Kvantifisering av elastiske egenskaper til miljøbiofilm ved bruk av optisk koherens elastografi

Summary

Denne artikkelen fremhever optisk koherens elastografi (OCE) teknikkens effektivitet i raskt og ikke-destruktivt karakteriserende biofilm elastiske egenskaper. Vi belyser kritiske OCE-implementeringsprosedyrer for nøyaktige målinger og presenterer Youngs modulverdier for to granulære biofilmer.

Abstract

Biofilmer er komplekse biomaterialer som består av et velorganisert nettverk av mikrobielle celler innkapslet i egenproduserte ekstracellulære polymere stoffer (EPS). Denne artikkelen gir en detaljert redegjørelse for implementeringen av optisk koherens elastografi (OCE) målinger skreddersydd for elastisk karakterisering av biofilm. OCE er en ikke-destruktiv optisk teknikk som muliggjør lokal kartlegging av mikrostruktur, morfologi og viskoelastiske egenskaper til delvis gjennomsiktige myke materialer med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Vi gir en omfattende veiledning som beskriver de viktigste prosedyrene for riktig implementering av denne teknikken, sammen med en metodikk for å estimere hoveddelen av Youngs modul av granulære biofilmer fra de innsamlede målingene. Disse består av systemoppsett, datainnsamling og etterbehandling. I diskusjonen dykker vi inn i den underliggende fysikken til sensorene som brukes i OCE og utforsker de grunnleggende begrensningene angående romlige og tidsmessige skalaer for OCE-målinger. Vi konkluderer med potensielle fremtidige retninger for å fremme OCE-teknikken for å lette elastiske målinger av miljøbiofilm.

Introduction

I avløpsvannbehandling og vannressursgjenvinning brukes gunstige biofilmer i tilknyttede vekstreaktorer i økende grad for å gjøre det mulig for mikrober å konvertere uønskede forurensninger, som organisk materiale, nitrogen og fosfat, til stabiliserte former som lett kan fjernes fra vannet¹. I disse systemene er biofilmens fremvoksende funksjon, nemlig biokjemiske transformasjoner, nært forbundet med mangfoldet av mikrober som bor i det og næringsstoffene disse mikroberene mottar². Følgelig kan pågående biofilmvekst utgjøre en utfordring for å opprettholde konsistent reaktorfunksjonalitet fordi den nye biofilmveksten kan endre biofilmens generelle metabolske prosesser, masseoverføringsegenskaper og samfunnssammensetning. Å stabilisere biofilmmiljøet så mye som mulig kan beskytte mot slike endringer³. Dette inkluderer å sikre en jevn strøm av næringsstoffer og holde strukturen i biofilmen stabil med en jevn tykkelse⁴. Overvåking av biofilmens stivhet og fysiske struktur vil gjøre det mulig for forskere å få innsikt i biofilmens generelle helse og funksjon.

Biofilm utviser viskoelastiske egenskaper ^5,6,7. Denne viskoelastiske naturen resulterer i en kombinasjon av en øyeblikkelig og langsom, tidsavhengig deformasjon som respons på eksterne mekaniske krefter. Et unikt aspekt ved biofilm er at når de blir utsatt for betydelig deformasjon, reagerer de som viskøse væsker. Omvendt, når de blir utsatt for mindre deformasjon, er deres respons sammenlignbar med faste stoffer⁵. Videre er det innenfor denne lille deformasjonsregionen et deformasjonsområde under hvilket biofilmer utviser et lineært kraftforskyvningsforhold ^5,6,7. Deformasjoner innenfor dette lineære området er optimale for å vurdere biofilmmekaniske egenskaper fordi disse gir reproduserbare målinger. Flere teknikker kan kvantifisere den elastiske responsen innenfor dette området. Optisk koherens elastografi (OCE) er en fremvoksende teknikk som blir tilpasset for å analysere biofilmer i dette lineære området (stammer i størrelsesorden 10-4-10-5) ^8,9.

OCEs mest etablerte anvendelse så langt er innen det biomedisinske feltet, hvor teknikken har blitt brukt til å karakterisere biologiske vev som bare krever overfladisk optisk tilgang. For eksempel brukte Li et al. OCE for å karakterisere de elastiske egenskapene til hudvev¹⁰. Andre forfattere karakteriserte de anisotrope elastiske egenskapene til svinekjøtt og humant hornhinnevev og hvordan de påvirkes av intraokulært trykk 11,12,13,14,15,16. Noen fordeler med OCE-metoden for å studere biofilmer er at den er ikke-destruktiv og gir mesoskala romlig oppløsning, det krever ingen prøvepreparering, og selve metoden er rask; Den gir samregistrerte målinger av fysisk struktur og elastiske egenskaper (f.eks. porøsitet, overflateruhet og morfologi)8,9,17,18.

OCE-metoden måler lokal forskyvning av forplantende elastiske bølger i et eksemplar ved hjelp av fasefølsom optisk koherenstomografi (OCT). OCT er et optisk interferometer med lav koherens som omdanner lokale endringer i prøveforskyvningen til en intensitetsendring som registreres med et optisk spektrometer. OCT-teknikken har også blitt brukt i biofilmforskning for karakterisering av mesoskalastruktur, porøsitetsfordeling i tre dimensjoner og biofilmdeformasjon 17,19,20,21. I tillegg estimerte Picioreanu et al. biofilm mekaniske egenskaper ved hjelp av fluid-struktur interaksjon invers modellering av OCT tverrsnittsdeformasjonsbilder²².

På den annen side gir OCE-målinger, kombinert med invers elastodynamisk bølgemodellering, bølgehastigheten til elastiske bølger i prøven, noe som muliggjør karakterisering av prøvens elastiske og viskoelastiske egenskaper. Vår gruppe tilpasset OCE-teknikken for kvantitativ måling av biofilmens elastiske og viskoelastiske egenskaper ^8,9,18 og validerte teknikken mot skjærreometrimålinger i agarosegelplateprøver¹⁸. OCE-tilnærmingen gir presise og pålitelige estimater av biofilmegenskapene siden den målte elastiske bølgehastigheten er korrelert med prøvens elastiske egenskaper. Videre kan det romlige henfallet av den elastiske bølgeamplituden være direkte korrelert med de viskoelastiske egenskapene på grunn av viskøse effekter i materialet. Vi har rapportert OCE-målinger av viskoelastiske egenskaper til bakteriell biofilm dyrket på kuponger i en roterende ringformet reaktor (RAR) og granulære biofilmer med komplekse geometrier ved hjelp av elastodynamiske bølgemodeller¹⁸.

OCE-teknikken er også et kraftig alternativ til tradisjonell reometri¹⁸som brukes til viskoelastisk karakterisering. Rheometrimetoder er best egnet for prøver med plan geometri. Som sådan kan granulære biofilmer, som har vilkårlige former og overflatemorfologier, ikke nøyaktig karakteriseres på et reometer ^8,23. I tillegg, i motsetning til OCE, kan reometrimetoder være utfordrende å tilpasse for sanntidsmålinger, for eksempel under biofilmvekst i strømningsceller^24,25.

I denne artikkelen viser vi at OCE-målinger av den frekvensuavhengige bølgehastigheten til overflatebølger kan brukes til å karakterisere biofilmens elastiske egenskaper uten behov for kompliserte modeller. Denne utviklingen vil gjøre OCE-tilnærmingen mer tilgjengelig for det bredere biofilmsamfunnet for å studere biofilmens mekaniske egenskaper.

Figur 1 viser en skjematisk illustrasjon av OCT-systemet som ble brukt i denne studien. Systemet inneholder flere instrumenter, inkludert et kommersielt spektraldomene fasefølsomt OCT-system, en forsinkelsesgenerator, en funksjonsgenerator og en piezoelektrisk svinger. OCT-systemet opererer på prinsippet om interferometri ved å benytte en bredbåndslyskilde med en senterbølgelengde på 930 nm. Den samlede lysintensiteten, som er korrelert med intrikate strukturelle detaljer i prøven, analyseres i etterbehandlingsenheten og konverteres deretter til et tverrsnittsbilde av prøven – ofte referert til som et OCT-bilde. OCT-bildedybden avhenger av alvorlighetsgraden av den optiske spredningen i prøven som stammer fra lokal variasjon i brytningsindeksen og er begrenset til 1-3 mm i biologisk vev og biofilm. Siden den optiske fasen i prøven og interferensintensiteten moduleres ved bevegelse, kan OCT brukes til å detektere den lokale prøveforskyvningen. Vi utnytter forskyvningsfølsomheten til OCT i OCE-metoden for å spore steady state forskyvningsfeltet til elastiske bølger i prøven. Spesielt gir funksjonsgeneratoren en sinusformet spenning for å drive den piezoelektriske svingeren. Transduseren strekker seg i sin tur og kontrakterer med en oscillerende tidshistorie. Den oscillerende forskyvningen av transduseren gir en sinusformet kraft på prøveoverflaten gjennom en 3D-trykt kilespiss ved transduserens toppunkt, noe som fører til generering av harmoniske elastiske bølger i prøven. Kilespissen kommer lett i kontakt med prøven, slik at prøven forblir intakt etter at aktuatoren er trukket tilbake fra prøveoverflaten. For å registrere den lokale forskyvningen i prøven, registreres tilstøtende dybdeskanninger atskilt med en fast tidsforsinkelse ved hvert bildepunkt i prøven. Den optiske faseforskjellen mellom påfølgende skanninger ved hvert pikselpunkt er proporsjonal med den lokale vertikale forskyvningen på samme punkt. Synkronisering mellom transduserens forskyvning og skanneoptikken i OCT-systemet oppnås gjennom en utløserpuls som stammer fra funksjonsgeneratoren og forsinkes i forsinkelsesgeneratoren. Dette synkroniseringstrinnet forenkler innsamlingen av konsistente tverrsnittsbilder av den lokale optiske fasefordelingen i prøven. Disse bildene er direkte proporsjonale med den lokale vertikale harmoniske forskyvningen i prøven og er kjent som OCE-bildet. OCE-bilder tas ved forskjellige transduseraktiveringsfrekvenser for å oppnå elastisk bølgelengde og bølgehastighet som funksjon av frekvens. De målte bølgehastighetene analyseres med en elastodynamisk modell for å bestemme prøvens elastiske egenskaper.

Protocol

1. System oppsett Samle systemkomponentene som inkluderer det kommersielle OCT-systemet (baseenhet, stativ, bildehode og datamaskin), bølgeformgenerator, transduser, forsinkelses- / pulsgenerator, en bryter med BNC-tilkoblinger, BNC-kabler og adaptere, optiske stolper og klemmer. Koble synkroniseringssignalet fra funksjonsgeneratoren til en bryter. Koble den andre porten på bryteren til forsinkelsesgeneratoren. Koble utgangen fra funksjonsgeneratoren til transduserledninge…

Representative Results

I denne studien brukte vi granulære biofilmer (også kjent som granulært slam), som ble kommersielt oppnådd. Granulater er sfæriske biofilmer som dannes gjennom selvaggregering, noe som betyr at de ikke krever en bærer eller overflate for å vokse26. Figur 3A viser et representativt tverrsnitts OCT-bilde som oppstår på grunn av den romlige variasjonen i den lokale brytningsindeksen i en granulær biofilm. Biofilmen har en nominell diameter på…

Discussion

Den oppnåelige bildedybden i OCT-systemet bestemmes av graden av lyspenetrasjon fra lyskilden, som avhenger av bølgelengden til kilden. Videre bestemmer bølgelengden den aksiale oppløsningen. Lengre bølgelengder kan trenge dypere inn i prøven, men på bekostning av redusert aksial oppløsning sammenlignet med kortere bølgelengder. Tverroppløsning er derimot avhengig av både systemets numeriske blenderåpning og bølgelengden, med kortere bølgelengder som gir høyere oppløsning. Å øke den numeriske blenderåp…

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5