Summary
Un protocole détaillé est fourni pour le nettoyage et la réutilisation des tubes à ultracentrifuger en polycarbonate afin d’effectuer l’isolement des vésicules extracellulaires adapté aux expériences de protéomique.
Abstract
Les plastiques de laboratoire à usage unique exacerbent la crise de la pollution et contribuent aux coûts des consommables. Dans l’isolement des vésicules extracellulaires (VE), des tubes d’ultracentrifugation (UC) en polycarbonate sont utilisés pour supporter les forces centrifuges élevées associées. La protéomique des VE est un domaine en plein essor et il n’existe pas de protocoles de réutilisation validés pour ces tubes. La réutilisation des consommables pour les protocoles d’isolement de protéines à faible rendement et la protéomique en aval nécessite une compatibilité des réactifs avec les acquisitions par spectroscopie de masse, telles que l’absence de contamination par des polymères synthétiques dérivés du tube de centrifugation et l’élimination suffisante des protéines résiduelles.
Ce protocole décrit et valide une méthode de nettoyage des tubes UC en polycarbonate pour les réutiliser dans des expériences de protéomique EV. Le processus de nettoyage implique l’immersion immédiate des tubes UC dansH2O pour éviter le dessèchement des protéines, le lavage avec un détergent à 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), le rinçage à l’eau chaude du robinet, à l’eau déminéralisée et à 70 % d’éthanol. Pour valider le protocole de réutilisation des tubes UC pour la protéomique des VE en aval, des tubes usagés ont été obtenus à la suite d’une expérience isolant les VE du tissu cardiovasculaire en utilisant la CU différentielle et la séparation par gradient de densité. Les tubes ont été nettoyés et le processus expérimental a été répété sans échantillons EV, comparant des tubes UC vierges jamais utilisés à des tubes UC nettoyés. Les pastilles de pseudo-EV obtenues par les procédures d’isolement ont été lysées et préparées pour la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à l’aide d’un kit commercial de préparation d’échantillons de protéines avec des modifications pour les échantillons de protéines de faible abondance.
Après le nettoyage, le nombre de protéines identifiées a été réduit de 98 % dans la pseudo-pastille par rapport à l’échantillon d’isolement EV précédent du même tube. En comparant un tube nettoyé à un tube vierge, les deux échantillons contenaient un très petit nombre de protéines (≤20) avec une similitude de 86%. L’absence de pics de polymères dans les chromatogrammes des tubes nettoyés a été confirmée. À terme, la validation d’un protocole de nettoyage des tubes UC adapté à l’enrichissement des VE permettra de réduire les déchets produits par les laboratoires de VE et de diminuer les coûts expérimentaux.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules délimitées par des bicouches lipidiques libérées par des cellules qui transportent des marchandises biologiquement actives, telles que des protéines, et participent à divers processus biologiques, y compris la communication cellule-cellule et la formation de minéralisation biologique1. Ces particules se trouvent dans tous les fluides et tissus corporels, et leurs activités et utilisations biologiques constituent un domaine de recherche scientifique en évolution rapide. L’isolement et la validation de ces nanoparticules présentent divers défis en raison de leur petite taille et de leur biosimilarité avec d’autres particules, telles que les liposomes et les agrégats de protéines. Les directives les plus récentes de l’International Society of Extracellular Vescles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), sont la norme reconnue pour la recherche scientifique sur lesVE2.
Différentes méthodes, souvent en tandem, doivent être utilisées pour l’isolation des véhicules électriques en fonction de la source en amont et des applications en aval. En 2015, la méthode d’isolement primaire la plus courante pour les VE était l’ultracentrifugation différentielle (UC)2. En principe, la centrifugation initiale à basse vitesse sépare les composants indésirables plus gros ou plus denses, tels que les cellules et les débris cellulaires, laissant les VE dans le surnageant. Par la suite, la CU utilise une force centrifuge très élevée pour extraire les granulés et ainsi séparer et purifier les VE des autres particules plus petites ou moins denses mais qui peuvent également contenir des particules denses non VE. La plupart des protocoles utilisent souvent, à une étape ou à une autre, la CU pour isoler les VE d’un fluide3. De plus, l’UC est utilisé dans d’autres méthodes d’isolation des VE, telles que l’ultracentrifugation à gradient de densité (DGUC), qui utilise des milieux tels que l’iodixanol OptiprepTM et la force centrifuge pour séparer les VE en fonction de leur densité flottante4. Il existe d’autres méthodes d’isolation des véhicules électriques3.
Compte tenu de l’évolution rapide de la compréhension des processus biologiques dictés par les VE et de leur potentiel en tant que biomarqueurs et informations concernant la physiopathologie, les analyses basées sur la découverte telles que la protéomique ont gagné du terrain 5,6,7,8. Les VE sont petites et, selon la source, ont un faible rendement en protéines (<1 μg) par rapport au lysat de tissu entier ou de cellule. L’isolement des VE pour l’analyse protéomique nécessite des considérations particulières, telles que l’élimination des contaminants protéiques non VE des liquides ou des tissus en amont, la prise en compte de la dégradation des protéines VE pendant le processus d’isolement et l’utilisation de méthodes qui créent des solutions protéiques chimiquement compatibles avec la préparation de peptides et les analyses par spectrométrie de masse.
Les consommables de laboratoire de recherche sont souvent en plastique et jetables par nature. Ces matériaux à usage unique contribuent à la crise mondiale de la pollution plastique et aux coûts des consommables. Les tubes UC spécialisés en polycarbonate et en polystyrène sont conçus pour résister aux forces centrifuges élevées requises pour granuler les VE dans les applications de laboratoire. Bien qu’il soit possible de stériliser et de désinfecter les tubes UC pour les réutiliser, l’analyse protéomique, en particulier celles à faible rendement en protéines telles que les VE, nécessite une attention particulière. Non seulement l’élimination suffisante des protéines résiduelles de l’utilisation précédente est primordiale, mais la compatibilité chimique avec la spectroscopie de masse et la contamination par des polymères dérivés du plastique doit également être prise en compte.
Nous présentons ici un protocole de nettoyage de tubes en polycarbonate à l’aide de détergents adaptés à la spectrométrie de masse et effectuons des expériences pour valider son élimination réussie des protéines résiduelles en dessous des limites de détection et de l’absence de contaminants polymères détectables. Pour valider le protocole de nettoyage pour les applications protéomiques des VE à l’aide des objectifs UC et DGUC, nous avons obtenu des tubes à partir d’isolements de VE de tissus vasculaires humains avec un protocole combiné UC et DGUC. Les tubes ont été nettoyés à l’aide du protocole décrit, et le processus expérimental a été répété sans que des échantillons ne comparent un tube UC vierge jamais utilisé et un tube UC nettoyé. À terme, la validation d’un protocole de nettoyage des tubes UC adapté à l’enrichissement des VE permettra de réduire les déchets produits par les laboratoires de VE et de diminuer le coût associé à de telles expériences.
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Protocol
1. Nettoyage des tubes
REMARQUE : La procédure d’isolation EV utilise des tubes UC en polycarbonate coiffés et non bouchés (détaillés ci-dessous). La même procédure a été suivie pour les tubes bouchés et non bouchés. Dans le cas des tubes bouchés, les pièces du couvercle ont été nettoyées individuellement et remontées après le séchage et le pré-stockage.
- Après la première utilisation des tubes en polycarbonate et le retrait de l’échantillon, immergez immédiatement les tubes UC dans l’eau du robinet pour éviter le dessèchement de l’échantillon sur le côté du tube.
- Transvaser et immerger les tubes dans du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,1 % dans l’eau du robinet pendant 10 min.
- Un tube à la fois, décantez la plupart, mais pas la totalité, de la solution SDS du tube et utilisez un coton-tige pour essuyer soigneusement la zone du tube où se trouvait la pastille EV.
REMARQUE : N’utilisez rien avec des poils. Ce protocole utilisait des cotons-tiges normaux ; Cependant, des cotons-tiges spécialisés à faible peluche peuvent être utilisés pour nettoyer les tubes. - Rincez au moins 3 fois à l’eau chaude du robinet (~50 °C). Assurez-vous de remplir et de décanter complètement le tube.
- Rincer 1x à l’eau déminéralisée à l’aide d’un flacon pulvérisateur ou d’un flacon de lavage à col étroit.
- Rincer 1 fois avec de l’éthanol à 70% à l’aide d’un flacon pulvérisateur.
- Laissez sécher le tube à l’envers.
REMARQUE : Les portoirs de tubes pour le tri des cellules activées par fluorescence fonctionnent bien pour le séchage des tubes UC. - Placez les tubes complètement séchés dans un bocal propre ; Ils sont prêts à être réutilisés.
REMARQUE : Actuellement, le protocole est validé pour une réutilisation jusqu’à 2 fois.
2. Enrichissement des VE
REMARQUE : Le protocole d’isolement et de protéomique EV suivant a été utilisé pour l’isolement tissulaire original de l’EV, ainsi que pour les « échantillons fictifs » utilisés pour obtenir les échantillons vierges (jamais utilisés) et les échantillons en tube nettoyés. Les échantillons originaux étaient des VE piégés dans les tissus en suspension à partir de plaques carotidiennes de patients ayant subi des endartériectomies carotidiennes. Les échantillons chirurgicaux ont été prélevés auprès du Réseau universitaire de santé (Toronto, Canada) et ont été approuvés par le comité d’éthique de l’établissement. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé pour la collecte d’échantillons et l’analyse des données, conformément à la Déclaration d’Helsinki. Les échantillons fictifs étaient des pseudo-pastilles obtenues en traitant des tubes vierges et nettoyés avec les mêmes solutions et étapes de traitement que les échantillons d’isolement EV.
- Dégivrer des échantillons EV ou des échantillons simulés dans PBS sur glace.
- Préparez un tampon NTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) et un filtre stérile.
- Faites tourner les échantillons à 10 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
- Placez le surnageant dans un tube en polycarbonate ouvert de 1 ml.
- Centrifuger le surnageant à 100 000× g pendant 1 h à 4 °C.
- Remettre la pastille en suspension dans 150 μL de tampon NTE stérile filtré avec inhibiteur de protéase.
- Transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et ajouter un tampon NTE pour atteindre un volume total d’échantillon de 1,5 mL.
- Conservez les échantillons sur de la glace.
3. Préparation des gradients de densité et de la séparation des gradients de densité
REMARQUE : Ce protocole d’isolement des VE a déjà été décrit par Blaser et al.9 En bref :
- Préparez cinq solutions de milieu à gradient de densité d’iodixanol (10 %, 15 %, 20 %, 25 % et 30 %) avec un tampon NTE comme diluant.
- Superposez les solutions à cinq densités séquentiellement dans un ou plusieurs tubes d’ultracentrifugation bouchés avec 30 % en bas et 10 % en haut.
- Fixez les capuchons sur le(s) tube(s) et déplacez-vous doucement vers une position horizontale stable pendant 1 h à température ambiante.
- Après 1 h, déplacez doucement le(s) tube(s) en position verticale sur la glace pendant 30 min pour refroidir la pente.
- Ajouter 1,5 mL de l’échantillon ou de l’échantillon fictif (tampon NTE) dans le haut du ou des tubes à gradient de densité préparés.
- Tube(s) ultracentrifuge(s) à 250 000 × g pendant 40 min à 4 °C.
- Retirer les fractions supérieures du gradient de densité (2,4 mL) dans le(s) tube(s) d’ultracentrifugation non bouché(s). Remplir à 9 mL avec un tampon NTE filtré stérilement.
- Granuler les VE par ultracentrifugation à 100 000 × g pendant 1 h à 4 °C.
REMARQUE : Encerclez l’emplacement de la pastille EV visible ou l’emplacement prévu avec un marqueur. Cela vous permettra de nettoyer directement la zone du granulé avec l’écouvillon. - Aspirer le surnageant tout en déplaçant le tube à l’envers pendant 3 min. Retirez les gouttelettes restantes à l’aide d’un coton-tige avant de retourner le tube à l’endroit.
- Remettre en suspension la pastille EV dans 12 μL de tampon de lyse dans le kit référencé.
4. Préparation peptidique pour la protéomique
REMARQUE : La préparation des échantillons de protéomique a été effectuée selon le protocole du kit avec des modifications internes pour les échantillons de protéines de faible abondance. Le protocole modifié est le suivant :
- Lyser, dénaturer, réduire et alkyler les échantillons en les chauffant dans un tampon de lyse à 95 °C pendant 10 min.
- Digérer les échantillons à l’aide de la solution de digestion de Lys-C/trypsine pendant 2 h à 37 °C en utilisant 10 μL de solution de lyse de l’échantillon et 10 μL de solution de digestion.
- Purifiez les peptides à l’aide d’une cartouche en éliminant les contaminants hydrophiles et hydrophobes et en éluant les peptides purifiés à l’aide de solutions de kit.
- Faites sécher les peptides purifiés dans un vide rapide à 45 °C pendant 45 min ou jusqu’à ce qu’ils soient secs.
REMARQUE : Évitez le séchage excessif des peptides. - Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’au moment du séquençage par spectrométrie de masse.
- Ajouter 17 μL de solution de charge LC aux peptides séchés.
- Laissez les échantillons sur de la glace pendant 1 h.
- Agitez brièvement les échantillons, puis sonifiez-les dans un bain d’eau à ultrasons pendant 5 min.
- Centrifuger les échantillons à charge LC à 16 000 × g pendant 1 min, aspirer 15 μL par le haut et les séparer dans un nouveau tube.
5. Chromatographie liquide et séquençage par spectrométrie de masse en tandem
- Injecter 2 μL de solution peptidique à charge LC dans un spectromètre de masse.
- Fractionnez les peptides à l’aide d’une configuration à deux colonnes.
- Chauffez la colonne à une température constante de 45 °C.
- Exécutez le gradient analytique à 300 nL/min de 5 % à 21 % de solvant B (acétonitrile/acide formique à 0,1 %) pendant 60 min, suivi de 10 min de solvant B à 21 % à 30 % et de 10 min supplémentaires d’un lavage à la scie sauteuse à 95 % à 5 %.
- Réglez le MS1 sur une résolution de 120 K (temps d’injection maximum, 25 ms), soumettez les ions précurseurs supérieurs (dans un temps de cycle de 3,0 s) à une largeur d’isolement HCD de 1,2 m/z, exclusion dynamique activée (60 s), et réglez la résolution MS2 sur 60 K (temps d’injection maximum, automatique ; énergie de collision normalisée, 24 %, 26 % et 28 %).
- Réglez les plages d’acquisition MS1 et MS2 sur 400 m/z-1 200 m/z et 120 m/z-1 200 m/z, respectivement.
6. Identification des peptides/protéines
- Rechercher les spectres peptidiques acquis à l’aide d’un logiciel de recherche protéomique à l’aide d’un algorithme de recherche commerciale dans une base de données uniProt humaine.
- Réglez l’enzyme de digestion sur la trypsine et laissez jusqu’à deux clivages manqués.
- Définissez la tolérance du précurseur sur 10 ppm et la fenêtre de tolérance du fragment sur 0,02 Da.
- Définir l’oxydation de la méthionine et l’acétylation N-terminale comme des modifications variables et la carbamidométhylation de la cystéine comme modification fixe.
- Filtrez les peptides en fonction d’un seuil de taux de fausses découvertes (FDR) de 1,0 %, tel que calculé par l’algorithme Percolator.
- Ne considérez comme uniques que les peptides attribués à un groupe de protéines donné et qui n’ont été détectés dans aucun autre groupe de protéines et utilisez-les pour des analyses plus approfondies.
- N’incluez qu’un minimum de deux peptides uniques pour chaque protéine dans les analyses.
- Maximisez les ID grâce à la détection des ions précurseurs.
- Effectuez un alignement chromatographique avec un décalage maximal du temps de rétention de 10 min, une tolérance de masse de 10 ppm et un minimum signal/bruit de 5.
- Normalisez l’abondance des peptides par la quantité totale de peptides.
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Representative Results
Pour valider le protocole de nettoyage (Figure 1), deux expériences ont été réalisées. Tout d’abord, le protéome de l’échantillon fictif du tube nettoyé a été comparé au protéome de l’échantillon tissulaire EV de l’utilisation initiale du tube afin de déterminer le transfert des protéines identifiées. Les chromatogrammes représentatifs montrent une réduction de l’hétérogénéité des pics après nettoyage des tubes (Figure 2). Dans l’isolement original de l’EV, 806 protéines ont été identifiées avec deux peptides uniques ou plus. Après le nettoyage, le nombre de protéines identifiées a été réduit de 98 % à 19 protéines. Douze protéines étaient partagées dans les deux, et sept protéines étaient uniques au tube nettoyé (Figure 3A). À l’aide d’une revue de la littérature, une liste de protéines EV caractéristiques a été compilée comme précédemment publiée9. Sur les 24 protéines EV caractéristiques répertoriées dans l’échantillon original, une seule a été identifiée après nettoyage (tableau 1). Parmi les protéines partagées, MFGE8, une protéine EV caractéristique, était la protéine la plus enrichie de manière différentielle dans l’échantillon EV. En comparaison, deux protéines contaminantes, KRT14 et KRT5, étaient les plus enrichies de manière différentielle dans l’échantillon post-nettoyé (figure 3B).
Pour confirmer l’élimination des protéines des tubes après le lavage, un gel SDS-PAGE a été réalisé avec une courbe standard BSA de 1 μg (limite inférieure typique du rendement d’isolement EV) à 16,5 ng, puis des granulés de VE en tube vierge et nettoyé en trois exemplaires. Toutes les bandes courbes standard étaient visibles, mais les échantillons ne l’étaient pas, ce qui indiquait l’élimination par nettoyage d’au moins 98 % des protéines et aucune différence observable entre le tube vierge et le tube nettoyé (figure 4A). Pour évaluer davantage les protéines spécifiques identifiées dans les tubes nettoyés par rapport à un tube vierge jamais utilisé, une comparaison directe a été effectuée (N = 4, groupe). Les chromatogrammes des tubes vierges et nettoyés étaient très similaires (figure 4B). Dans les tubes vierges jamais utilisés, 19 protéines ont été identifiées. De même, dans le tube nettoyé, 20 protéines ont été identifiées, dont 18 partagées entre les deux groupes (Figure 4C). En classant toutes les protéines en fonction de leur abondance, les protéines de kératine contaminantes KRT1, KRT9 et KRT10 sont les plus abondantes dans les deux groupes (figure 4D). Dans le tube nettoyé, une protéine EV caractéristique a été identifiée : la lactadhérine (MFGE8). Il y avait une grande similitude entre les tubes propres et les tubes vierges dans le nombre d’événements de séquençage MS2 déclenchés à chaque plage de temps de rétention de 5 minutes (Figure 4E), le nombre de peptides séquencés et la confiance dans laquelle ils ont été séquencés (Figure 4F), ainsi que le grand chevauchement entre les peptides (Figure 4G). Pris ensemble, ces résultats n’indiquent aucun impact perceptible de la réutilisation du tube avec ce protocole de nettoyage sur le protéome.
Le monomère du polycarbonate est de 254,3 MH1+, ce qui est inférieur à la plage d’acquisition MS1. Les chromatogrammes ont été évalués pour détecter la présence de dimères et de trimères chargés individuellement, qui n’ont pas été détectés (données non présentées, N = 4).
Figure 1 : Schéma du protocole de nettoyage du tube d’ultracentrifugation en polycarbonate. Abréviations : UC = ultracentrifugeuse ; SDS = dodécylsulfate de sodium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Comparaison représentative du protéome de l’échantillon EV précédent avec l'« échantillon fictif » du tube nettoyé (N = 2). Abréviations : EV = vésicule extracellulaire ; TIC-MS = chromatographie ionique totale-spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Comparaison des protéines identifiées dans l’échantillon EV par rapport à l’échantillon « fictif » obtenu à partir des tubes nettoyés. (A) Identifications des protéines par diagramme de Venn dans le protéome de l’échantillon EV précédent par rapport à l'« échantillon fictif » du tube nettoyé (N = 2). (B) Enrichissement différentiel des protéines partagées classées par variation logarithmique 2. Abréviation : EV = vésicule extracellulaire, FC = changement de pli Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Comparaison entre des tubes vierges jamais utilisés et des tubes nettoyés. (A) Un gel SDS-PAGE a été réalisé avec une courbe standard BSA de 1 μg à 16,5 ng, puis des granulés EV vierges et nettoyés en trois exemplaires. (B) Chromatogrammes représentatifs pour les tubes vierges et nettoyés. (C) Diagramme de Venn des protéines partagées ou uniques à partir de tubes vierges et nettoyés (N = 4). (D) Toutes les protéines identifiées dans chaque groupe classées en fonction de leur abondance pour (i) les tubes blancs et (ii) les tubes nettoyés. Les valeurs médianes sont tracées. (E) Histogramme de tous les événements MS2 déclenchés par temps de rétention, additionné par groupe (N = 4). (F) Nombre d’ID peptidiques dans chaque groupe par niveau de confiance, lorsque les peptides à confiance élevée sont distincts des peptides appariés intragroupes, lorsque le niveau de confiance de l’identification est plus faible mais renforcé par l’appariement à d’autres spectres, moyenne/ET. (G) Nombre de peptides uniques et partagés entre les groupes. Abréviations : EV = vésicule extracellulaire ; TIC-MS = chromatographie ionique totale-spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Protéines EV caractéristiques trouvées dans l’analyse pré versus post nettoyage de sonde UC. Abréviations : UC = ultracentrifugeuse ; EV = vésicule extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Ici, nous décrivons et validons un protocole de nettoyage des tubes UC en polycarbonate pour les applications d’enrichissement et de protéomique des VE. Nous avons démontré l’élimination réussie de la protéine résiduelle de l’échantillon de tube UC précédent par rapport à une analyse de pseudo-pastilles nettoyées en dessous de la limite de détection de ce protocole d’acquisition par spectrométrie de masse et montré la similitude protéomique d’un tube UC vierge jamais utilisé par rapport aux pseudo-pastilles de CU nettoyées.
Tout d’abord, pour éviter l’adsorption accidentelle de protéines sur la paroi interne du polycarbonate, les tubes UC ont été immédiatement immergés dans H2O10. Le lavage à la main des tubes en polycarbonate UC est recommandé par les fabricants11. D’autres détergents, tels que Lipsol, doivent être utilisés avec prudence. Il s’agit d’un détergent de laboratoire exclusif composé d’un mélange de détergents, de tensioactifs et d’agents chélateurs au pH non neutre. Par conséquent, pour cette étape, un détergent compatible avec la spectrométrie de masse, 0,1 % SDS, a été utilisé et le lavage n’a pas été effectué pendant plus de 10 min11. D’après notre expérience, l’utilisation d’outils de nettoyage des poils peut entraîner des rayures du tube si des précautions ne sont pas prises. Pour atténuer les rayures potentielles, qui pourraient fournir un réservoir de protéines résiduelles, un coton-tige a été utilisé pour essuyer l’intérieur du tube en polycarbonate, en mettant l’accent sur la zone de formation des granulés EV. L’autoclave répété peut réduire la durée de vie du tubeen polycarbonate 11 ; Au lieu de cela, trois brefs rinçages à l’eau chaude ont été effectués. Il convient également de noter que bien que les fabricants suggèrent des méthodes de stérilisation non thermiques, une température spécifique à éviter n’est pas décrite. Les tubes doivent toujours être inspectés pour détecter tout signe de déformation ou de fissuration avant d’être réutilisés, conformément aux recommandations des fabricants. Il n’est pas recommandé d’utiliser des substances inflammables à proximité de centrifugeuses en fonctionnement ; Ainsi, nous séchons les tubes pendant la nuit après l’étape finale de rinçage à l’éthanol à 70 %.
Aucune contamination significative par les polymères n’a été observée par l’évaluation manuelle des chromatogrammes. On ne s’attend pas à ce que le SDS dégrade le polycarbonate, et une brève exposition à l’eau chaude (<60 °C) n’a aucun effet, tandis qu’une exposition plus longue en a12. De plus, des études antérieures ont indiqué que les espèces de polycarbonate éluent à un temps de rétention avant la collecte basé sur notre gradient d’acétonitrile13. Bien que nous ne puissions pas être certains que les polymères ne sont pas présents, avec nos méthodes d’acquisition, nous sommes convaincus que le protéome n’est pas substantiellement affecté.
Lors de la réutilisation du matériel de laboratoire pour des expériences de protéomique sans marquage, les contaminants protéiques résiduels de l’utilisation précédente doivent être spécifiquement pris en compte. De plus, la protéomique des VE est souvent réalisée avec des échantillons à très faible rendement, produisant parfois des quantités de protéines de l’ordre de <100 ng. Ces quantités de protéines de départ conviennent à la spectrométrie de masse, mais augmentent considérablement l’impact que même de petites quantités de protéines résiduelles auront sur le protéome global. Compte tenu de la sensibilité du séquençage par spectrométrie de masse, les contaminants provenant de la manipulation humaine et de la fabrication seront identifiés. Dans ce protocole, nous montrons une réduction substantielle du nombre de protéines identifiées de 98% après le nettoyage. Les protéines restantes ont été presque exclusivement partagées entre les tubes vierges jamais utilisés et les tubes propres. Ces résultats suggèrent que les protéines identifiées étaient des contaminants provenant de la préparation protéomique elle-même ou des éléments résiduels de la fabrication de tubes, et non des résidus de l’utilisation précédente. De loin, les trois protéines les plus abondantes identifiées par ordre de grandeur dans les tubes vierges et nettoyés étaient la kératine humaine de type I (KRT1, KRT10, KRT9), présente dans les cheveux et la peau, généralement reconnue dans ces types de préparations comme des contaminants provenant de la manipulation humaine (https://www.thegpm.org/crap/). Neuf des 18 protéines partagées étaient d’autres kératines. La dermcidine (DCD), une protéine présente dans la sueur humaine14, est également incluse parmi les contaminants humains reconnus. D’autres protéines identifiées se retrouvent également dans l’épiderme (CSTA15, HRNR16, FLG217) ou précédemment identifiées dans les acariens (S100A7, S100A8, S100A9)18,19. Il convient de noter qu’un composant important de la « poussière » est la peau humaine20. Les deux protéines uniques identifiées dans les tubes nettoyés ont toutes deux été impliquées dans les VE, mais sont très mineures par rapport aux autres protéines EV identifiées 1,21. Les protéines identifiées dans les échantillons sont cohérentes avec la préparation et indiquent un chevauchement très clair entre les tubes vierges et nettoyés, ce qui favorise la réutilisation.
Les VE jouent un rôle important dans les processus biologiques, y compris, mais sans s’y limiter, la communication entre cellules et la formation de minéralisations biologiques. Les VE sont omniprésentes dans le corps humain et constituent un domaine de la science fondamentale en plein essor en raison de leur potentiel en tant que biomarqueurs, thérapeutiques et sources d’information concernant la (patho)physiologie. L’enrichissement de ces particules à des fins d’expérimentation à l’aide de la CU différentielle implique des tubes en polycarbonate spécialisés. L’utilisation et l’élimination uniques de ces thermoplastiques contribuent à l’augmentation des coûts des consommables expérimentaux et du fardeau mondial de la pollution plastique. Dans ce document, nous avons présenté et validé un protocole de nettoyage et de réutilisation des tubes UC en polycarbonate pour effectuer une isolation EV adaptée aux expériences de protéomique. En fin de compte, cela réduira les déchets produits par les laboratoires de véhicules électriques et réduira les coûts associés à de telles expériences.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche des National Institutes of Health grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 et R01HL136431, de Kowa Company, Ltd. et du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 101023041 (R. Cahalane). La figure 1 a été créée avec Biorender.com. Le protocole de nettoyage actuel a été élaboré en modifiant un protocole de nettoyage des tubes recommandé présenté lors de la Journée de l’éducation 2023 de la Société internationale des vésicules extracellulaires (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). Un grand merci à la Dre Kathryn Howe et à la Dre Sneha Raju du Réseau universitaire de santé (Université de Toronto, Canada) pour les échantillons originaux de tissu carotidien EV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
| 10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
| an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
| Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
| Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
| Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
| MilliQ water | water | ||
| PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
| Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
| SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
| Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |
References
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