肠神经系统谱系与人多能干细胞的分化
Summary
从人类多能干细胞 （hPSC） 中提取肠道神经系统 （ENS） 谱系为研究 ENS 发展和疾病以及用于再生医学提供了可扩展的细胞来源。在这里，提出了使用化学定义的培养条件从 hPSC 获得肠道神经元的详细 体外 方案。
Abstract
人类肠道神经系统 （ENS） 是一个由神经胶质和神经元细胞类型组成的大型网络，具有显著的神经递质多样性。ENS 控制肠道蠕动、酶分泌和营养吸收，并与免疫系统和肠道微生物组相互作用。因此，ENS 的发育和获得性缺陷是导致许多人类疾病的原因，并可能导致帕金森病的症状。动物模型系统和对原代组织的访问的限制对人类 ENS 的研究构成了重大的实验挑战。在这里，提出了一个详细的方案，用于使用确定的培养条件从人多能干细胞 hPSC 中有效 体外衍生 ENS 谱系。我们的方案从 hPSC 在 15 天内定向分化为肠神经嵴细胞开始，并在 30 天内产生多种功能性肠道神经元亚型。该平台为发育研究、疾病建模、药物发现和再生应用提供了可扩展的资源。
Introduction
肠神经系统 （ENS） 是周围神经系统中最大的组成部分。ENS 包含超过 4 亿个神经元，这些神经元位于胃肠道内，几乎控制着肠道的所有功能1。对肠道神经病中 ENS 发育和功能及其缺陷的分子理解需要获得可靠和真实的肠道神经元来源。对人体原代组织的访问是有限的，动物模型无法概括许多肠道神经病中的关键疾病表型。事实证明，人类多能干细胞 （hPSC） 技术在提供所需细胞类型的无限来源方面非常有益，尤其是那些难以从主要来源中分离的细胞类型 2,3,4,5,6,7。在这里，我们提供了从 hPSC 获得 ENS 培养物的逐步和稳健的体外方法的详细信息。这些可扩展的 hPSC 衍生培养物为发育研究、疾病建模和高通量药物筛选开辟了途径，并且可以为再生医学提供可移植细胞。
肠道神经元谱系来源于胚胎发生过程中遵循 ENS 发育路径的神经嵴 （NC） 细胞。在胚胎中，NC 细胞沿着折叠神经板的边缘出现。它们增殖、迁移并产生许多不同的细胞类型，包括感觉神经元、雪旺细胞、黑色素细胞、颅面骨骼和肠道神经元以及神经胶质细胞 8,9,10。细胞命运的决定取决于 NC 细胞出现的前后轴的不同区域，即颅 NC、迷走神经 NC、躯干 NC 和骶部 NC。ENS 由迷走神经和骶部 NC 细胞发展而来，前者由于沿肠道长度的广泛迁移并定植于肠道，因此在肠道神经元群中占主导地位11。
从 PSC 衍生的 NC 细胞通常涉及双重 SMAD 抑制和 WNT 通路激活的组合12,13。直到最近，所有 NC 诱导方案都涉及培养条件下的血清和其他动物产品添加剂。化学上未定义的培养基不仅降低了 NC 诱导的可重复性，而且还挑战了机制发育研究。为了克服这些挑战，Barber 等人14 使用化学定义的培养条件开发了一种 NC 诱导方案，因此优于依赖血清替代因子（例如 KSR）的替代方法13,14。这是通过基础培养基更换和优化最初由 Fattahi 等人提出的从 hPSC 衍生肠道 NC 细胞的方案获得的。这种改进的系统是此处介绍的 hPSC 分化方案的基础。它首先通过在视黄酸 （RA） 之外精确调节 BMP、FGF、WNT 和 TGFβ 信号转导，在 15 天内诱导肠神经嵴 （ENC） 细胞。然后，我们通过用神经胶质细胞系衍生的神经营养因子 （GDNF） 处理细胞来获得 ENS 谱系。所有培养基成分均经过化学成分确定，可在 30-40 天内产生稳健的肠道神经元培养物。
除了此处描述的单层细胞培养系统外，还开发了使用自由浮动胚状体的替代 NC 诱导方法15,16。这些培养物中的迁移细胞已被证明表达 NC 标志物，其中亚群代表迷走神经 NC。与原代肠道组织共培养物已用于富集这些培养物中的肠道 NC 前体。这些研究中的培养基成分包含不同因素的组合，例如神经生长因子、NT3 和脑源性神经营养因子。在这个阶段，尚不完全清楚这些因素如何影响肠道神经元前体定型。为了有效比较单层和基于胚状体的培养物中的肠道 NC 诱导，需要更多数据。鉴于这些策略中的不同培养布局，应考虑每种方法的使用，并根据具体应用进行优化。
此处介绍的方案是可重复的，并且已由我们和其他人使用不同的 hPSC（诱导和胚胎）细胞系成功测试8,14,16。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处描述的分化方案提供了一种强大的体外方法，可在 30-40 天内从 hPSC 获得肠道神经元（图 1E）和在较老的培养物中表达神经胶质纤维酸性蛋白、GFAP 和 SOX10 的肠胶质细胞（>第 55 天）13、14、19、22。这些神经元和神经胶质细胞是通过 hPSC 逐步分化为迷走神经和肠神经嵴?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 UCSF 突破性生物医学研究和桑德勒基金会的资助，March of Dimes 资助号 1-FY18-394 和 1DP2NS116769-01，NIH 主任新创新者奖 （DP2NS116769） 给 F.F. 和国家糖尿病、消化和肾脏疾病研究所 （R01DK121169） 给 F.F.，HM 得到了 Larry L. Hillblom 基金会博士后奖学金的支持， NIH T32-DK007418 奖学金和 UCSF 突破性生物医学研究计划独立博士后奖学金。
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
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