Kwantificering van elastische eigenschappen van omgevingsbiofilms met behulp van optische coherentie-elastografie

Summary

Dit artikel belicht de werkzaamheid van de optische coherentie-elastografie (OCE)-techniek bij het snel en niet-destructief karakteriseren van elastische eigenschappen van biofilm. We verduidelijken kritische OCE-implementatieprocedures voor nauwkeurige metingen en presenteren Young’s moduluswaarden voor twee granulaire biofilms.

Abstract

Biofilms zijn complexe biomaterialen die bestaan uit een goed georganiseerd netwerk van microbiële cellen die zijn ingekapseld in zelfgeproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS). Dit artikel geeft een gedetailleerd overzicht van de implementatie van optische coherentie-elastografie (OCE)-metingen op maat voor de elastische karakterisering van biofilms. OCE is een niet-destructieve optische techniek die het mogelijk maakt om de microstructuur, morfologie en visco-elastische eigenschappen van gedeeltelijk transparante zachte materialen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie lokaal in kaart te brengen. We bieden een uitgebreide gids met details over de essentiële procedures voor de juiste implementatie van deze techniek, samen met een methodologie om de bulk Young’s modulus van granulaire biofilms te schatten op basis van de verzamelde metingen. Deze bestaan uit de systeemconfiguratie, data-acquisitie en nabewerking. In de discussie verdiepen we ons in de onderliggende fysica van de sensoren die in OCE worden gebruikt en verkennen we de fundamentele beperkingen met betrekking tot de ruimtelijke en temporele schalen van OCE-metingen. We sluiten af met mogelijke toekomstige richtingen voor het bevorderen van de OCE-techniek om elastische metingen van omgevingsbiofilms mogelijk te maken.

Introduction

Bij afvalwaterzuivering en terugwinning van watervoorraden worden steeds vaker nuttige biofilms in aangehechte groeireactoren gebruikt om microben in staat te stellen ongewenste verontreinigende stoffen, zoals organisch materiaal, stikstof en fosfaat, om te zetten in gestabiliseerde vormen die gemakkelijk uit het water kunnen worden verwijderd^. In deze systemen hangt de emergente functie van de biofilm, namelijk biochemische transformaties, nauw samen met de diversiteit van de microben die erin verblijven en de voedingsstoffen die deze microben ontvangen². Dienovereenkomstig kan de voortdurende groei van biofilm een uitdaging vormen voor het handhaven van een consistente reactorfunctionaliteit, omdat de nieuwe biofilmgroei de algehele metabolische processen, massaoverdrachtskenmerken en samenstelling van de gemeenschap van de biofilm kan veranderen. Het zoveel mogelijk stabiliseren van de biofilmomgeving kan bescherming bieden tegen dergelijke veranderingen³. Dit omvat het zorgen voor een consistente stroom van voedingsstoffen en het stabiel houden van de structuur van de biofilm met een constante dikte⁴. Door de stijfheid en fysieke structuur van de biofilm te monitoren, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in de algehele gezondheid en het functioneren van de biofilm.

Biofilms vertonen visco-elastische eigenschappen ^5,6,7. Deze visco-elastische aard resulteert in een combinatie van een onmiddellijke en langzame, tijdsafhankelijke vervorming als reactie op externe mechanische krachten. Een uniek aspect van biofilms is dat ze, wanneer ze worden blootgesteld aan substantiële vervorming, reageren als stroperige vloeistoffen. Omgekeerd is hun respons bij lichte vervorming vergelijkbaar met vaste stoffen⁵. Bovendien is er binnen dit kleine vervormingsgebied een vervormingsbereik waaronder biofilms een lineaire kracht-verplaatsingsrelatie vertonen ^5,6,7. Vervormingen binnen dit lineaire bereik zijn optimaal voor het beoordelen van de mechanische eigenschappen van biofilm, omdat deze reproduceerbare metingen opleveren. Verschillende technieken kunnen de elastische respons binnen dit bereik kwantificeren. Optische coherentie-elastografie (OCE) is een opkomende techniek die wordt aangepast voor het analyseren van biofilms in dit lineaire bereik (spanningen in de orde van grootte van 10-4-10-5)^8,9.

De meest gevestigde toepassing van OCE tot nu toe is op biomedisch gebied, waar de techniek is toegepast om biologische weefsels te karakteriseren die alleen oppervlakkige optische toegang nodig hebben. Li et al. gebruikten bijvoorbeeld OCE om de elastische eigenschappen van huidweefsel te karakteriseren¹⁰. Andere auteurs karakteriseerden de anisotrope elastische eigenschappen van varkens- en menselijke hoornvliesweefsels en hoe ze worden beïnvloed door intraoculaire druk 11,12,13,14,15,16. Enkele voordelen van de OCE-methode voor het bestuderen van biofilms zijn dat deze niet-destructief is en een ruimtelijke resolutie op mesoschaal biedt, dat er geen monstervoorbereiding nodig is en dat de methode zelf snel is; Het biedt co-geregistreerde metingen van fysieke structuur en elastische eigenschappen (bijv. porositeit, oppervlakteruwheid en morfologie)8,9,17,18.

De OCE-methode meet de lokale verplaatsing van voortplantende elastische golven in een monster met behulp van fasegevoelige optische coherentietomografie (OCT). OCT is een optische interferometer met lage coherentie die lokale veranderingen in de verplaatsing van het monster omzet in een intensiteitsverandering die wordt geregistreerd met een optische spectrometer. De OCT-techniek is ook gebruikt in biofilmonderzoek voor de karakterisering van de structuur op mesoschaal, de porositeitsverdeling in drie dimensies en de vervorming van de biofilm 17,19,20,21. Bovendien schatten Picioreanu et al. de mechanische eigenschappen van biofilm met behulp van vloeistof-structuurinteractie inverse modellering van OCT-dwarsdoorsnedevervormingsbeelden²².

Aan de andere kant leveren OCE-metingen, in combinatie met inverse elastodynamische golfmodellering, de golfsnelheid van elastische golven in het monster op, wat de karakterisering van de elastische en visco-elastische eigenschappen van het monster mogelijk maakt. Onze groep paste de OCE-techniek aan voor kwantitatieve meting van biofilmelastische en visco-elastische eigenschappen ^8,9,18 en valideerde de techniek tegen afschuifreometriemetingen in agarosegelplaatmonsters¹⁸. De OCE-benadering biedt nauwkeurige en betrouwbare schattingen van de biofilmeigenschappen, aangezien de gemeten elastische golfsnelheid gecorreleerd is met de elastische eigenschappen van het monster. Bovendien kan het ruimtelijke verval van de elastische golfamplitude direct worden gecorreleerd met de visco-elastische eigenschappen als gevolg van viskeuze effecten in het materiaal. We hebben OCE-metingen gerapporteerd van visco-elastische eigenschappen van bacteriële biofilms in gemengde cultuur gekweekt op coupons in een roterende ringvormige reactor (RAR) en granulaire biofilms met complexe geometrieën met behulp van elastodynamische golfmodellen¹⁸.

De OCE-techniek is ook een krachtig alternatief voor traditionele reometrie¹⁸die wordt gebruikt voor visco-elastische karakterisering. Reometriemethoden zijn het meest geschikt voor monsters met vlakke geometrie. Als zodanig kunnen granulaire biofilms, die willekeurige vormen en oppervlaktemorfologieën hebben, niet nauwkeurig worden gekarakteriseerd op een reometer ^8,23. Bovendien kunnen reometriemethoden, in tegenstelling tot OCE, een uitdaging zijn om aan te passen voor real-time metingen, bijvoorbeeld tijdens biofilmgroei in flowcellen^24,25.

In dit artikel laten we zien dat OCE-metingen van de frequentie-onafhankelijke golfsnelheid van oppervlaktegolven kunnen worden gebruikt om de elastische eigenschappen van biofilm te karakteriseren zonder dat er ingewikkelde modellen nodig zijn. Deze ontwikkeling zal de OCE-benadering toegankelijker maken voor de bredere biofilmgemeenschap voor het bestuderen van de mechanische eigenschappen van biofilm.

Figuur 1 toont een schematische weergave van het LGO-systeem dat in dit onderzoek is gebruikt. Het systeem bevat verschillende instrumenten, waaronder een commercieel spectraal-domein fasegevoelig OCT-systeem, een vertragingsgenerator, een functiegenerator en een piëzo-elektrische transducer. Het OCT-systeem werkt volgens het principe van interferometrie door gebruik te maken van een breedbandlichtbron met een middengolflengte van 930 nm. De verzamelde lichtintensiteit, die gecorreleerd is met ingewikkelde structurele details in het monster, wordt geanalyseerd in de nabewerkingseenheid en vervolgens omgezet in een dwarsdoorsnedebeeld van het monster – gewoonlijk een OCT-beeld genoemd. De OCT-beeldvormingsdiepte hangt af van de ernst van de optische verstrooiing in het monster die het gevolg is van lokale variatie in de brekingsindex en is beperkt tot 1-3 mm in biologische weefsels en biofilms. Aangezien de optische fase in het monster en de interferentie-intensiteit worden gemoduleerd door beweging, kan de OCT worden gebruikt om de lokale verplaatsing van het monster te detecteren. We maken gebruik van de verplaatsingsgevoeligheid van de OCT in de OCE-methode om het steady-state verplaatsingsveld van elastische golven in het monster te volgen. In het bijzonder geeft de functiegenerator een sinusvormige spanning af om de piëzo-elektrische transducer aan te drijven. De transducer rekt op zijn beurt uit en trekt samen met een oscillerende tijdgeschiedenis. De oscillerende verplaatsing van de transducer geeft een sinusvormige kracht op het monsteroppervlak door een 3D-geprinte wigpunt aan de top van de transducer, wat leidt tot het genereren van harmonische elastische golven in het monster. De wigpunt maakt licht contact met het monster, zodat het monster intact blijft nadat de actuator van het monsteroppervlak is teruggetrokken. Om de lokale verplaatsing in het monster vast te leggen, worden bij elke pixel in het monster aangrenzende dieptescans gemaakt, gescheiden door een vaste tijdsvertraging. Het optische faseverschil tussen opeenvolgende scans op elk pixelpunt is evenredig met de lokale verticale verplaatsing op hetzelfde punt. Synchronisatie tussen de verplaatsing van de transducer en de scanoptiek in het OCT-systeem wordt bereikt door een triggerpuls die afkomstig is van de functiegenerator en wordt vertraagd in de vertragingsgenerator. Deze synchronisatiestap vergemakkelijkt het verkrijgen van consistente dwarsdoorsnedebeelden van de lokale optische faseverdeling in het monster. Deze beelden zijn recht evenredig met de lokale verticale harmonische verplaatsing in het monster en staan bekend als het OCE-beeld. OCE-beelden worden verkregen bij verschillende activeringsfrequenties van de transducer om de elastische golflengte en golfsnelheid als functie van de frequentie te verkrijgen. De gemeten golfsnelheden worden geanalyseerd met een elastodynamisch model om de elastische eigenschappen van het monster te bepalen.

Protocol

1. Installatie van het systeem Verzamel de systeemcomponenten, waaronder het commerciële OCT-systeem (basiseenheid, standaard, beeldvormingskop en computer), golfvormgenerator, transducer, vertragings-/pulsgenerator, een schakelaar met BNC-aansluitingen, BNC-kabels en -adapters, optische palen en klemmen. Sluit het synchronisatiesignaal van de functiegenerator aan op een schakelaar. Sluit de andere poort van de switch aan op de vertragingsgenerator. Sluit de uitgang van de …

Representative Results

In dit onderzoek hebben we gebruik gemaakt van granulaire biofilms (ook bekend als granulair slib), die commercieel werden verkregen. Korrels zijn bolvormige biofilms die worden gevormd door zelfaggregatie, wat betekent dat ze geen drager of oppervlak nodig hebben om op te groeien26. Figuur 3A toont een representatief cross-sectioneel OCT-beeld dat ontstaat door de ruimtelijke variatie van de lokale brekingsindex in een granulaire biofilm. De biofilm…

Discussion

De haalbare beelddiepte in het OCT-systeem wordt bepaald door de mate van lichtpenetratie van de lichtbron, die afhankelijk is van de golflengte van de bron. Bovendien bepaalt de golflengte de axiale resolutie. Langere golflengten kunnen dieper in het monster doordringen, maar dit gaat ten koste van een verminderde axiale resolutie in vergelijking met kortere golflengten. Transversale resolutie daarentegen is afhankelijk van zowel de numerieke apertuur van het systeem als de golflengte, waarbij kortere golflengten een ho…

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5