dscam1 und GAPDH aus Drosophila-Larvengehirnen (Abbildung 4). Isolierte RNAs wurden zur Qualitätskontrolle auf einem Agarosegel visualisiert. Eine einzelne RNA-Bande bei einer Nukleotidgröße von etwa 600 weist auf eine intakte RNA-Präparation hin (Abbildung 2A). Die RNAs wurden mit einem Agilent 2100 Bioanalysator dem G/I-Tailing und der hochauflösenden Kapillarelektrophorese unterzogen. Die Gelbilder wurden mit der Agilent 2100 Expert Software exportiert und entsprechend zusammengesetzt. Die PCR-Produkte aus den genspezifischen Primerpaaren GAPDH und Dscam1 zeigten eine deutliche einzelne Bande, während die Produkte aus den genspezifischen/universellen Primerpaaren unterschiedliche Abstrichmuster aufwiesen (Abbildung 4A und Tabelle 1), was auf die unterschiedliche Poly(A)-Länge von GAPDH - und Dscam1-mRNAs hinweist. In Abbildung 4B wurde die Abstrichanalyse verwendet, um durchschnittliche Poly(A)-Schwanzlängen aus GAPDH und Dscam1 zu erhalten. Die Elektropherogramme wurden exportiert und modifiziert, um die Poly(A)-Schwanzlängen darzustellen (Abbildung 4C).
In ähnlicher Weise führten wir eine Poly(A)-Schwanzlängenanalyse an S2-Zellen durch (Abbildung 5). Um die Rolle von Dscam1 3'UTR bei der Verkürzung von Poly(A)-Schwänzen zu bestimmen, wurden S2-Zellen mit den DNA-Plasmiden, die Dscam1-kodierende Region enthalten, entweder mit SV40 3'UTR oder Dscam1 3'UTR transfiziert. Das Minimum SV40 3'UTR wurde für die Kontrolle von Dscam1 3'UTR ausgewählt, da SV40 3'UTR als minimales Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssignal für rekombinante DNA-Plasmide weit verbreitet ist. Die Gesamt-RNA wurde extrahiert und einer RT-PCR, G/I-Tailing und hochauflösender Kapillarelektrophorese unterzogen (Abbildung 5). Das Ergebnis zeigt, dass die Poly(A)-Schwanzlängenverteilung aus dem SV40 3'UTR-Plasmid einem ähnlichen Muster folgte wie die des endogenen GAPDH , während die Poly(A)-Schwanzlängenverteilung aus dem Dscam1 3'UTR-Plasmid einem ähnlichen Muster folgte wie die endogene Dscam1-mRNA aus den Larvengehirnen.
Abbildung 4: Poly(A)-Schwanzlängenmessung von GAPDH und Dscam1 aus den Larvengehirnen. (A) Die Kapillargelelektrophorese löst das genspezifische PCR-Produkt als diskrete Bande (erste und zweite Spur) für GAPDH2 und Dscam1 auf. Das PCR-Produkt mit universellem Reverse-Primer zeigt eine Abstrichverteilung (dritte und vierte Spur). * unspezifisches Band. (B) Die durchschnittlichen Poly(A)-Schwanzlängen wurden mit Hilfe der Abstrichanalyse berechnet. (C) Die Verteilung der Poly(A)-Endlänge wurde aus der exportierten csv-Datei rekonstruiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Poly(A)-Schwanzlängenmessung von transfiziertem Dscam1-DNA-Plasmid. Kultivierte Drosophila S2-Zellen wurden mit den Dscam1-Konstrukten co-transfiziert, die die kodierende Region von Dscam1 und die 3′UTR von Dscam1 oder SV40 enthalten. (A) Kapillargelelektrophoresebilder werden für das genspezifische PCR-Produkt als diskrete Bande (erste und zweite Spur) für SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) und Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR) gezeigt. Das PCR-Produkt mit universellem Reverse-Primer zeigt ein Abstrichmuster (dritte und vierte Spur). * unspezifisches Band. (B) Die durchschnittlichen Poly(A)-Schwanzlängen wurden mit Hilfe der Abstrichanalyse berechnet. (C) Die Poly(A)-Schwanzlängenverteilung wurde aus der exportierten csv-Datei rekonstruiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| DSCAM1 |
| Forward Primer (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG |
| Reverse Primer (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC |
| SV40 |
| Forward Primer (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC |
| Reverse Primer (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG |
| GAPDH |
| Forward Primer (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC |
| Reverse Primer (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC |
| Universelle Rückseitengrundierung |
| Reverse Primer (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCTT |
Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Primer.
Ergänzende Datei 1: Zusammensetzung der Lösungen und PCR-Setup. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik zur Sezierung des Drosophila-Larvengehirns aus dem wandernden 3. Stadium sowie die Probenvorbereitung aus Drosophila S2-Zellen. Aufgrund der labilen Natur von mRNAs erfordert die Probenentnahme besondere Vorsicht. Bei der Larvendissektion des Gehirns sollte das Gehirn während der Isolation nicht beschädigt und nicht über einen längeren Zeitraum in Lösung gehalten werden. Es ist wichtig, die Sezierzeit für eine Sezierrunde auf 8-10 Minuten zu halten. Es kann auch von Vorteil sein, die Dissektionslösung mit RNAase-Inhibitoren zu ergänzen. Führen Sie bei der Kultivierung und Transfektion der S2-Zellen alle Schritte in der Laminar-Flow-Haube durch.
Der Schritt der RNA-Isolierung erfordert zusätzliche Überlegungen. Wir empfehlen die Verwendung eines Reinraums vom Typ Laminar Flow, der mit RNase-entfernenden Lösungen vorbehandelt ist. Neben der RNA-Ausbeute ist es wichtig, die RNA-Integrität zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Probe während der Dissektions- und Isolierungsschritte nicht abgebaut wurde. Die RNA-Integrität kann durch denaturierte Agarose-Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. Die Gesamt-RNA von Drosophila weist ein einzelnes Bandenprofil auf, da die 28S-rRNA in zwei gleich große Untereinheiten dissoziiert ist, was mit der 18S-rRNA25 übereinstimmt. Dies kann als eine einzelne Bande von etwa 600 Nukleotiden angesehen werden, wenn eine einzelsträngige RNA-Leiter verwendet wird (Abbildung 2A).
Isolierte RNA-Proben werden dem G/I-Tailing unterzogen (Abbildung 2B). Guanosin- und Inosinreste werden am 3'-Ende der RNAs durch die Hefe-Poly(A)-Polymerase (PAP)17 hinzugefügt, die das 3'-Ende der RNA vor enzymatischem Abbau bewahrt. Die neu synthetisierten G/I-Tag-geschützten RNAs in voller Länge werden rückwärts transkribiert, um cDNA-Proben unter Verwendung des universellen reversen Primers (3'-markiertes C10T2) zu erhalten. Gefolgt von einer PCR mit den genspezifischen Vorwärts-/Rückwärtsprimern direkt vor der Polyadenylierungsstelle, um ein PCR-Produkt zu erzeugen, das eine scharfe Bande aufweist. Die PCR-Reaktionen von einem genspezifischen Vorwärts- und dem universellen Reverse-Primer erzeugen undefinierte Längen von DNA-Molekülen als Abstrich auf dem Gel, der unterschiedliche Längen von Poly(A)-Schwänzen widerspiegelt. Die PCR-Produkte wurden anschließend mittels Kapillargelelektrophorese analysiert.
Bei der Entwicklung von Primern ist es wichtig zu beachten, dass die Amplikongröße mit genspezifischen Vorwärts-/Rückwärtsprimern im Bereich von 50-300 bp liegen sollte. Das Testen mehrerer Vorwärtsprimer bietet die Möglichkeit, den besten Primer zu finden, der für die Bewertung des Poly(A)-Schwanzes geeignet ist. Wir empfehlen, einen umgekehrten Primer für genspezifische Produkte direkt vor der vorhergesagten Poly(A)-Startstelle zu entwerfen, da dies eine einfache Berechnung der Poly(A)-Schwanzlängen bietet. Bei der Durchführung von PCR-Reaktionen ist es wichtig, eine "No-Reverse-Transkriptase-Kontrolle" durchzuführen, um eine Amplifikation durch kontaminierte genomische DNA auszuschließen. Die PCR-Optimierung mit einem Annealing-Temperaturgradienten wird dringend empfohlen. Angesichts der Art dieser Methodik erfordert die Analyse von Poly(A)-Schwanzlängen von alternativ polyadenylierten mRNA-Spezies zusätzliche Überlegungen. Zum Beispiel durchlaufen viele Gene eine alternative Polyadenylierung, um verschiedene 3'UTR-Spezieszu erzeugen 26. Wir empfehlen die Verwendung verschiedener PCR-Primer-Sets, um einzelne 3'UTR-Spezies zu untersuchen.
Wir empfehlen dringend, das genspezifische PCR-Produkt in jedem Lauf in die Kapillargelelektrophorese aufzunehmen, da in jedem Lauf ein potenzieller Migrationsunterschied von einigen Nukleotiden besteht. Es ist wichtig, dass bei der Berechnung der Poly(A)-Schwanzlänge die tatsächliche Basenpaargröße der genspezifischen PCR anstelle der theoretischen Größen verwendet wird.
Einige RNAs durchlaufen zusätzliche posttranskriptionelle Modifikationen, einschließlich der terminalen Uridylierung27. Die G/I-Tailing-Methode ist möglicherweise nicht für die Messung der Poly(A)-Schwanzlänge geeignet, wenn die mRNA uridyliert ist. Dies liegt daran, dass der universelle Reverse-Primer die mRNA-Spezies, die an ihrem 3'-Ende Nicht-Adenin-Nukleotide enthält, möglicherweise nicht effizient amplifiziert. Das G/I-Tailing ist eine PCR-basierte Methode, die möglicherweise unerwünschte Verzerrungen erzeugt, indem kürzere Fragmente effizienter amplifiziert werden. Daher sollten Benutzer bei der Interpretation des Ergebnisses vorsichtig sein.
Mit der hier vorgestellten Methode haben wir gezeigt, dass das G/I-Tailing effizient zur Messung der Poly(A)-Schwanzlänge aus dem Drosophila-Nervensystem und S2-Zellen verwendet werden kann. Die Methode ist in Verbindung mit der Kapillarelektrophorese sehr quantitativ. Während Hochdurchsatzanalysen eine globale Poly(A)-Schwanzanalyse ermöglichen, ist die auf der Niedrigdurchsatz-PCR basierende Methode G/I-Tailing immer noch sehr nützlich für Einzeltranskriptanalysen, Pilotexperimente und die Validierung anderer Methoden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl der Methode von den spezifischen Forschungsfragen und -zielen abhängt. Forscher sollten die Methode auswählen, die ihren experimentellen Bedürfnissen und Ressourcen am besten entspricht.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke Grant R01NS116463 an J.K. und der Cellular and Molecular Imaging Core Facility an der University of Nevada, Reno, unterstützt, die von den National Institutes of Health Grant P20GM103650 unterstützt und für die in dieser Studie berichtete Forschung verwendet wurde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Research Product Internation (RPI) | M92020 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert free download demo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyzer | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Research Product Internation (RPI) | D43060 | |
| DNA dye (Gel Loading Dye, Purple (6x) | New England biolabs | B7024S | |
| Drosophila S2 cell line | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider’s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Ehidium bromide | Genesee scientific | 20-276 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Forceps Dumont 5 | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) | P32200 | |
| Poly(A) Tail-Length Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 764551KT | |
| RiboRuler Low Range RNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM1833 | |
| RNA Gel Loading Dye (2x) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | |
| RNA microprep kit | Zymoresearch | R1050 | |
| RNA miniprep kit | Zymoresearch | R1055 | |
| Scissors-Vannas Spring Scissors - 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science tools | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Tablets | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
References
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