Summary
이 논문은 생물막 탄성 특성을 빠르고 비파괴적으로 특성화하는 광학 간섭 엘라스토그래피(OCE) 기술의 효능을 강조합니다. 정확한 측정을 위한 중요한 OCE 구현 절차를 설명하고 두 개의 입상 생물막에 대한 영률 값을 제시합니다.
Abstract
생물막은 자체 생산된 세포외 고분자 물질(EPS)에 둘러싸인 잘 조직된 미생물 세포 네트워크로 구성된 복잡한 생체 재료입니다. 이 논문은 생물막의 탄성 특성화를 위해 맞춤화된 OCE(Optical Coherence Elastography) 측정의 구현에 대한 자세한 설명을 제공합니다. OCE는 높은 공간 및 시간 분해능으로 부분적으로 투명한 연질 재료의 미세 구조, 형태 및 점탄성 특성의 로컬 매핑을 가능하게 하는 비파괴 광학 기술입니다. 우리는 이 기술의 정확한 실시를 위한 근본적인 절차를 선발하는 포괄적인 가이드를, 모은 측정에서 과립상 biofilms의 부피 영의 계수를 추정하는 방법론과 함께 제공합니다. 이는 시스템 설정, 데이터 수집 및 후처리로 구성됩니다. 토론에서는 OCE에 사용되는 센서의 기본 물리학을 탐구하고 OCE 측정의 공간 및 시간 규모와 관련된 근본적인 한계를 탐구합니다. 우리는 환경 생물막의 탄성 측정을 용이하게 하기 위해 OCE 기술을 발전시키기 위한 잠재적인 미래 방향으로 결론을 내립니다.
Introduction
폐수 처리 및 수자원 회수에서, 부착된 성장 반응기의 유익한 생물막은 미생물이 유기물, 질소 및 인산염과 같은 바람직하지 않은 오염 물질을 물에서 쉽게 제거할 수 있는 안정화된 형태로 전환할 수 있도록 하기 위해 점점 더 많이 사용되고 있다1. 이러한 시스템에서 생물막의 창발적 기능, 즉 생화학적 변형은 생물막에 거주하는 미생물의 다양성 및 이러한 미생물이 받는 영양분과 밀접하게 관련되어 있습니다2. 그러므로, 진행중인 biofilm 성장은 새로운 biofilm 성장이 biofilm의 전반적인 변화 과정, 질량 이동 특성 및 지역 사회 구성을 바꾸기 좋을지도 모르기 때문에 일관된 반응기 기능 유지에 도전을 제기할 수 있습니다. 생물막 환경을 최대한 안정화하면 이러한 변화로부터 보호할 수 있습니다3. 여기에는 영양소의 일관된 흐름을 보장하고 생물막의 구조를 일정한 두께로 안정적으로 유지하는 것이 포함됩니다4. 생물막의 뻣뻣함 및 육체적인 구조를 감시하는 것은 연구원이 biofilm의 전반적인 건강 그리고 기능에 통찰력을 얻는 것을 가능하게 할 것입니다.
생물막은 점탄성 특성 5,6,7을 나타냅니다. 이러한 점탄성 특성은 외부 기계적 힘에 대한 반응으로 순간적이고 느린 시간 의존적 변형의 조합을 초래합니다. biofilms의 1개의 유일한 양상은, 실질적 개악을 복종될 때, 점성 액체 같이 반응한다 입니다. 반대로, 경미한 변형을 받았을 때, 그들의 반응은 고체와 비슷하다5. 또한, 이 작은 변형 영역 내에는 생물막이 선형 힘-변위 관계 5,6,7을 나타내는 변형 범위가 있습니다. 이 선형 범위 내의 변형은 재현 가능한 측정을 제공하기 때문에 생물막의 기계적 특성을 평가하는 데 최적입니다. 여러 기법이 이 범위 내에서 탄성 응답을 정량화할 수 있습니다. 광학 간섭 엘라스토그래피(OCE)는 이 선형 범위(10-4-10-5 정도의 변형)8,9에서 생물막을 분석하기 위해 채택되고 있는 새로운 기술입니다.
지금까지 OCE의 가장 확립된 응용 분야는 생물 의학 분야로, 이 기술은 표면적인 광학 액세스만 필요한 생물학적 조직을 특성화하는 데 적용되었습니다. 예를 들어, Li et al.은 피부 조직(10)의 탄성 특성을 특성화하기 위해 OCE를 사용하였다. 다른 저자들은 돼지와 인간 각막 조직의 이방성 탄성 특성과 안압 11,12,13,14,15,16에 의해 어떻게 영향을 받는지를 특성화했습니다. 생물막 연구를 위한 OCE 방법의 몇 가지 장점은 비파괴적이고 중간 규모의 공간 분해능을 제공하고 샘플 준비가 필요하지 않으며 방법 자체가 빠르다는 것입니다. 물리적 구조 및 탄성 특성(예: 다공성, 표면 거칠기 및 형태)8,9,17,18에 대한 공동 등록 측정을 제공합니다.
OCE 방법은 위상 민감 광간섭 단층 촬영(OCT)을 사용하여 표본에서 전파되는 탄성파의 국소 변위를 측정합니다. OCT는 시료 변위의 국부적 변화를 광학 분광계로 기록되는 강도 변화로 변환하는 저간섭성 광학 간섭계입니다. OCT 기술은 또한 중간 규모 구조, 3차원의 다공성 분포 및 생물막 변형 17,19,20,21의 특성화를 위한 생물막 연구에 활용되었습니다. 또한, Picioreanu et al.은 OCT 단면 변형 이미지의 유체-구조 상호 작용 역 모델링을 사용하여 생물막 기계적 특성을 추정했습니다22.
반면에 역탄성파 모델링과 결합된 OCE 측정은 샘플에서 탄성파의 파동 속도를 산출하여 샘플의 탄성 및 점탄성 특성을 특성화할 수 있습니다. 우리 그룹은 생물막 탄성 및 점탄성 특성 8,9,18의 정량적 측정을 위해 OCE 기법을 적용하고 아가로스 겔 플레이트 샘플18의 전단 유변 물성 측정 측정에 대해 이 기법을 검증했습니다. OCE 접근법은 측정된 탄성파 속도가 샘플의 탄성 특성과 상관 관계가 있기 때문에 생물막 특성에 대한 정확하고 신뢰할 수 있는 추정치를 제공합니다. 또한, 탄성파 진폭의 공간적 감쇠는 재료의 점성 효과로 인한 점탄성 특성과 직접적인 상관 관계가 있을 수 있습니다. 우리는 회전하는 환형 반응기(RAR)에서 쿠폰으로 성장한 혼합 배양 박테리아 생물막의 점탄성 특성과 탄성 파동 모델18을 사용하여 복잡한 형상을 가진 입상 생물막의 점탄성 특성에 대한 OCE 측정을 보고했습니다.
OCE 기법은 점탄성 특성 분석에 사용되는 기존 유변 물성 분석법18에 대한 강력한 대안이기도 합니다. 유변 물성 측정 방법은 평면 형상을 가진 시료에 가장 적합합니다. 이와 같이, 임의의 모양과 표면 형태를 갖는 입상 생물막은 레오미터 8,23에서 정확하게 특성화될 수 없습니다. 또한, OCE와 달리, 유변 물성 측정 방법은 예를 들어, 플로우 셀(24,25)에서 생물막 성장 동안에 실시간 측정에 적응하기 어려울 수 있습니다.
이 논문에서는 표면파의 주파수 독립적 파동 속도에 대한 OCE 측정을 사용하여 복잡한 모델 없이도 생물막 탄성 특성을 특성화할 수 있음을 보여줍니다. 이 개발은 생물막 기계적 특성을 연구하기 위해 더 넓은 생물막 커뮤니티에 OCE 접근 방식을 더 쉽게 접근할 수 있도록 할 것입니다.
그림 1 은 이 연구에 사용된 OCT 시스템의 개략도를 보여줍니다. 이 시스템에는 상용 스펙트럼 영역 위상 감지 OCT 시스템, 지연 발생기, 함수 발생기 및 압전 변환기를 포함한 여러 계측기가 통합되어 있습니다. OCT 시스템은 중심 파장이 930nm인 광대역 광원을 사용하여 간섭계의 원리에 따라 작동합니다. 샘플의 복잡한 구조적 세부 사항과 상관 관계가 있는 수집된 광도는 후처리 장치에서 분석된 다음 샘플의 단면 이미지(일반적으로 OCT 이미지라고 함)로 변환됩니다. OCT 이미징 깊이는 굴절률의 국부적 변화에서 비롯된 샘플의 광학 산란의 심각도에 따라 달라지며 생체 조직 및 생물막에서 1-3mm로 제한됩니다. 시료의 광학 위상과 간섭 강도는 움직임에 의해 변조되기 때문에 OCT를 사용하여 국소 시료 변위를 감지할 수 있습니다. OCE 분석법에서 OCT의 변위 감도를 활용하여 샘플에서 탄성파의 정상 상태 변위 필드를 추적합니다. 구체적으로, 함수 발생기는 정현파 전압을 출력하여 압전 변환기를 구동합니다. 변환기는 차례로 진동 시간 기록과 함께 늘어나고 수축합니다. 변환기의 진동 변위는 변환기의 정점에 있는 3D 프린팅 쐐기 팁을 통해 샘플 표면에 정현파를 전달하여 샘플에 고조파 탄성파를 생성합니다. 쐐기 팁은 시료와 가볍게 접촉하여 액추에이터를 시료 표면에서 후퇴시킨 후에도 시료가 손상되지 않은 상태로 유지됩니다. 샘플의 국부 변위를 기록하기 위해 고정된 시간 지연으로 분리된 인접 깊이 스캔이 샘플의 각 픽셀에서 수집됩니다. 각 픽셀 포인트에서 연속된 스캔 간의 광학 위상차는 동일한 포인트의 국부 수직 변위에 비례합니다. 트랜스듀서의 변위와 OCT 시스템의 스캐닝 광학 장치 간의 동기화는 함수 발생기에서 발생하고 지연 발생기에서 지연되는 트리거 펄스를 통해 이루어집니다. 이 동기화 단계는 샘플의 국소 광학 위상 분포에 대한 일관된 단면 이미지의 획득을 용이하게 합니다. 이러한 이미지는 샘플의 국소 수직 고조파 변위에 정비례하며 OCE 이미지로 알려져 있습니다. OCE 이미지는 주파수의 함수로 탄성 파장과 파속을 얻기 위해 서로 다른 변환기 작동 주파수에서 획득됩니다. 측정된 파동은 탄성역학 모델로 분석되어 샘플의 탄성 특성을 결정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 시스템 설치
- 상용 OCT 시스템(베이스 유닛, 스탠드, 이미징 헤드 및 컴퓨터), 파형 발생기, 변환기, 지연/펄스 발생기, BNC 연결 스위치, BNC 케이블 및 어댑터, 광 포스트 및 클램프를 포함하는 시스템 구성 요소를 수집합니다.
- 함수 발생기의 동기 신호를 스위치에 연결합니다. 스위치의 다른 포트를 지연 발생기에 연결합니다.
- 함수 발생기의 출력을 변환기 리드에 연결합니다.
- 지연 발생기의 출력을 OCT 베이스 유닛 뒷면의 트리거 채널에 연결합니다. 지연 발생기의 출력 신호는 OCT 시스템에서 스캐닝 광학 장치의 동작을 시작하는 트리거 펄스입니다.
- 시스템 구성 요소(OCT 기본 장치, 컴퓨터, 함수 발생기 및 지연 발생기)를 켜고 OCT 소프트웨어를 시작합니다.
- 트랜지스터-트랜지스터 로직 트리거 신호를 OCT 베이스 유닛으로 보내도록 지연 발생기를 구성합니다. 트리거 신호 요구 사항은 OCT 시스템 설명서를 참조하십시오.
- 변환기를 OCT 렌즈 아래에 놓습니다. 변환기에는 탄성파의 라인 소스 역할을 하는 끝 부분에 3D 프린팅된 쐐기 팁이 붙어 있습니다.
2. 이미지 취득
- OCT 소프트웨어에서 도플러 수집 모드를 선택하고 외부 트리거를 활성화합니다.
- 샘플 홀더의 렌즈 아래에 과립 생물막을 놓고 번역 단계를 사용하여 변환기 끝 쪽으로 이동합니다. 변환기가 샘플 표면과 부드럽게 접촉하는지 확인하십시오.amp 그림 2와 같이. 우리는 공칭 직경(4.3mm 및 3.3mm)이 다른 두 개의 입상 생물막(입상 슬러지라고도 함)을 사용했습니다. 이 선택은 그것의 기계적 성질에 대한 biofilm 크기의 충격을 조사하기 위하여 만들어졌습니다. 이것들은 상업적으로 입수된 것들이었다.
참고: 이 연구에 사용된 샘플 홀더는 여러 반구형 움푹 들어간 곳이 있는 3D 프린팅 플라스틱 판으로 구성됩니다. 이 홀더는 기본 조건에서 측정을 허용하지 않습니다. 따라서 시료가 건조되는 것을 방지하기 위해 측정 중에 자연 환경의 물을 도입했습니다. - Sample Monitor 창에서 Start and Endpoints of the Line of Interest (wave propagation path)를 클릭하여 스캔 영역을 지정합니다. 변환기 팁을 기준으로 이 선을 중앙에 놓고 팁 가장자리에 수직이 되도록 합니다.
- 스캔 영역을 따라 픽셀 수와 샘플의 깊이를 지정하고 기록할 B-스캔(2D 단면 이미지)의 수를 늘려 OCE 이미지의 신호 대 노이즈 비율을 개선합니다. 제시된 결과는 스캐닝 경로를 따라 1523픽셀, 깊이를 따라 1024픽셀을 사용하여 얻은 것입니다. 총 50개의 B-스캔이 촬영되었습니다.
- 스캔 버튼을 클릭하고 스위치를 켭니다. OCT 및 OCE 이미지가 화면에 나타나야 합니다. 트리거 시간 초과 시간 및 스캔 준비 시간 내에 스위치를 활성화합니다.
- 기준 강도가 최적 범위 내에 있는지 확인하고 OCT 현미경 대물렌즈의 초점 영역 내에 샘플을 배치합니다. 초점이 제대로 맞춰진 샘플은 위쪽 가장자리가 이미지 위쪽에 가까워야 합니다.
- 디스플레이 도구 모음에서 왼쪽 색상 막대의 높은 값을 늘리고 오른쪽 색상 막대의 낮은 값을 줄여 OCE 이미지의 위상 윤곽선을 조정합니다. 이렇게 하면 프린지 대비가 증가합니다.
- 전면 패널의 Sine 버튼을 눌러 단일 주파수 정현파 전압을 생성하도록 함수 발생기를 구성하고 측정을 위한 시작 여기 주파수를 지정합니다. 이 연구의 측정은 4kHz에서 시작하여 9.6kHz에서 끝납니다. Output 키를 눌러 Output 커넥터를 활성화합니다.
- 허용 가능한 볼륨 설정tage 측정. 이 값은 프린지 가시성을 최대화해야 하지만 위상 래핑도 피해야 합니다. 이 연구의 생물막과 측정의 주파수 범위의 경우 5V와 10V 사이의 전압은 일반적으로 대비가 좋은 위상 맵을 생성합니다.
- Record 버튼을 클릭하여 OCT 및 OCE 이미지를 획득합니다.
- 서로 다른 주파수에서 측정을 반복하여 서로 다른 파장(또는 프린지 주기)을 갖는 탄성파 장의 단면 이미지를 얻습니다.
3. 이미지 분석
- 픽셀의 물리적 크기를 가져옵니다. x의 물리적 픽셀 크기는 x 방향의 시야를 x 방향의 이미지 크기로 나눈 다음 2를 곱하여 구합니다. z의 물리적 픽셀 크기는 z 방향의 시야를 z 방향의 이미지 크기로 나누어 구합니다. 시야각과 영상 크기 값은 영상 정보와 함께 구조체형 배열에 저장되며, 이 정보는 ThorImageOCT 패키지의 MATLAB SDK에 제공된 OCTFileOpen 함수를 사용하여 액세스할 수 있습니다.
- 각각 OCTFileGetIntensity 및 OCTFileGetPhase 함수를 사용하여 OCT 및 OCE 행렬을 가져오고 기록된 프레임의 평균을 구합니다. 이러한 함수는 ThorImageOCT 패키지의 MATLAB SDK에서 제공됩니다.
- 영상을 이진화하고 각 열에 대해 위에서 아래로 흰색 픽셀을 검출하여 샘플 위쪽 가장자리의 픽셀 위치를 구합니다.
- improfile 함수를 사용하여 이 간선을 따라 OCE 영상의 위상 분포를 추출하고 실제 차원에서 누적 호 길이를 계산합니다. x 방향과 z 방향의 연속된 점 간에 스케일링된 차이의 노름에 대한 누적 합을 취하여 호 길이를 계산합니다.
- plomb 함수를 사용하여 누적 호 길이에 대해 측정된 OCT 위상 분포(즉, OCE 영상에서)의 공간 고속 푸리에 변환을 계산합니다.
- 스펙트럼에서 피크의 위치를 확인합니다. 이 위치는 파동의 공간 주파수를 나타냅니다. 변환기 여기 주파수(Hz 단위)와 공간 주파수(역 길이 단위)의 비율에서 파동 속도(또는 위상 속도)를 계산합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 연구에서 우리는 상업적으로 얻은 입상 생물막(입상 슬러지라고도 함)을 사용했습니다. 과립은 자기 응집을 통해 형성되는 구형 생물막으로,26 성장할 수 있는 운반체 또는 표면이 필요하지 않습니다. 그림 3A 는 입상 생물막에서 국소 굴절률의 공간적 변화로 인해 발생하는 대표적인 단면 OCT 이미지를 보여줍니다. 생물막의 공칭 직경은 3mm입니다. 샘플 표면에 가까운 기공과 공극을 포함한 일부 내부 특징이 이미지에서 볼 수 있습니다. 샘플의 깊이를 따라 광학 산란이 증가하면 OCT 광원이 샘플의 중심에 도달하는 것을 방지하여 중앙 영역에 식별 가능한 정보가 없게 됩니다. 그림 3B 는 5.1kHz의 트랜스듀서 여기 주파수에 대한 샘플의 단면 OCE 이미지를 보여줍니다. 이미지의 국부적 대비는 샘플의 전파 탄성파에 의해 유도된 국부적 수직 변위와 상관관계가 있습니다. 전파 경로를 따라 프린지의 물리적 간격은 탄성 표면파의 파장에 해당합니다. 표면파는 시료 표면 근처에서 전파되며 파장에 가까운 침투 깊이를 갖습니다. 표면파 변위의 공간적 범위는 샘플에서 OCT 광원의 제한된 광학 투과로 인해 이미지에서 볼 수 없습니다. 탄성파 전파 경로(그림 4A)를 따른 광학 위상 분포는 표면파의 공간 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 공간 주파수는 고속 푸리에 변환(FFT; 그림 4B) 데이터를 추출하고 FFT 스펙트럼의 크기가 가장 큰 주파수를 선택합니다.
OCE 이미지에서 최적의 대비를 나타내는 프린지 패턴을 생성하기에 충분한 크기의 함수 발생기 전압을 선택하는 것이 중요합니다. 그러나 과도하게 큰 전압은 그림 5A와 같이 OCE 이미지에서 위상 래핑을 초래할 수 있으므로 피해야 합니다. 위상 래핑은 측정의 광학 위상차가 -π와 π 사이의 간격으로 제한되기 때문에 발생합니다. 위상이 이러한 한계 중 하나를 초과하면 반대 한계로 접혀 불연속 위상 분포가 생성됩니다. 결과적으로, 위상 언래핑의 필요성이 발생하며, 이는 문제를 제기하고 잠재적인 부정확성을 초래할 수 있습니다. 정확한 파동 측정을 위해 고려해야 할 또 다른 요소는 OCE 이미지 내에 존재하는 프린지의 수입니다. 그림 5B에 표시된 낮은 변환기 주파수에서는 과립의 크기가 작기 때문에 표면파의 완전한 발진 주기가 완전히 캡처되지 않을 수 있으며 FFT 스펙트럼은 공간 주파수(또는 역 파장)에 대한 잘못된 추정치를 생성할 수 있습니다. 공간 주파수 추정값의 또 다른 오차 원인은 OCT 영상에 표면파 및 벌크 전단파와 같이 공간적으로 겹치는 탄성파 모드가 존재한다는 것입니다. 이러한 파동 모드는 혼합되어 분석하기 어려울 수 있는 복잡한 간섭 패턴을 설정합니다. 표면파 이외의 다양한 파동 모드가 존재하면 특정 샘플, 여기 주파수 및 진폭에 따라 변환기 근처에 간섭 효과가 발생할 수 있습니다. 그림 6 은 5.5kHz의 여기 주파수로 얻은 OCE 이미지의 예로, 국부 여기 지점 근처의 벌크 전단파가 표면파장을 방해합니다. 그림 7A 는 그림 4A에서 관찰된 감쇠 사인파 패턴에서 발산하는 위상 분포를 나타내며, 이는 파동 모드의 조합에 기인합니다. 결과적으로, 결과 FFT는 그림 7B에 표시된 바와 같이 더 넓은 피크를 나타냅니다. 동일한 현상은 공극 또는 탄성/점탄성 특성의 현저한 변화가 있는 영역과 같은 결함 근처에서 발생할 수 있습니다. 이러한 영역에서는 입사 또는 표면파의 간섭과 결함으로 인한 산란파로 인해 국부 변위장이 수정됩니다.
우리는 다른 명목상 직경 (4.3 mm와 3.3 mm)를 가진 2개의 과립상 biofilms를 위한 4.0와 9.6 kHz 사이 주파수에 표면 파동을 위한 파동 속도를 산출했습니다. 파동 속도 플롯을 분산 곡선이라고 합니다. 사용된 설정의 경우 각 분산 측정에 약 15분이 걸렸습니다. 선택한 주파수 간격 내에서 정현파 변위 프로파일의 여러 사이클이 OCE 이미지에 존재하므로 현저한 위상차와 함께 공간 주파수를 정밀하게 결정할 수 있습니다. 그림 8 은 얻어진 분산 곡선을 보여줍니다. 이 곡선은 각 샘플 내의 세 위치에 대한 평균 분산 곡선을 나타냅니다. 표면파 속도는 Rayleigh 파동 속도, cR이라고 하는 일정한 값에 접근하며, 이는 관계를 통해 샘플의 전단 계수와 관련이 있습니다.
cR = ((0.862 + 1.14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)1/2
여기서 G는 전단 계수, r은 질량 밀도, ν는 푸아송비27,28입니다. 탄성파의 침투 깊이가 샘플의 직경보다 짧기 때문에 일정합니다. 기본적으로 탄성파는 영률28의 제곱에 정비례하는 파동 속도로 샘플 표면 가까이로 이동합니다. 그러나 측정 노이즈로 인해 이 주파수 범위에서 파동 속도가 완전히 일정하지는 않습니다. 작은 샘플의 경우 6.0kHz에서 9.6kHz 사이, 큰 샘플의 경우 4.0kHz에서 9.6kHz 사이의 주파수에 대한 파동 속도의 평균을 취합니다. 이 평균 파동 속도는 샘플의 영률(Young's modulus)을 추정하는 데 사용됩니다.
우리는 샘플이 높은 수분 함량으로 인해 압축할 수 없다고 가정합니다. 따라서 ν = 0.5입니다. 따라서, cR은 비압축성 고체의 경우 E = 3G와 직접 관련되어 있으며, 여기서 E는 샘플27,28의 영률입니다. 그림 8의 점선은 서로 다른 샘플에 대한 레일리 파동을 나타냅니다. 우리는 주로 물을 포함하는 생물막 조성물을 가정하고 밀도는 1000kg/m3 입니다. 결과적으로, 과립상 생물막의 산출한 영의 계수는 4.3 mm와 3.3 mm의 명목상 직경을 가진 과립상 생물막의 경우 85 kPa 그리고 205 kPa, 각각입니다. 이 측정은 생물막 사이의 기계적 특성 차이를 식별하는 기술의 기능을 확인합니다.
그림 1: 광간섭 엘라스토그래피 설정. 여기에 사용된 시스템의 개략도는 그림에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 장착된 샘플. 과립형 생물막은 변환기가 시료 홀더와 부드럽게 접촉하는 동안 시료 홀더에 위치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 입상 생물막의 OCT 및 OCT 이미지. (A) OCT 이미지. (B) 양호한 프린지 콘트라스트를 보여주는 5.1kHz로 전파되는 표면파에 대한 OCE 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 위상 분포 및 FFT. 그림 3B에 표시된 이미지의 경우, (A) 샘플의 상단 가장자리를 따른 위상차 분포 및 (B) 좁은 피크를 보여주는 위상차 분포의 FFT입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 입상 생물막의 OCT 및 OCT 이미지. (A) 위상 래핑을 보여주는 5.1kHz로 전파되는 표면파에 대한 OCE 이미지. (B) 완전한 주기 없이 1.3kHz로 전파되는 표면파에 대한 OCE 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 모드 조합을 보여주는 OCE 이미지. 이 이미지는 샘플의 다른 위치에서 가져온 것이며 5.5kHz로 전파되는 파동에 대한 모드 조합을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 위상 분포 및 FFT. 그림 6에 표시된 이미지의 경우 (A) 샘플의 상단 가장자리를 따른 위상차 분포와 (B) 더 넓은 피크를 보여주는 위상차 분포의 FFT입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 분산 곡선. 크기가 다른 두 샘플의 파동 속도는 표준 편차 막대를 사용하여 서로 다른 주파수에서 표시됩니다. 곡선의 평평한 부분에 해당하는 Rayleigh 파동이 맨 위에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT 시스템에서 얻을 수 있는 이미징 깊이는 광원의 파장에 따라 달라지는 광원의 빛 투과 정도에 따라 결정됩니다. 또한 파장은 축 분해능을 결정합니다. 더 긴 파장은 시료에 더 깊숙이 침투할 수 있지만 짧은 파장에 비해 축 분해능이 감소합니다. 반면에 횡방향 분해능은 시스템의 개구수와 파장에 따라 달라지며 파장이 짧을수록 더 높은 분해능을 제공합니다. 개구수를 증가시키면 피사계 심도(29)를 제한함으로써 트레이드오프가 발생한다. 공간 분해능은 충분한 신호 대 잡음비로 검출할 수 있는 가장 짧은 탄성 파장으로 제한됩니다. 현재 OCE 방법론은 0.5mm 9,30으로 제한됩니다. 이 기술은 샘플의 크기에 의해 제한되지만 다양한 생물막 유형에 적용할 수 있어야 합니다. 과립 또는 평평한 생물막의 모양은 기술을 억제하지 않습니다. 샘플의 투명도는 침투 깊이를 결정하는 데에도 중요한 역할을 합니다. 투명도가 높은 물질은 빛이 모든 시료를 통과할 수 있도록 하여 관찰할 수 없도록 하는 반면, 불투명한 시료는 빛의 투과를 방해하여 내부 구조에 대한 최소한의 세부 정보를 생성합니다 9,28. 이 연구의 맥락에서 밀리미터 범위의 침투 깊이로 충분합니다.
이러한 측정에 대한 또 다른 가능한 문제는 크기가 탄성파 사이클의 수를 제한하지 않는 더 큰 샘플에서 OCT 현미경의 시야(FOV)가 측정된 사이클 수의 제한 요인이 될 수 있다는 것입니다. 여기서 측정의 경우 FOV는 9mm x 9mm로 제한됩니다. 따라서 9mm보다 긴 탄성 파장은 이 OCT 현미경에서 분해할 수 없습니다. 더 넓은 시야를 가진 렌즈를 사용하면 더 큰 샘플의 이미징이 가능하여 이러한 낮은 주파수에서 더 많은 프린지를 생성할 수 있습니다. 문제는 더 높은 주파수에서도 발생합니다. 이 연구의 샘플에서 10kHz를 초과하면 파동이 상당한 감쇠를 경험하여 위상차 분포의 크기가 감소하고 공간 주파수 결정이 복잡해집니다. 이러한 문제는 함수 발생기의 전압을 높여 변환기의 변위를 증가시킴으로써 완화할 수 있습니다. 그러나 변위를 늘리는 것은 결국 위상 래핑9로 끝나기 때문에 특정 지점까지만 유용합니다. 또는 더 높은 전력의 광원을 구현하여 시스템의 감도를 향상시키면 더 큰 변위로 인한 위상 래핑을 상쇄하고 더 작은 여기(excitation)에 대한 동적 응답의 감지를 용이하게 할 수 있습니다. 더 높은 감도는 비접촉 부하의 이점을 제공하지만 높은 감쇠(31)에 의해 더 심오하게 영향을 받는 음향 OCE 방법의 구현을 용이하게 한다.
생물막에 대해 이러한 측정을 수행할 때 샘플을 수분 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 건조는 바람직하지 않은 강성 증가로 이어지며, 이는 원래 환경에서 샘플의 특성을 평가하는 데 중점을 두기 때문에 관련이 없습니다. 우리는 조명에 의한 건조를 연구하지 않았습니다. 그러나 측정 전반에 걸쳐 자연 환경의 물이 주기적으로 추가되었으며 그 기간 동안 OCT 이미지를 통해 샘플 형태를 모니터링했으며 형태에서 눈에 띄는 변화가 관찰되지 않았습니다. 또한 변환기를 배치하고 OCE 이미지를 캡처할 때 OCT 이미지에서 식별된 특징을 고려하는 것이 중요합니다. 파동 전파 경로를 따른 이질성은 파동장을 왜곡할 가능성이 있으므로 피해야 한다9. 또한, 시료에 과도한 압력이 가해지면 잠재적으로 기계적 특성을 수정할 수 있을 뿐만 아니라 파장도 왜곡될 수 있으므로 생물막과의 부드러운 접촉을 유지하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 스캔 영역은 고조파의 공간 주파수가 측정에서 정확하게 결정되도록 파면에 수직이어야 합니다.
일부 주파수의 경우 두 샘플 모두에서 파동 속도의 상당한 변화가 관찰되었으며, 이는 고유한 이질성, 특정 주파수의 파장 및 전파 경로의 형태에 기인할 수 있습니다. 우리는 이전에 단면화된 입상 생물막에 걸쳐 측정된 파동 속도 프로파일이 이질적인 미세구조9로 인해 불균일하다는 것을 보여주었습니다. 결과적으로, 과립상 biofilms에 이 기술을 채택할 경우, 표본의 맞은편에 다수 위치에 평균한 대표를 도출하기 위하여 측정을 실행하는 것이 필수적입니다.
분산 곡선에 대한 중요한 관찰은 분산 곡선이 다양한 샘플 크기에 대해 뚜렷한 거동을 나타낸다는 것입니다. 더 큰 샘플의 경우 곡선은 측정된 범위에서 비교적 일정하게 유지됩니다. 그러나 더 작은 샘플의 경우 주파수가 증가함에 따라 파동 속도가 증가하는 추세가 있으며, 특히 범위의 아래쪽 부분에서 그렇습니다. 이 현상은 낮은 주파수에서 점탄성 효과의 존재와 탄성 도파관 모드의 생성에 기인할 수 있습니다. 우리는 이전 연구에서 더 정교한 역 모델 8,9,18을 사용하여 이러한 효과를 설명했습니다.
호기성 과립 시스템에서 바이오매스는 반응기 높이 전체에 고르게 분포되어 있지 않다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 비폭기 단계에서는 더 큰 과립이 반응기 바닥에 가라앉는 경향이 있습니다. 이러한 불균등한 분포로 인해 다양한 크기의 응집체가 다양한 양의 기판에 접근할 수 있게 됩니다. 결과적으로, 다양한 크기의 집합체는 뚜렷한 커뮤니티 구성을 나타냅니다. 또한, 과잉 슬러지가 선택적으로 제거되기 때문에, 큰 과립은 반응기에 더 오랜 기간 동안 유지되는 경향이 있는 반면, 작은 과립은 더 쉽게 제거된다32. 영률(Young's modulus)의 현저한 차이는 생물막 구성, 나이 및 기계적 특성 사이의 잠재적인 연결을 시사합니다.
요약하면, OCE(Optical Coherence Elastography) 방법은 생물막의 탄성파 속도를 평가하는 빠르고 비파괴적인 수단을 제공합니다. 이 방법은 유변학적 측정의 제약을 극복하고 대체 엘라스토그래피 기술 8,18에 비해 향상된 특성을 나타냅니다. 더욱이, 그 응용성은 하이드로겔33, 각막34 및 피부35와 같은 예를 포함하여 시스템에 의해 분해될 수 있을 만큼 충분히 큰 적절한 광학 침투 깊이 및 크기를 갖는 모든 부분적으로 투명한 샘플을 포함하기 위해 입상 생물막을 넘어 확장됩니다. 이 방법의 향후 발전에는 몇 가지 주요 측면이 포함됩니다. 첫째, 고조파 탄성파의 주파수를 수백 kHz 범위로 증가시키면 몇 마이크로미터의 파장이 허용되어 유사한 규모의 공간 분해능을 얻을 수 있습니다. 둘째, OCT 시스템의 광 전력을 2mW(전류)에서 20mW로 증가시켜 광학 감지 시스템의 신호 대 잡음비가 향상됩니다. 마지막으로 접촉 고조파 액추에이터를 비접촉 음향 방사 압력 소스로 교체합니다. 이 추가는 비침습적이고 비파괴적인 가동을 촉진하고 그들의 본래 환경에 있는 biofilm 표본을 심문하는 것을 허용할 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 Aqua-Aerobic Systems, Inc.(Rockford, IL, USA)에 이 작업에서 연구된 과립상 생물막을 제공한 것에 대해 감사를 표합니다. 저자들은 또한 Award #210047 및 #193729를 통해 National Science Foundation의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printed sample holder | |||
| 3D printed wedge tip | 3 mm width | ||
| BNC cables | Any brand | ||
| Delay generator | Stanford Research Systems | DG535 | DG535 Digital delay/ Pulse Generator |
| Function generator | Agilent Technologies | 33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator | |
| Granular biofilm | Aqua-Aerobic Systems | Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.) | |
| MATLAB | MathWorks | Release 2022a (MATLAB 9.12) | |
| Piezoelectric transducer | Thorlabs | PK2JUP1 | Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement |
| SD-OCT System | Thorlabs | Ganymede II, LSM03 scan lens | |
| ThorImageOCT | Thorlabs | Version: 5.5.5 |
References
- Mahto, K. U., Das, S. Bacterial biofilm and extracellular polymeric substances in the moving bed biofilm reactor for wastewater treatment: A review. Bioresour Technol. 345, 126476 (2022).
- Pholchan, M. K., Baptista, J. deC., Davenport, R. J., Curtis, T. P. Systematic study of the effect of operating variables on reactor performance and microbial diversity in laboratory-scale activated sludge reactors. Water Res. 44 (5), 1341-1352 (2010).
- Briones, A., Raskin, L. Diversity and dynamics of microbial communities in engineered environments and their implications for process stability. Curr Opin in Biotechnol. 14 (3), 270-276 (2003).
- Sanchez-Huerta, C., Sanchez Medina, J., Wang, C., Fortunato, L., Hong, P. Understanding the role of sorption and biodegradation in the removal of organic micropollutants by membrane aerated biofilm reactor (MABR) with different biofilm thickness. Water Res. 236, 119935 (2023).
- Wang, H. F., Hu, H., Yang, H. Y., Zeng, R. J. Characterization of anaerobic granular sludge using a rheological approach. Water Res. 106, 116-125 (2016).
- Ma, Y. J., Xia, C. W., Yang, H. Y., Zeng, R. J. A rheological approach to analyze aerobic granular sludge. Water Res. 50, 171-178 (2014).
- Lin, X., Wang, Y. Microstructure of anammox granules and mechanisms endowing their intensity revealed by microscopic inspection and rheometry. Water Res. 120, 22-31 (2017).
- Liou, H. C., et al. Towards mechanical characterization of granular biofilms by optical coherence elastography measurements of circumferential elastic waves. Soft Matter. 15 (28), 5562-5573 (2019).
- Liou, H. C., Sabba, F., Wang, Z., Wells, G., Balogun, O. Layered viscoelastic properties of granular biofilms. Water Res. 202, 117394 (2021).
- Li, C., Guan, G., Reif, R., Huang, Z., Wang, R. K. Determining elastic properties of skin by measuring surface waves from an impulse mechanical stimulus using phase-sensitive optical coherence tomography. J R Soc Interface. 9, 831-841 (2012).
- Ramier, A., et al. In vivo measurement of shear modulus of the human cornea using optical coherence elastography. Sci Rep. 10, 17366 (2020).
- Ramier, A., Tavakol, B., Yin, S. H. Measuring mechanical wave speed, dispersion, and viscoelastic modulus of cornea using optical coherence elastography. Optics Express. 27 (12), 16635 (2019).
- Crespo, M. A., et al. In vivo determination of human corneal elastic modulus using vibrational optical coherence tomography. Cornea Ext Dis. 11 (7), 1-11 (2022).
- Ambrozinski, L., et al. Acoustic micro-tapping for non-contact 4D imaging of tissue elasticity. Sci Rep. 6 (38967), 1-11 (2016).
- Pitre, J. J. Jr, et al. Nearly-incompressible transverse isotropy (NITI) of cornea elasticity: model and experiments with acoustic micro-tapping OCE. Sci Rep. 10 (12983), 1-14 (2020).
- Lan, G., Aglyamov, S. R., Larin, K. V., Twa, M. D. In vivo human corneal shear wave optical coherence elastography. Optom Vis Sci. 98, 58-63 (2021).
- Rosenthal, A., et al. Morphological analysis of pore size and connectivity in a thick mixed-cultured biofilm. Biotechnol Bioeng. 115, 2268-2279 (2018).
- Liou, H. C., Sabba, F. I., Packman, A., Wells, G., Balogun, O. Nondestructive characterization of soft materials and biofilms by measurement of guided elastic wave propagation using optical coherence elastography. Soft Matter. 15, 575-586 (2019).
- Wagner, M., Taherzadeh, D., Haisch, C., Horn, H. Investigation of the mesoscale structure and volumetric features of biofilms using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 107 (5), 844-853 (2010).
- Leite-Andrade, M. C., et al. A new approach by optical coherence tomography for elucidating biofilm formation by emergent Candida species. PLoS ONE. 12 (11), e0188020 (2017).
- Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Time-resolved biofilm deformation measurements using optical coherence tomography. Biotechnol Bioeng. 112 (9), 1893-1905 (2015).
- Picioreanu, C., Blauert, F., Horn, H., Wagner, M. Determination of mechanical properties of biofilms by modeling the deformation measured using optical coherence tomography. Water Res. 145, 588-598 (2018).
- Li, M., Nahum, Y., Matouš, K., Stoodley, P., Nerenberg, R. Effects of biofilm heterogeneity on the apparent mechanical properties obtained by shear rheometry. Biotechnol Bioeng. 120, 553-561 (2023).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Geisel, S., Secchi, E., Vermant, J. Experimental challenges in determining the rheological properties of bacterial biofilms. Interface Focus. 12 (6), 20220032 (2022).
- Winkler, M. K. H., van Loosdrecht, M. C. M.
- Graff, K. F. Wave motion in elastic solids. , Dover Publications. (1991).
- Kennedy, B. F., Kennedy, K. M., Sampson, D. D. A review of optical coherence elastography: Fundamentals, techniques and prospects. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (2), 272-288 (2014).
- Ang, M., et al. Anterior segment optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 66, 132-156 (2018).
- Kirby, M. A., et al. Spatial resolution in dynamic optical coherence elastography. J Biomed Opt. 24 (9), 1-16 (2019).
- Larin, K. V., Sampson, D. D. Optical coherence elastography - OCT at work in tissue biomechanics. Biomed Opt Express. 8, 1172-1202 (2017).
- Muhammad, A., et al. Importance of species sorting and immigration on the bacterial assembly of different-sized aggregates in a full-scale aerobic granular sludge. Environ Sci Technol. 53 (14), 8291-8301 (2019).
- Candry, P., et al. Tailoring polyvinyl alcohol-sodium alginate (PVA-SA) hydrogel beads by controlling crosslinking pH and time. Sci Rep. 12 (1), 20822 (2022).
- Kirby, M. A., et al.
- Liang, X., Boppart, S. A. Biomechanical properties of in vivo human skin from dynamic optical coherence elastography. IEEE Trans Biomed Eng. 57 (4), 953-959 (2010).
