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Developmental Biology

चूजे भ्रूण के तंत्रिका ट्यूब बंद होने के दौरान ऊतक के यांत्रिक विकास की निगरानी

Published: November 10, 2023 doi: 10.3791/66117
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Wayne State University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

Summary

इस प्रोटोकॉल को चूजे भ्रूण तंत्रिका के दौरान तंत्रिका प्लेट ऊतक के यांत्रिक गुणों की अनुदैर्ध्य निगरानी के लिए विकसित किया गया था। यह एक ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप और एक ऑन-स्टेज इनक्यूबेशन सिस्टम के एकीकरण पर आधारित है, जो पूर्व ओवो सुसंस्कृत चूजे भ्रूण में तंत्रिका प्लेट ऊतक की लाइव मैकेनिकल इमेजिंग को सक्षम करता है।

Abstract

भ्रूण के विकास के दौरान तंत्रिका ट्यूब बंद (एनटीसी) एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया में विफलता से तंत्रिका ट्यूब दोष हो सकते हैं, जिससे जन्मजात विकृतियां या मृत्यु दर भी हो सकती है। एनटीसी में आनुवंशिक, आणविक और यांत्रिक स्तरों पर तंत्र की एक श्रृंखला शामिल है। जबकि हाल के वर्षों में यांत्रिक विनियमन एक तेजी से आकर्षक विषय बन गया है, यह सीटू में 3 डी भ्रूण ऊतक के यांत्रिक परीक्षण के संचालन के लिए उपयुक्त तकनीक की कमी के कारण काफी हद तक अस्पष्टीकृत है। जवाब में, हमने गैर-संपर्क और गैर-आक्रामक तरीके से चिकन भ्रूण ऊतक के यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह एक मंच पर इनक्यूबेशन प्रणाली के साथ एक confocal Brillouin माइक्रोस्कोप को एकीकृत करके हासिल की है. ऊतक यांत्रिकी की जांच करने के लिए, एक पूर्व सुसंस्कृत भ्रूण एकत्र किया जाता है और पूर्व ovo संस्कृति के लिए एक मंच पर इनक्यूबेटर के लिए स्थानांतरित. इसके साथ ही, तंत्रिका प्लेट ऊतक की यांत्रिक छवियों को विकास के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहित किया जाता है। इस प्रोटोकॉल नमूना तैयार करने, Brillouin माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के कार्यान्वयन, और डेटा के बाद प्रसंस्करण और विश्लेषण के विस्तृत विवरण भी शामिल हैं. इस प्रोटोकॉल का पालन करके, शोधकर्ताओं अनुदैर्ध्य विकास के दौरान भ्रूण ऊतक के यांत्रिक विकास का अध्ययन कर सकते हैं.

Introduction

तंत्रिका ट्यूब दोष (एनटीडी) भ्रूण के विकास के दौरान तंत्रिका ट्यूब बंद (एनटीसी) में विफलताओं के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के गंभीर जन्म दोष हैं1. एनटीडी का एटियलजि जटिल है। अध्ययनों से पता चला है कि एनटीसी में मॉर्फोजेनेटिक प्रक्रियाओं का एक क्रम शामिल है, जिसमें अभिसरण विस्तार, तंत्रिका प्लेट का झुकना (जैसे, शिखर कसना), तंत्रिका गुना को ऊपर उठाना, और अंत में तंत्रिका गुना का आसंजन शामिल है। इन प्रक्रियाओं को कई आणविक और आनुवंशिक तंत्र 2,3 द्वारा विनियमित कर रहे हैं, और इन प्रक्रियाओं में किसी भी खराबी एनटीडी 4,5,6 में परिणाम हो सकता है. बढ़ते सबूत के रूप में पता चलता है कि यांत्रिक संकेत भी एनटीसी 3,7,8,9,10,11 के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और जीन और यांत्रिक संकेत 12,13,14के बीच संबंध पाए गए हैं, यह तंत्रिका के दौरान ऊतक बायोमैकेनिक्स की जांच करने के लिए अनिवार्य हो जाता है।

लेजर पृथक्करण (एलए)15, ऊतक विच्छेदन और विश्राम (टीडीआर)16,17, माइक्रोपिपेट आकांक्षा (एमए)18, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम)-आधारित नैनोइंडेंटेशन19, माइक्रोइंडेंटर्स (एमआई) और माइक्रोप्लेट्स (एमपी)20, ऑप्टिकल/चुंबकीय चिमटी21,22,23 के साथ माइक्रो रियोलॉजी (एमआर) सहित भ्रूण के ऊतकों के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है, और ड्रॉपलेट-आधारित सेंसर24. मौजूदा तरीके उपकोशिकीय से ऊतक तराजू तक के स्थानिक प्रस्तावों पर यांत्रिक गुणों को माप सकते हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश विधियां आक्रामक हैं क्योंकि उन्हें नमूने (जैसे, एमए, एएफएम, एमआई और एमपी), बाहरी सामग्री इंजेक्शन (जैसे, एमआर और बूंद-आधारित सेंसर), या ऊतक विच्छेदन (जैसे, एलए और टीडीआर) के संपर्क की आवश्यकता होती है। नतीजतन, यह सीटू25 में तंत्रिका प्लेट ऊतक के यांत्रिक विकास की निगरानी करने के लिए मौजूदा तरीकों के लिए चुनौतीपूर्ण है. हाल ही में, reverberant ऑप्टिकल जुटना इलास्टोग्राफी उच्च स्थानिक संकल्प26 के साथ गैर संपर्क यांत्रिक मानचित्रण के लिए वादा दिखाया गया है.

कॉन्फोकल ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी एक उभरती हुई ऑप्टिकल साधन है जो उपकोशिकीय संकल्प 27,28,29,30के साथ ऊतक बायोमैकेनिक्स के गैर-संपर्क मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है। ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी सहज ब्रिलौइन प्रकाश प्रकीर्णन के सिद्धांत पर आधारित है, जो घटना लेजर प्रकाश और सामग्री के भीतर थर्मल उतार-चढ़ाव से प्रेरित ध्वनिक लहर के बीच बातचीत है। नतीजतन, प्रकीर्णित प्रकाश एक आवृत्ति बदलाव का अनुभव करता है, जिसे समीकरण31 के बाद ब्रिलौइन शिफ्ट ωआर के रूप में जाना जाता है:

Equation 1 (1)

यहाँ, Equation 2 पदार्थ का अपवर्तनांक है, λ आपतित प्रकाश की तरंगदैर्घ्य है, M' अनुदैर्ध्य मापांक है, ρ द्रव्यमान घनत्व है, और θ आपतित प्रकाश और प्रकीर्णित प्रकाश के बीच का कोण है। एक ही प्रकार की जैविक सामग्री के लिए, अपवर्तक सूचकांक और घनत्व Equation 3 का अनुपात लगभग 28,32,33,34,35,36 है। इस प्रकार, ब्रिलौइन शिफ्ट का उपयोग सीधे शारीरिक प्रक्रियाओं में सापेक्ष यांत्रिक परिवर्तनों का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी की व्यवहार्यता विभिन्न जैविक नमूनों 29,37,38में मान्य किया गया है. हाल ही में, एक जीवित लड़की भ्रूण के समय चूक यांत्रिक इमेजिंग एक मंच पर इनक्यूबेशन प्रणाली39 के साथ एक Brillouin खुर्दबीन के संयोजन से प्रदर्शन किया गया था. यह प्रोटोकॉल नमूना तैयार करने, प्रयोग कार्यान्वयन, और डेटा के बाद प्रसंस्करण और विश्लेषण के विस्तृत विवरण प्रदान करता है. हमें उम्मीद है कि यह प्रयास भ्रूण के विकास और जन्म दोषों में बायोमेकेनिकल विनियमन का अध्ययन करने के लिए गैर-संपर्क ब्रिलौइन प्रौद्योगिकी को व्यापक रूप से अपनाने की सुविधा प्रदान करेगा।

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Protocol

प्रोटोकॉल को वेन स्टेट यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. कैंची और चिमटी को साफ और निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग करें। इसके अलावा, डिस्पोजेबल पिपेट और एक सिरिंज तैयार करें।
  2. 495 एमएल विआयनीकृत पानी में 3.595 ग्राम NaCl जोड़कर एक धोने का माध्यम तैयार करें। फिर, माध्यम में पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (5 यू / धोने माध्यम के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश भरें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. चित्रा 1 के अनुसार संस्कृति व्यंजन तैयार करें, जो समग्र विन्यास को दिखाता है।
    1. फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा तैयार करें, इसे लगभग 17 मिमी × 20 मिमी के आयताकार आकार में काट लें, और चार कोनों को हटा दें। फिल्टर पेपर में एक खोखले केंद्र बनाएं, भ्रूण को सुरक्षित करने के लिए आकार में लगभग 7 मिमी × 10 मिमी (चित्रा 1, बाएं)।
      नोट: भ्रूण का संग्रह चरण 2 में वर्णित है।
    2. एक लचीली फिल्म (यानी, पैराफिन फिल्म) परत के साथ एक वाणिज्यिक उपलब्ध अंगूठी (Φ = 1 इंच, सामग्री की तालिका) संलग्न करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि लचीली फिल्म में एक खोखला केंद्र भी है। फिल्म के साथ इस अंगूठी भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    3. अंत में, तैयार अंगूठी को 35 मिमी पेट्री डिश (चित्रा 1, दाएं) में रखें।
      नोट: फिल्टर पेपर झिल्ली पर फिल्टर पेपर रखकर और भ्रूण को केंद्र खोखले क्षेत्र में छोड़कर निकाले गए भ्रूण को सुरक्षित रखने और पकड़ने के लिए है (जो चरण 2 में विस्तृत होगा)। बाहरी रिंग के आकार को फिट करने के लिए चार कोनों को काट दिया गया था (यदि यह पहले से ही फिट है तो आवश्यक नहीं है)। बेहतर लेजर बीम प्रसार के लिए 35 मिमी ग्लास-बॉटम कल्चर डिश का उपयोग किया जाता है। पकवान में एक आंतरिक कुआं (Φ = 23 मिमी) है, जिसे पूर्व ओवो संस्कृति के लिए एल्ब्यूमेन से भरा जा सकता है। अंगूठी का व्यास आंतरिक कुएं के व्यास से बड़ा होना चाहिए ताकि अच्छी तरह से अंगूठी (चित्रा 1, इनसेट) पर लचीली फिल्म द्वारा कवर किया जा सके। फिल्टर पेपर का आकार प्रतिबंधित नहीं है और इसे चुनी हुई अंगूठी और संस्कृति पकवान के आकार के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पकवान के नीचे एक agarose परत (मोटाई: ~ 1 मिमी) के साथ पूर्व लेपित किया जा सकता है. एक ब्लेड का उपयोग करके परत के केंद्र से अगारोज को हटाकर, लचीली फिल्म के खोखले केंद्र के समान आकार वाला एक कुआं एल्बमेन लोड करने के लिए बनाया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि खोखले फिल्टर पेपर के चार किनारों को भ्रूण के लगाव को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त चौड़ाई (> 5 मिमी) की आवश्यकता होती है।

2. चिकन भ्रूण के निष्कर्षण और पूर्व ओवो संस्कृति

नोट: यह चरण पहले प्रकाशित रिपोर्ट40,41 से संशोधित किया गया है।

  1. पूर्व संस्कृति के बाद, इनक्यूबेटर से अंडे को पुनः प्राप्त और अंडे दफ़्ती ट्रे पर अपनी लंबी धुरी पर जगह है. 70% इथेनॉल के साथ अंडे के छिलके को साफ करें, पूरी सतह को कवर करना सुनिश्चित करें, और फिर इसे 15 मिनट के लिए आराम करने दें।
  2. अंडे को उसकी छोटी धुरी पर पकड़ें और नीचे से फोड़ें। एक साफ 100 मिमी पेट्री डिश पर अंडे खोलें अपनी सामग्री निकालने के लिए, के रूप में चित्रा 2 में सचित्र है. सुनिश्चित करें कि अंडे को पकड़ते और फोड़ते समय उसे घुमाएं नहीं।
  3. एक विंदुक का उपयोग करके, पूर्व ओवो संस्कृति उपयोग के लिए 15 एमएल ट्यूब में पतली एल्बमेन (यानी, तरल एल्बमेन42) के लगभग 10 एमएल को स्थानांतरित और इकट्ठा करें। एकत्रित पतली एल्बमेन (लगभग 0.9 एमएल) के साथ संस्कृति पकवान के केंद्र को अच्छी तरह से भरें, जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है। भरने की प्रक्रिया धीमी होनी चाहिए, कुएं के अंदर किसी भी बुलबुले के गठन से बचना चाहिए। सुनिश्चित करें कि एल्ब्यूमेन के साथ संस्कृति पकवान 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म है।
    नोट: इस पकवान भ्रूण पूर्व ovo संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. धोने के माध्यम से भरा नई संस्कृति व्यंजन Brillouin इमेजिंग (चरण 3 देखें) के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा.
  4. टिशू पेपर का उपयोग करके, धीरे से मोटी एल्बमेन (यानी, चिपचिपा एल्ब्यूमेन) को विटेलिन झिल्ली से एल्ब्यूमेन को सावधानीपूर्वक अलग करके हटा दें, जैसा कि चित्रा 4में दिखाया गया है। विटेलिन झिल्ली के साथ सीधे संपर्क से बचें।
  5. सभी मोटी एल्बमेन को हटाने के बाद, फिल्टर पेपर को ध्यान से विटेलिन झिल्ली से चिपका दें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण के शरीर अक्ष फिल्टर पेपर पर केंद्र आयत की लंबी धुरी के साथ संरेखित करता है. फिल्टर पेपर के आसपास की झिल्ली को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  6. चिमटी का उपयोग करके, धीरे से अलग फिल्टर पेपर को जर्दी से तिरछी दिशा में दूर खींचें। (उलटा खुर्दबीन विन्यास के लिए) अपने पृष्ठीय पक्ष के साथ भ्रूण की स्थिति के लिए फिल्टर कागज उल्टा फ्लिप. ध्यान से एक तिरछा फैशन में धोने माध्यम के साथ 100 मिमी पेट्री डिश में लंबी धुरी के एक तरफ से पूरे फिल्टर पेपर विसर्जित.
  7. एक साफ विंदुक का उपयोग कर फिल्टर पेपर के समानांतर धोने माध्यम छिड़काव द्वारा किसी भी शेष जर्दी दूर धो लें. झिल्ली पर सीधे धोने के माध्यम छिड़काव से बचें.
  8. सभी जर्दी को साफ करने के बाद, धोने के माध्यम से फिल्टर पेपर को ध्यान से हटा दें और किनारों से किसी भी अतिरिक्त माध्यम को अवशोषित करने के लिए टिशू पेपर का उपयोग करें। फिर, संस्कृति पकवान पर भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर रखें, यह सुनिश्चित करना कि भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष नीचे की ओर सामना कर रहे हैं, जैसा कि चित्रा 5में दिखाया गया है। आर्द्रता बनाए रखने के लिए, डिश में एक सिक्त टिशू पेपर रखें।
  9. पूर्व ओवो संस्कृति के लिए मंच पर इनक्यूबेटर के लिए संस्कृति पकवान स्थानांतरण.

3. भ्रूण का ब्रिलौइन माप

  1. संस्कृति व्यंजनों का एक और सेट तैयार करें और उन्हें धोने के माध्यम से भरें। सुनिश्चित करें कि धोने का माध्यम 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म है।
  2. जब भ्रूण वांछित विकास चरण तक पहुँच जाता है, धोने माध्यम से भरा संस्कृति पकवान के लिए भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर हस्तांतरण. ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप के ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    1. Brillouin माप का संचालन करने से पहले, संदर्भ के लिए पूरे भ्रूण की एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि को बचाने के लिए. Brillouin खुर्दबीन के विस्तृत विन्यास पहले30 वर्णित किया गया है और परिणाम अनुभाग (चित्रा 6) में संक्षेप में है.
  3. अंशांकन प्रक्रिया के लिए चरण 4 में उपयोग किया जाएगा जो पानी और मेथनॉल के Brillouin संकेत को मापें।
  4. घटना लेजर पावर और इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD, सामग्री की तालिकादेखें) कैमरा एक्सपोजर समय को कम से कम 10,000 काउंट ब्रिलौइन सिग्नल प्राप्त करने के लिए समायोजित करें। एक गाइड के रूप में उज्ज्वल-क्षेत्र छवि का उपयोग करके, स्कैन रेंज और चरण आकार सेट करें। एक 2 डी अनुवाद चरण का उपयोग भ्रूण स्कैन करके ब्याज के क्षेत्र की एक Brillouin छवि प्राप्त करें.
    नोट: क्षैतिज स्कैनिंग रेंज को उज्ज्वल-क्षेत्र छवि के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है, और ऊर्ध्वाधर (यानी, गहराई) स्कैनिंग रेंज एक त्वरित और मोटे स्कैन से प्राप्त सिग्नल शक्ति के आधार पर निर्धारित की जा सकती है। भ्रूण को किसी भी फोटोडैमेज को रोकने के लिए, घटना शक्ति को 25 मेगावाट तक सीमित करें, और ईएमसीसीडी कैमरे के एक्सपोजर समय को 50 एमएस पर सेट करें। इमेजिंग गुणवत्ता और अधिग्रहण समय को संतुलित करने के लिए क्षैतिज दिशा में 2 माइक्रोन और ऊर्ध्वाधर दिशा में 1 माइक्रोन का एक कदम आकार चुनें।
  5. स्कैन को पूरा करने के बाद, ध्यान से भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर को हटा दें और किसी भी अतिरिक्त धोने के माध्यम को अवशोषित करने के लिए टिशू पेपर का उपयोग करें। फिर, फिल्टर पेपर को ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर में निरंतर संवर्धन के लिए पतली एल्बमेन से भरे कल्चर डिश में वापस रखें।
  6. भ्रूण विकसित होने के रूप में समय चूक Brillouin छवियों पर कब्जा करने के लिए नियमित समय अंतराल (जैसे, 1.5 ज) पर कदम 3.2-3.5 दोहराएँ.
  7. चरण 4 के बाद 2D Brillouin छवि का पुनर्निर्माण करें।

4. ब्रिलौइन छवि पुनर्निर्माण

  1. मुक्त वर्णक्रमीय रेंज (एफएसआर) और स्पेक्ट्रोमीटर30 के पिक्सेल-टू-आवृत्ति रूपांतरण अनुपात (पीआर) की गणना करने के लिए पानी और मेथनॉल के ब्रिलौइन संकेतों का उपयोग करके ब्रिलौइन स्पेक्ट्रोमीटर को कैलिब्रेट करें। एफएसआर और पीआर के कैलिब्रेटेड मूल्यों का उपयोग प्रत्येक पिक्सेल पर भ्रूण के ब्रिलौइन शिफ्ट की गणना करने के लिए किया जाएगा।
    नोट: चित्रा 7 ए ईएमसीसीडी कैमरे द्वारा कब्जा कर लिया गया एक कच्चा ब्रिलौइन स्पेक्ट्रम प्रदर्शित करता है। स्पेक्ट्रम को लंबवत रूप से सारांशित करके और फिर लोरेंत्ज़ियन फिटिंग करके, दो बिंदुओं की चोटी की दूरी Δd प्राप्त की जा सकती है (चित्र 7B)। पानी Δdपानी और मेथनॉल Δdमेथनॉल की चरम दूरी प्राप्त करके, FSR और PR की गणना समीकरणों30: PR = 2· (ωमेथनॉल-ω पानी)/(Δdपानी- Δdमेथनॉल), और FSR = 2·ωपानी + PR·Δdपानी, पानी ωपानी = 6.01 गीगाहर्ट्ज़ और मेथनॉल ωमेथनॉल = 4.49 गीगाहर्ट्ज़ के ज्ञात ब्रिलौइन शिफ्ट के साथ 660 एनएम पर।
  2. नमूने के प्रत्येक पिक्सेल पर Brillouin संकेत की चोटी दूरी प्राप्त करें. कैलिब्रेटेड FSR और PR के आधार पर Brillouin शिफ्ट की गणना करें: ωनमूना = 0.5 (FSR - PR x Δdनमूना)30, जहां ωनमूना नमूने का ब्रिलौइन शिफ्ट है, और Δdनमूना ब्रिलौइन सिग्नल की चरम दूरी है।
  3. सभी पिक्सल के Brillouin शिफ्ट के आधार पर 2D Brillouin छवि का पुनर्निर्माण करें।
    नोट: स्थानीय विश्लेषण करने के लिए, कोई अधिग्रहित ब्रिलौइन छवि से ब्याज के क्षेत्र (जैसे, तंत्रिका प्लेट) का चयन कर सकता है और इसके यांत्रिक गुणों को निर्धारित कर सकता है। एक सामान्य दृष्टिकोण चयनित क्षेत्र की औसत ब्रिलौइन शिफ्ट की गणना करना है।

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Representative Results

चित्रा 6 ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप के योजनाबद्ध से पता चलता है. सिस्टम प्रकाश स्रोत के रूप में 660 एनएम लेजर को नियोजित करता है। किसी भी बैक-परावर्तित प्रकाश को अस्वीकार करने के लिए लेजर हेड के ठीक बाद एक आइसोलेटर रखा जाता है, और लेजर पावर को समायोजित करने के लिए एक तटस्थ घनत्व (एनडी) फिल्टर का उपयोग किया जाता है। लेंस की एक जोड़ी, L1 और L2, क्रमशः f1 = 16 mm और f2 = 100 mm की फोकस लंबाई के साथ, लेजर बीम का विस्तार करने के लिए उपयोग किया जाता है। एक आधा लहर प्लेट (HWP) और एक रैखिक polarizer (Polarizer 1) या तो नमूना या अंशांकन सामग्री (यानी, पानी और मेथनॉल) ध्रुवीकृत बीम फाड़नेवाला (पीबीएस) के बाद पर चमक बीम की शक्ति को समायोजित करने के लिए कार्यरत हैं. नमूने में लेजर ध्यान केंद्रित करने और पिछड़े बिखरे हुए प्रकाश को इकट्ठा करने के लिए, 0.6 के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) और 40 के आवर्धन के साथ एक उद्देश्य लेंस (OBJ2) का उपयोग किया जाता है। घटना प्रकाश और पिछड़े बिखरे हुए प्रकाश एक चौथाई लहर प्लेट (QWP2) का उपयोग कर ध्रुवीकरण समायोजन के बाद एक ही पीबीएस द्वारा अलग कर रहे हैं. इसी तरह, OBJ1 और QWP1 का उपयोग लेजर बीम को अंशांकन सामग्री में मार्गदर्शन करने के लिए किया जाता है। ब्रिलौइन सिग्नल को एकल-मोड फाइबर द्वारा विश्लेषण के लिए ब्रिलौइन स्पेक्ट्रोमीटर43 तक पहुंचाया जाता है। स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर, एक बेलनाकार लेंस (C1) ब्रिलौइन सिग्नल को पहले VIPA (वस्तुतः इमेज्ड चरणबद्ध सरणी) etalon में जोड़ता है। पहले VIPA etalon के आउटपुट को एक अन्य बेलनाकार लेंस (C2) द्वारा फिर से आकार दिया जाता है और गैर-बिखरे हुए लेजर प्रकाश को अस्वीकार करने के लिए मास्क 1 पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। फिर, Brillouin संकेत एक गोलाकार लेंस (SL1) द्वारा एक दूसरे VIPA etalon में युग्मित है, एक और गोलाकार लेंस (SL2) द्वारा reshaped है, और मास्क 2 पर प्रक्षेपित है. परिणामी वर्णक्रमीय पैटर्न तो शोर अस्वीकृति के लिए एक 4 एफ इकाई के माध्यम से चला जाता है और रिकॉर्डिंग के लिए एक EMCCD पर पेश किया है. हमने एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप बॉडी का उपयोग किया ( सामग्री की तालिकादेखें)। आम तौर पर, विभिन्न ब्रांडों के साथ किसी भी माइक्रोस्कोप बॉडी का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि बाहरी प्रकाश किरण देने के लिए एक उपलब्ध पोर्ट हो। ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर तापमान, गैस और वायु प्रवाह नियंत्रण के साथ एक धातु कक्ष है। नमूने की स्थिति 2 डी मोटर चालित चरण के माध्यम से समायोजित की जाती है। एक पूरक धातु-ऑक्साइड अर्धचालक (CMOS) कैमरा का उपयोग उज्ज्वल-क्षेत्र छवि प्राप्त करने के लिए किया जाता है।

चित्रा 8 एक प्रतिनिधि चिकन भ्रूण के समय चूक उज्ज्वल क्षेत्र और Brillouin छवियों से पता चलता है. भ्रूण को ओवो संस्कृति में 29 घंटे के बाद निकाला गया था, और छवियों को 29 घंटे, 30.5 घंटे और 32 घंटे में पूर्व ओवो संस्कृति के साथ लिया गया था, जो क्रमशः 4, 5 और 8 की सोमाइट संख्या से मेल खातीहै। सामान्य तौर पर, भ्रूण को कम से कम 24 घंटे के लिए ऑन-स्टेज इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया जा सकता है। उज्ज्वल-क्षेत्र छवि में लाल रेखा Brillouin इमेजिंग के लिए स्थान इंगित करता है. अधिग्रहित ब्रिलौइन छवियों के साथ, तंत्रिका प्लेट क्षेत्र का चयन किया गया था (चित्रा 8 में काले बिंदीदार रेखा द्वारा हाइलाइट किया गया) और इस क्षेत्र की औसत ब्रिलौइन शिफ्ट की गणना की गई थी। जैसा कि चित्रा 9 में दिखाया गया है, तंत्रिका ट्यूब बंद होने के दौरान ऊतक की औसत ब्रिलौइन शिफ्ट बढ़ जाती है। अनुदैर्ध्य मापांक भी समीकरण (1), जहां = 1.3330 के Equation 3 मूल्य जेब्राफिश भ्रूण45 का उपयोग कर साहित्य से अनुमान लगाया जाता है, मान लीजिए कि मूल्यजैविक ऊतकों 28,33 के समान प्रकार के लिए अपेक्षाकृत स्थिर है के आधार पर गणना की है.

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण के विकास के लिए पूरे संस्कृति पकवान विन्यास के योजनाबद्ध। यह आंकड़ा बाईं ओर भ्रूण को संलग्न करने के लिए एक फिल्टर पेपर और दाईं ओर एक लचीली फिल्म परत के साथ जुड़ी अंगूठी के साथ 35 मिमी संस्कृति पकवान दिखाता है। क्रॉस-सेक्शन योजनाबद्ध भी प्रदान किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पकवान में अंडे निकालने के लिए एक साफ 100 मिमी पेट्री डिश के ऊपर अंडे के छिलके को खोलने की प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: पतली एल्बमेन के साथ संस्कृति पकवान के केंद्र को अच्छी तरह से भरना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: टिशू पेपर के एक टुकड़े का उपयोग करके, लाल तीर द्वारा इंगित दिशा में मोटी एल्बमेन को खींचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: फिल्टर पेपर के ऊपर की तरफ भ्रूण के साथ संस्कृति पकवान में फिल्टर पेपर की नियुक्ति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: ब्रिलौइन माइक्रोस्कोप का योजनाबद्ध। लाल तीर लेजर बीम के प्रकाश पथ को इंगित करता है, और नारंगी तीर ब्रिलौइन सिग्नल के प्रकाश पथ को इंगित करता है। L1, L2, SL1-SL4: गोलाकार लेंस; एस एफ: स्थानिक फिल्टर; C1, C2: बेलनाकार लेंस, HWP: अर्ध-तरंग प्लेट; पीबीएस: ध्रुवीकृत बीम फाड़नेवाला; QWP1, QWP2: क्वार्टर-वेव प्लेट; OBJ1, OBJ2: ऑब्जेक्टिव लेंस; एल.पी.: लेंस जोड़ी। वीआईपीए: वस्तुतः चरणबद्ध सरणी को चित्रित किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिनिधि ब्रिलौइन सिग्नल। (ए) ईएमसीसीडी द्वारा कब्जा कर लिया गया एक प्रतिनिधि ब्रिलौइन स्पेक्ट्रम। (बी) एक लंबवत अभिव्यक्त ब्रिलौइन स्पेक्ट्रम और इसी लोरेंत्ज़ियन फिटिंग परिणाम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: उज्ज्वल क्षेत्र छवियों और 4, 5 और 8 सोमाइट्स के साथ 29 घंटे, 30.5 घंटे और 32 घंटे में भ्रूण की इसी ब्रिलौइन क्रॉस-सेक्शन छवियां। लाल ठोस रेखाएं ब्रिलौइन इमेजिंग के लिए स्थान का संकेत देती हैं, और काली बिंदीदार रेखा तंत्रिका प्लेट क्षेत्र को इंगित करती है। 32 घंटे (8 सोमाइट्स) छवि में ग्रे क्षेत्र कमजोर ब्रिलौइन सिग्नल के कारण वक्र फिटिंग की एक कलाकृति है और औसत बदलाव की गणना करते समय इसे बाहर रखा गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: ब्रिलौइन शिफ्ट और सोमाइट संख्या और इनक्यूबेशन समय के खिलाफ तंत्रिका प्लेट के अनुमानित अनुदैर्ध्य मापक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

भ्रूण का प्रारंभिक विकास बाहरी गड़बड़ी से आसानी से प्रभावित हो सकता है। इसलिए, नमूना निष्कर्षण और हस्तांतरण के दौरान अत्यधिक सावधानी की आवश्यकता होती है। एक संभावित मुद्दा फिल्टर पेपर से भ्रूण की टुकड़ी है, जो विटेलिन झिल्ली के सिकुड़ने का कारण बन सकता है और इसके परिणामस्वरूप ब्रिलौइन इमेजिंग में तंत्रिका प्लेट की झुकी हुई कलाकृति हो सकती है। इसके अलावा, यह सिकुड़न भ्रूण के विकास को रोक सकती है। टुकड़ी को रोकने के लिए कई महत्वपूर्ण कदमों पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, चरण 2.4 में, झिल्ली की सतह से एल्ब्यूमेन को पूरी तरह से हटाने को सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। किसी भी शेष albumen फिल्टर कागज46,47 के लिए झिल्ली के उचित आसंजन बाधित कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, धोने की प्रक्रिया के दौरान, झिल्ली के समानांतर दिशा में धोने के माध्यम को स्प्रे करना महत्वपूर्ण है। तरल प्रवाह के साथ सीधे झिल्ली को मारने से टुकड़ी हो सकती है या झिल्ली को फाड़ भी सकता है। इसके अलावा, पूरी धोने की प्रक्रिया को थोड़े समय (जैसे, <3 मिनट) के भीतर पूरा किया जाना चाहिए, क्योंकि लंबे समय तक विसर्जन से फिल्टर पेपर से भ्रूण की टुकड़ी भी हो सकती है।

Brillouin माप आयोजित करने से पहले, यह धोने माध्यम के साथ एक डिश के लिए भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है. ऐसा इसलिए है क्योंकि एल्ब्यूमेन की ब्रिलौइन शिफ्ट तंत्रिका प्लेट के ऊतकों के बहुत करीब है, जिससे खराब छवि विपरीत होती है। ब्रिलौइन इमेजिंग बिंदु स्कैनिंग द्वारा प्राप्त की जाती है, जो समय लेने वाली हो सकती है, खासकर जब कई बिंदुओं से निपटती है। इस प्रोटोकॉल में, स्कैनिंग क्षेत्र क्षैतिज रूप से लगभग 400 माइक्रोन और लंबवत 100 माइक्रोन से कम है। भ्रूण के विकास में गड़बड़ी से बचने के लिए, कुल अधिग्रहण समय 30 मिनट के भीतर तक सीमित था। यह क्षैतिज रूप से 2 माइक्रोन और लंबवत 1 माइक्रोन के चरण आकार का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। यदि कोई केवल एक विशिष्ट क्षेत्र की औसत ब्रिलौइन शिफ्ट में रुचि रखता है, तो एक त्वरित और मोटे स्कैन (उदाहरण के लिए, क्षैतिज और लंबवत दोनों 4 माइक्रोन के चरण आकार के साथ) लागू किया जा सकता है, जिसमें 5 मिनट से भी कम समय लगेगा और भ्रूण के विकास पर नकारात्मक प्रभाव को कम कर सकता है।

ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी भ्रूण के विकास के बायोमैकेनिक्स की जांच के लिए एक वास्तविक समय और गैर-इनवेसिव इमेजिंग दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस विधि की एक सीमा इसकी पैठ की गहराई में निहित है, जो भ्रूण के विकास के चरण के आधार पर लगभग 100-200 माइक्रोन है। ईएमसीसीडी की लेजर शक्ति और/या एक्सपोजर समय बढ़ाने से आंशिक रूप से इस मुद्दे का समाधान हो सकता है, यह संभावित फोटोटॉक्सिसिटी और/या लंबे अधिग्रहण समय की कीमत पर आता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के अनुकूली प्रकाशिकी के रूप में मौजूदा ऑप्टिकल प्रौद्योगिकियों, संभावित पैठ गहराई48 में सुधार करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

अंत में, हमने ब्रिलौइन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके जीवित चिकन भ्रूण के यांत्रिक गुणों की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है। यह गैर-संपर्क विधि वर्तमान अपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा कर सकती है और भ्रूण के विकास में बायोमैकेनिक्स का अध्ययन करने के लिए अन्य मौजूदा उपकरणों का पूरक है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

यह काम यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (K25HD097288, R21HD112663) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm Petri dish  Fisherbrand FB0875713
2D motorized stage  Prior Scientific H117E2
35 mm Petri dish World Precision Instruments FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator N/A N/A This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs University of Connecticut N/A
CMOS camera Thorlabs CS2100M-USB
EMCCD camera Andor iXon
Ethanol Decon Laboratories, Inc. #2701
Filter paper Whatman 1004-070
Incubator for in ovo culture GQF Manufacturing Company Inc.  GQF 1502 
Ring Thorlabs SM1RR
Microscope body Olympus IX73
NaCl Sigma-Aldrich S9888
On-stage incubator Oko labs OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm Bemis PM-996
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070-063
Pipettes Fisherbrand 13-711-6M
Scissors Artman instruments N/A 3pc Micro Scissors 5
Syringe BD 305482
Tissue paper Kimwipes N/A
Tube Corning 430052
Tweezers DR Instruments N/A Microdissection Forceps Set 

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 201
चूजे भ्रूण के तंत्रिका ट्यूब बंद होने के दौरान ऊतक के यांत्रिक विकास की निगरानी
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Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).

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