Summary
Een stapsgewijs protocol voor het vervaardigen van streptavidine-affiniteitsroosters wordt geleverd voor gebruik in structurele studies van uitdagende macromoleculaire monsters door cryo-elektronenmicroscopie.
Abstract
Streptavidine-affiniteitsroosters bieden strategieën om veel voorkomende uitdagingen op het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) monstervoorbereiding te overwinnen, waaronder monsterdenaturatie en voorkeursoriëntaties die kunnen optreden als gevolg van de lucht-waterinterface. Streptavidine-affiniteitsroosters worden momenteel echter door weinig cryo-EM-laboratoria gebruikt omdat ze niet in de handel verkrijgbaar zijn en een zorgvuldig fabricageproces vereisen. Tweedimensionale streptavidinekristallen worden gekweekt op een gebiotinyleerde lipidemonolaag die rechtstreeks wordt aangebracht op standaard holey-carbon cryo-EM-roosters. De interactie met hoge affiniteit tussen streptavidine en biotine maakt het mogelijk om vervolgens gebiotinyleerde monsters te binden die tijdens de cryo-EM-monstervoorbereiding worden beschermd tegen de lucht-waterinterface. Bovendien bieden deze roosters een strategie voor het concentreren van monsters die in beperkte hoeveelheden beschikbaar zijn en het zuiveren van eiwitcomplexen die van belang zijn, direct op de roosters. Hier wordt een stapsgewijs, geoptimaliseerd protocol geboden voor de robuuste fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters voor gebruik in cryo-EM- en negatieve-kleuringsexperimenten. Daarnaast is er een gids voor het oplossen van problemen opgenomen voor veelvoorkomende uitdagingen om het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters toegankelijker te maken voor de grotere cryo-EM-gemeenschap.
Introduction
Elektronencryomicroscopie (cryo-EM) heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van structurele biologie door macromoleculaire structuurbepaling mogelijk te maken van grote, flexibele en heterogene monsters die voorheen ontoegankelijk waren door röntgenkristallografie of nucleaire magnetische resonantie1. Deze methode werkt door macromoleculen in oplossing snel te bevriezen om een dunne laag glasachtig ijs te creëren die vervolgens kan worden afgebeeld met een elektronenmicroscoop. In de afgelopen jaren hebben aanzienlijke vorderingen in zowel microscoophardware als beeldverwerkingssoftware de soorten monsters die geschikt zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryo-EM verder uitgebreid.
Niettemin blijft de bereiding van dunne, verglaasde monsters een van de meest kritische stappen in de bepaling van de macromoleculaire structuur door cryo-EM. Biologische monsters zijn vaak dynamisch, kwetsbaar, vatbaar voor denaturatie en soms alleen in kleine hoeveelheden beschikbaar voor cryo-EM-onderzoeken. Tijdens het blottingproces interageren deze deeltjes met de hydrofobe lucht-waterinterface, wat kan resulteren in deeltjesvoorkeursoriëntaties, demontage van fragiele complexen, gedeeltelijke of volledige denaturatie van monsters en aggregatie 2,3,4. Het gebruik van detergenten of andere oppervlakteactieve stoffen, chemische verknoping en adsorptie van monsters om lagen te ondersteunen, zijn veelgebruikte strategieën om biologische monsters tijdens het invriesproces te bewaren. Steunlagen zoals grafeenoxide 5,6,7 of amorfe koolstof8 functioneren ook om deeltjes op het rooster te concentreren door adsorptie wanneer het monster in beperkte hoeveelheden beschikbaar is. Deze methoden zijn echter niet algemeen of betrouwbaar, en optimalisatie van de netvoorbereiding kan extreem tijdrovend zijn of helemaal mislukken.
Streptavidine affiniteitsroosters 9,10 werden ontwikkeld om deze tekortkomingen te verhelpen en om een milde en algemeen toepasbare methode te bieden om het complex van belang te sekwestreren en te beschermen tegen het lucht-watergrensvlak. Deze roosters maken gebruik van een tweedimensionaal (2D) streptavidine-kristalrooster dat wordt gekweekt op een monolaag van gebiotinyleerde lipiden op het rooster. Nadat monsters zelf zijn gebiotinyleerd (vaak spaarzaam en willekeurig, wat betekent dat er gemiddeld één biotine per complex is), kunnen ze worden aangebracht op het met streptavidine beklede rooster. Omdat monsteradsorptie afhankelijk is van de extreem hoge affiniteit tussen streptavidine en biotine, kunnen monsterconcentraties van slechts 10 nM met deze roosters worden gebruikt. In de handel verkrijgbare biotinylatiekits voor eiwitten en gebiotinyleerde primers voor DNA-bevattende complexen maken het relatief eenvoudig om de nodige biotinegroepen aan de meeste interessante monsters te hechten. Naast het concentreren van het monster en het weghouden van het schadelijke lucht-watergrensvlak tijdens het deppen, kan de willekeurige biotinylering van een of slechts enkele lysineresiduen het bereik van oriëntaties van het betreffende molecuul op het cryo-EM-rooster aanzienlijk verbeteren, zoals aangetoond in een aantal onderzoeken11. Hoewel het signaal van het onderliggende streptavidinkristal aanwezig is in de onbewerkte beelden, kunnen gegevensverwerkingsschema's met Fourier-filtratie van de scherpe Bragg-reflecties van het kristal gemakkelijk worden verwijderd tijdens vroege gegevensverwerking, waardoor uiteindelijk reconstructies met hoge resolutie van het monster van belang mogelijk worden 11,12,13. Hier wordt een geoptimaliseerd, stapsgewijs protocol geleverd voor een robuuste productie van streptavidine-affiniteitsroosters en vervolgens gebruik in cryo-EM-experimenten. Het verstrekte protocol zal naar verwachting over een periode van 2 weken worden voltooid (figuur 1A). De eerste delen van het protocol beschrijven de bereiding van reagentia, de voorbehandeling van roosters en de eerste stappen van koolstofverdamping. Vervolgens worden instructies beschreven voor de bereiding van de lipide monolaag en de groei van streptavidinekristallen op EM-roosters. Daarnaast worden instructies gegeven voor het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters in EM- en cryo-EM-experimenten met negatieve kleuring. Ten slotte zijn er procedures voorzien voor het verwijderen van streptavidine-signalen uit microfoto's zodra cryo-EM-gegevens zijn verkregen.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Verdun commercieel gekochte streptavidine tot een eindconcentratie van 0,5 mg/ml in kristallisatiebuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). Zorg ervoor dat de uiteindelijke trehaloseconcentratie 10% is. Vries aliquots van 25-50 μl in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.
- Los 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(biotinyl)natriumzout op in 65:35:8 v/v/v chloroform/methanol/wateroplosmiddel voor een uiteindelijke lipideconcentratie van 1 mg/ml. Bewaar aliquots voor eenmalig gebruik van 20-30 μl bij -80 °C in glazen injectieflacons.
OPMERKING: De bereiding van het oplosmiddel is nauwkeuriger als het op gewicht wordt gedaan. Combineer eerst 1,85 g ultrapuur water met 6,41 g methanol van HPLC-kwaliteit en voeg dit toe aan 22,42 g chloroform om het oplosmiddel te bereiden.
LET OP: Lees en begrijp de veiligheidsinformatiebladen van de fabrikant en de aanbevolen instructies voor het hanteren en verwijderen van chloroform en methanol organische oplosmiddelen voordat u met dit protocol begint. Vermijd direct contact van methanol met de huid.
2. Voorbehandeling van roosters
- Was koolstoffolie op gouden gaasroosters door twee keer in 100% chloroform en één keer in 100% ethanol te dompelen. Leg de roosters op schoon filtreerpapier om te drogen. Herhaal het wasproces voor in totaal drie cycli.
OPMERKING: Reproduceerbaar succes is behaald met in de handel verkrijgbare koolstoffolieroosters met een koolstoffilm van 10-12 nm dikke koolstof (zie materiaallijst) met gatgroottes variërend van 0,6-2 μm. In de handel verkrijgbare roosters van goudfolie en zelfgemaakte holey-koolstofroosters die volgens het nanofabricageprotocol14 van het Rubinsteinlaboratorium zijn voorbereid, zijn ook met succes gebruikt. Minder reproduceerbare resultaten zijn verkregen met in de handel verkrijgbare roosters met dunnere koolstoffilms. Gebruik geen koperen roosters, omdat koper reageert met organische amines die zich in het monster kunnen bevinden. - Nadat de roosters zijn opgedroogd, verdampt u een 2,5-5 nm dikke laag koolstof op de koolstofzijde van de koolstofroosters. De koolstofdikte wordt geregeld met een meting van de dikte van de kwartskristalfilm die is ingebouwd in de koolstofverdamper in het bestand Materiaaltabel .
- Laat de nieuw verdampte koolstof gedurende 1 week verouderen (d.w.z. meer hydrofoob worden).
3. Bereiding van streptavidinerooster
OPMERKING: Om 2D-streptavidinekristallen op de holey-koolstof EM-roosters te laten groeien, wordt eerst een gebiotinyleerde lipide-monolaag aangebracht op de gaten van de koolstoffilm (Figuur 1B) door middel van Langmuir-Schaefer-overdracht. De lipide monolaag wordt gevormd na de volgende stappen (figuur 2). Talkpoeder creëert een grens tussen de ricinusolie en de petrischaal, en een dunne laag ricinusolie helpt om een constante oppervlaktedruk te behouden wanneer de lipidemonolaag wordt gevormd. De kant met de verdampte koolstof uit stap 2.2 wordt gebruikt om de monolaag op te nemen, overtollige lipiden worden weggespoeld met kristallisatiebuffer en streptavidine-oplossing wordt op het rooster geïncubeerd voor kristallisatie.
- Reinig de werkbank met 70% ethanol.
- Spoel een glazen spuit van 5 μL meerdere keren met chloroform om schoon te maken. Laat de spuit volledig drogen voor gebruik.
- Was koolstofverdampte roosters opnieuw, d.w.z. vlak voor gebruik, door ze in 100% ethanol te dompelen. Laat de roosters drogen op schoon filtreerpapier.
- Terwijl de roosters drogen, wast u elk anti-capillair pincet met 100% chloroform en 100% ethanol. Laat het pincet volledig drogen.
- Bereid aan de schone kant van parafilm drie druppels kristallisatiebuffer van 50 μl (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) voor elk rooster dat wordt gemaakt.
- Vul het deksel van een 35 mm ongecoate petrischaal met kristallisatiebuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose). Reinig het oppervlak met lenspapier.
- Strooi talkpoeder van wetenschappelijke kwaliteit rond de omtrek van de petrischaal. Dit dient vervolgens als indicator, in de volgende stap, van hoe ver de ricinusolie zich heeft verspreid. Voeg voldoende talkpoeder toe om een barrière te creëren die de ricinusolie beschermt tegen het aanraken van de rand van de petrischaal. Het toevoegen van te veel talkpoeder beperkt de beschikbare ruimte om de lipide monolaag te maken.
- Doop een pipetpunt van 200 μl in de ricinusolie om een middelgrote druppel (ongeveer 20 μl) te verkrijgen die aan de pipetpunt hangt. Raak deze druppel aan op het oppervlak van de buffer in de petrischaal, waar deze zich zal verspreiden om een uniforme film te vormen. De resulterende dunne oliefilm dient als een zuiger15, die een constante oppervlaktedruk handhaaft wanneer een lipide monolaag wordt gevormd (stap 3.10).
OPMERKING: Het is belangrijk om voldoende ricinusolie toe te voegen in plaats van te weinig, en het is beter om als één druppel toe te voegen. Laat de ricinusolie zich volledig verspreiden voordat u de lipide monolaag maakt. - Spoel de glazen spuit van 5 μl een of twee keer met het opgeloste lipide voordat u een aliquot voor gebruik opneemt. Voorkom het ontstaan van luchtbellen in het lipide dat de spuit vult.
OPMERKING: De glazen spuit wordt gespoeld met opgeloste lipiden voor het geval er chloroform achterblijft van stap 3.2. Resterende chloroform kan de kwaliteit van de resulterende monolaag beïnvloeden. - Doseer het kleinst mogelijke volume (~0,5 μL) lipide uit de spuit en raak de hangende druppel voorzichtig aan op het oppervlak van de ricinusoliefilm. Merk op dat de lipide-oplossing op het contactpunt door de ricinusoliefilm breekt en dat de resulterende lipidemonolaag een cirkel vormt in het midden van de dunne film ricinusolie.
- Voeg achtereenvolgens enkele druppels lipide toe of voeg meer lipide toe na het maken van enkele roosters, maar als er te veel wordt toegevoegd, zal het lipide zich verspreiden voorbij de grens van de ricinusolie en in de omtrek waar het talkpoeder en eventuele verontreinigende oppervlakteactieve stof zijn afgezonderd. Als dit gebeurt, moet het proces opnieuw worden gestart.
- Pak een rooster op met een anti-capillair pincet zodat de rechte arm van het pincet en de met koolstof verdampte kant van het rooster beide naar de monolaag zijn gericht.
- Breng een deel van de monolaag over naar de holle koolstof door de met koolstof verdampte kant van het rooster gedurende 1-2 s tegen de monolaag aan te raken.
OPMERKING: Een succesvolle overdracht wordt aangegeven door het hydrofiele oppervlak van het rooster, waardoor een dunne, bolvormige bufferkap het hele rooster bedekt nadat het van de petrischaal is getild. - Raak de bolvormige dop van de buffer die nu achtereenvolgens gedurende 1 s aan het rooster hecht aan de drie druppels kristallisatiebuffer van 50 μL die in stap 3.5 op parafilm zijn voorbereid.
OPMERKING: In deze stap wordt geprobeerd zoveel mogelijk van het overtollige lipide te verwijderen, dat het oppervlak van de bolvormige dop bedekt (in plaats van de voorheen hydrofobe koolstoffilm), om de vorming van lipideblaasjes te voorkomen wanneer monsters in de elektronenmicroscoop worden bekeken. - Voeg voorzichtig 4 μL 0,5 mg/ml streptavidine toe aan de resterende bolvormige dop van de kristallisatiebuffer op het rooster.
- Plaats het rooster in een vochtigheidskamer. Herhaal stap 3.11-3.14 voor de hele batch roosters.
- Incubeer de roosters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) in een vochtigheidskamer om verdamping te voorkomen.
OPMERKING: Het is belangrijk dat de gouden kant van het rooster op geen enkel moment nat wordt nadat de monolaag is aangebracht. - Bereid na de incubatie van 2 uur een druppel spoelbuffer van 300 μl (10 mM HEPES, pH 7,5, 50 mM KCl, 5 mM EDTA, 10% trehalose) voor elk rooster op de schone kant van de parafilm.
OPMERKING: De spoelbuffer bevat 50 mM KCl in plaats van 150 mM KCl, die zich in de kristallisatiebuffer bevindt die wordt gebruikt voor stappen 3.5-3.6. - Was het overtollige (ongebonden) streptavidine door het rooster op de druppel spoelbuffer van 300 μL te leggen. Voer stap 3.18-3.20 uit voor één raster tegelijk. Laat de roosters niet gedurende langere tijd op de spoelbufferdruppel van 300 μl staan.
OPMERKING: Er wordt slechts één wasbeurt uitgevoerd omdat het streptavidinekristal/de monolaag op dit punt kwetsbaar is. Elke keer dat een rooster van het oppervlak van een druppel wasbuffer wordt getild, wordt de vloeistofbrug tussen het rooster en de wasdruppel gescheurd. Op het moment van breuk wordt een voorbijgaande drukgradiënt (zuigdruk) toegepast op de zelfdragende monolaagkristallen die de open gaten van de koolstoffilm overspannen. Deze zuigdruk zal naar verwachting een tijdelijke doming van het monolaagkristal veroorzaken, vergezeld van uitzetting van het gebied dat door de kristallen wordt bedekt. Als de toename van het oppervlak de elastische limiet van het kristal overschrijdt, kan het kristal breken of ontregeld raken. - Droog het anticapillaire pincet onmiddellijk af met een pluisvrij doekje om het loslaten van het rooster op filtreerpapier in de volgende stap te vergemakkelijken. Pak het rooster dat op de druppel spoelbuffer drijft op door de geknikte arm van het anti-capillaire pincet in de druppel te steken.
- Dep de overtollige buffer voorzichtig vanaf de zijkant weg met filtreerpapier. Leg het rooster op filtreerpapier met de gouden kant naar beneden, herhaal stap 3.18-3.20 voor elk rooster en laat de roosters 15-20 minuten drogen.
- Nadat de roosters droog zijn, draai je ze om zodat de gouden kant nu naar boven wijst. Verdamp een dun laagje koolstof (ongeveer 0,5-2 nm dik) op de gouden kant van de roosters.
OPMERKING: Bewaar roosters bij een constante luchtvochtigheid, waarvan de waarde er niet toe lijkt te doen, waarbij wordt opgemerkt dat meerdere veranderingen in de relatieve vochtigheid naar verwachting zullen resulteren in cycli van uitzetting en krimp. Laat roosters 1 week verouderen voordat ze cryo-EM gebruiken voor het beste resultaat, omdat de hydrofobiciteit van de achterkant van het rooster belangrijk kan zijn voor de stabiliteit van de monolaag. Roosters zijn gedurende lange tijd stabiel, maar na 3 maanden kan de koolstof aan de achterkant minder hydrofoob worden.
4. Controle van de batchkwaliteit van het streptavidine-affiniteitsraster door negatieve vlek
- Bereid twee druppels van 50 μl en één druppel van 100 μl monsterbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) op de schone kant van de parafilm.
- Verwijder de trehalose en rehydrateer streptavidineroosters door de twee druppels van 50 μl aan te raken en laat het rooster gedurende 10 minuten op de druppel monsterbuffer van 100 μl drijven.
OPMERKING: Het is het beste om het gebruik van wasmiddel te vermijden tijdens de rehydratatie en de daaropvolgende monsterbindende incubaties. De buffer verspreidt zich naar de gouden kant van de roosters en beperkt de efficiëntie van wasbeurten om overtollige monsters te verwijderen. - Pak na het rehydrateren het rooster op met een anti-capillaire pincet zodat de geknikte arm van de anti-capillaire pincet in de druppel zit.
- Dep de overtollige buffer voorzichtig weg van de zijkant en breng snel opnieuw 4 μL 75-100 nM monster aan (optioneel).
NOTITIE: Laat het rooster niet drogen na rehydratatie. - Incubeer het monster gedurende 1-5 minuten in een vochtigheidskamer.
OPMERKING: Concentratie- en incubatietijden zijn afhankelijk van het monster en moeten worden geoptimaliseerd. De opgegeven monsterconcentratie en incubatietijd zijn voorgestelde uitgangspunten. - Aan de schone kant van parafilm plaatst u vier druppels van elk 30 μL van zowel monsterbuffer als 1% uranylformiaat (UF)-kleuring.
NOTITIE: Lees en begrijp de veiligheidsinformatiebladen van de fabrikant en de aanbevolen instructies voor het hanteren en verwijderen van uranylformiaat voordat u deze stap uitvoert. Uranylformiaat is een giftige en radioactieve verbinding. Zorg ervoor dat u vooraf institutionele goedkeuring krijgt voor het gebruik van radioactief materiaal. - Spoel het ongebonden monster weg door elk van de vier druppels monsterbuffer aan te raken.
- Kleurs het monster met behulp van standaard negatieve kleuringsprocedures met UF. Dep de UF-vlek voorzichtig weg vanaf de zijkant, zodat er een zeer dikke laag vlek op het rooster achterblijft. Na het deppen kan nog eens 0,5 μL beits op het rooster worden aangebracht om de vlek indien nodig dikker te maken. Laat het rooster aan de lucht drogen.
OPMERKING: Aangezien de streptavidineroosters zeer hydrofiel zijn, heeft negatieve vlek de neiging om overal een zeer uniforme film te vormen, in tegenstelling tot wat vaak wordt gezien bij het gebruik van met gloeiontlading behandelde, continue koolstofroosters. Daarom wordt aanbevolen om een dikkere film vlekoplossing achter te laten.
5. Invriezen van streptavidine-affiniteitsroosters met gebiotinyleerde monsters
OPMERKING: De volgende procedure is bedoeld voor een eenzijdige geautomatiseerde plunjer die een interne blottingsensor bevat (eenzijdig handmatig blotting in andere geautomatiseerde insteekapparatuur is ook mogelijk)
- Bereid twee druppels van 50 μL en één druppel van 100 μL monsterbuffer (bijv. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP) op de schone kant van de parafilm.
- Rehydrateer streptavidineroosters door de twee druppels van 50 μl aan te raken en laat het rooster gedurende 10 minuten op de druppel van 100 μl monsterbuffer drijven.
- Pak na het rehydrateren het rooster op met een anti-capillaire pincet zodat de geknikte arm van de anti-capillaire pincet in de druppel zit.
- Dep de overtollige buffer voorzichtig weg van de zijkant en breng snel 4 μL 75-100 nM monster aan.
- Incubeer het monster gedurende 1-5 minuten in een vochtigheidskamer.
OPMERKING: Nogmaals, de concentratie- en incubatietijden zijn afhankelijk van het monster en moeten worden geoptimaliseerd. De opgegeven monsterconcentratie en incubatietijd zijn voorgestelde uitgangspunten. Voor monsters met lage concentraties kan men langere tijd incuberen en/of het monster meerdere keren aan de roosters binden. - Bereid twee druppels van 10 μL bevriezingsbuffer (bijv. 50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalose, 0,01% NP40) aan de schone kant van de parafilm. Was het ongebonden monster na incubatie door het rooster aan te raken met de eerste druppel van de vriesbuffer. Laat het rooster op de tweede druppel van de vriesbuffer vallen.
- Pak snel de rand van het rooster vast met het pincet dat aan de eenzijdige geautomatiseerde plunjer is bevestigd. Dep de overtollige buffer voorzichtig weg en breng snel 4 μL vriesbuffer (50 mM HEPES pH 7,5, 50 mM KCl, 0,5 mM TCEP, 3% trehalose, 0,01% NP40) aan op het rooster.
- Bevestig een pincet aan de eenzijdige automatische plunjer. De beste resultaten zijn verkregen met behulp van een vleksensor die de vloeistofdruppel op het rooster detecteert met een vlektijd tussen 4-6 s. De omstandigheden zijn afhankelijk van het gebruikte monster en de gebruikte buffer.
6. Gegevensverwerking van cryo-EM-films verzameld uit streptavidine-affiniteitsroosters
Het verzamelen van gegevens op streptavidine-affiniteitsroosters kan worden uitgevoerd zoals bij standaardroosters, en er zijn geen speciale microscoopaanpassingen nodig. De hier beschreven procedure verwijdert het streptavidine-signaal echter pas na bewegingscorrectie van de microfoto. Daarom kunnen gegevensverwerkingsstappen zoals het polijsten van deeltjes die afhankelijk zijn van originele filmframes niet betrouwbaar worden uitgevoerd. De aftrekking van het streptavidinesignaal (vereist voor alle standaard downstream-verwerking, behalve voor CTF-schatting) vereist hier Matlab-versie R2014b of nieuwer die op een Linux-omgeving draait. Signaalaftrekking is afhankelijk van de kristallijne aard van de streptavicinelaag, die piekmaskering mogelijk maakt en dus signaalverwijdering van de Fouriertransformatie van elke microfoto.
- Instellen van de verwerkingsscripts
- Kopieer alle bestanden van Supplemental Files naar een speciale map in de projectmap
- Bereid een map met de naam processing_scripts voor die de volgende bestanden bevat:
lsub.m (Supplemental Coding File 1; het aftrekscript)
process_subtration.sh (Supplemental Coding File 2; wrapper-script dat alle beschikbare microfoto's doorloopt, parallelle taken voortbrengt en de invoer en uitvoer bijhoudt)
process_subtraction.cfg (Supplemental Coding File 3; configuratiebestand dat de parameters voor de aftrektaak bevat, zie 6.2) - Bereid een map met de naam support_scripts voor die de volgende bestanden bevat:
bg_drill_hole.m (aanvullend coderingsbestand 4)
bg_FastSubtract_standard.m (aanvullend coderingsbestand 5)
bg_Pick_Amp_masked_standard.m (aanvullend coderingsbestand 6)
bg_push_by_rot.m (aanvullend coderingsbestand 7)
ReadMRC.m (aanvullend coderingsbestand 8)
WriteMRC.m (aanvullend coderingsbestand 9)
WriteMRCHeader.m (aanvullend coderingsbestand 10)
- Pas het configuratiebestand indien nodig aan (process_subtraction.cfg, (zie afbeelding 3):
- Invoer: Pad naar de map met de bewegingsgecorrigeerde microfoto's in mrc-formaat. Gebruik een directory of een patroon met jokertekens (?, *).
Voorbeeld:
input="/pad/naar/project_directory/microfoto's/"
of
input="/pad/naar/project_directory/microfoto's/*.mrc" - output_dir: Pad naar de directory waarnaar de afgetrokken microfoto's van het rooster moeten worden geschreven.
- only_do_unfinished: Geef aan (waar|onwaar) of reeds bestaande afgetrokken microfoto's moeten worden overschreven of overgeslagen. Deze parameter is handig voor het starten van het script voor het aftrekken van het rooster in het midden van een microscoopsessie (standaard: true).
- num_parallel_jobs: Geef het aantal parallelle taken op. Dit aantal is afhankelijk van de hardwarespecificaties die voor de verwerking worden gebruikt en mag niet hoger zijn dan het aantal beschikbare cores. Op systemen met 32 cores en een netwerkbestandssysteem werden optimale prestaties bereikt met 14 parallelle taken. Voor de beste prestaties optimaliseert u deze waarde met een subset van microfoto's.
- Pad_Origin_X: 200 voor een K3-detector in staande oriëntatie (beeldbreedte < beeldhoogte) of bij gebruik van een vierkante detector (Falcon III, Falcon IV, K2), 1000 voor een K3-detector in liggende oriëntatie (beeldbreedte > beeldhoogte). FFT wordt uitgevoerd in vierkante dozen en opvulling is vereist als de detector niet-vierkante afmetingen heeft.
- Pad_Origin_Y: 1000 voor een K3-detector in staande oriëntatie (beeldbreedte < beeldhoogte), 200 bij gebruik van een vierkante detector (Falcon III, Falcon IV, K2) of bij gebruik van een K3-detector in liggende oriëntatie (beeldbreedte > beeldhoogte).
- Verander de Inside_Radius_Ang (90) en Outside_Radius_Ang (3.0) niet. De roosteraftrekking wordt uitgevoerd tussen twee resoluties (eenheid is in angstrom).
- Pixel_Ang: Geef de pixelgrootte op als een drijvendekommawaarde.
- Drempelwaarde: Aftrekdrempelwaarde om het rooster te vervangen door de achtergrond in de Fourierruimte. Succesvol gebruikte waarden liggen tussen 1,4-1,6. Gebruik 1.42 als uitgangspunt.
- Verander expand_pixel (10) en pad_out_opt (0) niet. expand_pixel is een diameterwaarde die wordt gebruikt voor het maskeren van pixels met waarden die hoger zijn dan de drempelwaarde. pad_out_opt is een optie die bepaalt of een gewatteerd gebied wordt opgenomen in de uitvoer.
- addpath_m: Pad naar de ondersteuningsscripts.
- path_to_matlab_bin: Pad naar de Matlab-installatiemap van het systeem.
- path_matlab_script: Pad naar het matlab substractiescript (lsub.m ) dat hierboven is gekopieerd onder stap 6.1.2.
- Invoer: Pad naar de map met de bewegingsgecorrigeerde microfoto's in mrc-formaat. Gebruik een directory of een patroon met jokertekens (?, *).
- Nadat u het gewijzigde script hebt opgeslagen, voert u het script uit (bash ./process_subtraction.sh ) om het streptavidinsignaal af te trekken van de invoermicrofoto's. Het script kan worden onderbroken en/of opnieuw worden gestart als de parameter only_do_unfinished is ingesteld op true (zie stap 6.2.3). Als er een fout optreedt, controleert u de parameters die zijn opgegeven in het bash-script. Zorg ervoor dat er geen onbedoelde spaties zijn tussen parametervariabelen en hun toegewezen waarden, aangezien dit een veelvoorkomende bron van fouten is.
- Gebruik de in het rooster afgetrokken afbeeldingen voor standaard cryo-EM-beeldverwerking.
Representative Results
Na de koolstofverdamping in stap 3.21 (meestal na een week) kunnen streptavidinaffiniteitroosters worden gebruikt voor de voorbereiding van cryo-EM- of negatieve-kleurstofmonsters volgens de procedures beschreven in stap 4 en 5. Een representatieve microfoto gemaakt met behulp van een K3-detector op een titaan Krios met een vergroting van 81.000x met een pixelgrootte van 1,05 Å van een gebiotinyleerd monster ingevroren met streptavidine-affiniteitsroosters wordt weergegeven in figuur 4A. Succesvolle roostervorming wordt waargenomen door het continue rasterpatroon dat op de achtergrond van het beeld verschijnt. Dit kan gemakkelijker worden waargenomen door het diffractiepatroon dat verschijnt in de snelle Fouriertransformatie (FFT) die wordt weergegeven in figuur 4A (rechts). Na het verzamelen van gegevens, volgens de procedure beschreven in stap 6 van dit protocol, kan het signaal dat door het streptavidinrooster aan het beeld wordt bijgedragen, computationeel worden gemaskeerd om een afgetrokken microfoto te produceren (Figuur 4B) die kan worden gebruikt voor volgende gegevensverwerkingsstappen. De FFT in figuur 4B (rechts) laat zien dat het diffractiepatroon dat in figuur 4A (rechts) is waargenomen, met succes uit de oorspronkelijke afbeelding is verwijderd.
Figuur 4C toont een voorbeeld van een microfoto gemaakt met een Tecnai 12-microscoop bij een vergroting van 49.000x met een pixelgrootte van 1,6 Å van een gebiotinyleerd monster gebonden aan streptavidine-affiniteitsroosters en negatief gekleurd met behulp van uranylformiaat. De roosters werden opgesteld volgens de procedure die in stap 4 van dit protocol is beschreven, waardoor een dikkere vlekfilm achterbleef.
Er zijn verschillende veelvoorkomende observaties wanneer de fabricageprocedure van het streptavidinerooster niet succesvol is, die verder worden beschreven in het discussiegedeelte en tabel 1. Figuur 5 toont enkele voorbeelden van deze waarnemingen. Figuur 5A toont een microfoto van een negatief gekleurd streptavidine-affiniteitsraster dat is gebruikt uit een batch die meer dan zes maanden oud is gemaakt. De monolaag is gemobiliseerd uit de gaten in de koolstoffolie van de quantifoil-roosters en wordt waargenomen met vergelijkbare afmetingen als de gaten in het rooster. Figuur 5B toont een voorbeeld van streptavidinekristallen met een hoge mozaïciteit die gemakkelijk verstoord raken tijdens monstervoorbereidingsprocedures. Figuur 5C toont een representatieve microfoto van een streptavidine-affiniteitsraster waarin de koolstofverdamping in stap 3.21 te dun is of weggelaten. Het streptavidinrooster is gefragmenteerd geraakt tijdens het cryo-EM-monstervoorbereidingsproces. Figuur 5D toont een negatief gekleurd streptavidine-affiniteitsrooster dat verontreiniging heeft door lipideblaasjes, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende wasbeurten tijdens stap 3.13 of het nat worden van de gouden kant van het rooster tijdens stap 3.13-3.20. Raadpleeg het discussiegedeelte en tabel 1 voor strategieën om deze veelvoorkomende problemen op te lossen.
Figuur 1: Schema van de fabricageprocedure van het streptavidine-affiniteitsraster. (A) Overzichtstijdlijn van de fabricageprocedure van het streptavidine-affiniteitsraster. De hele procedure kan gedurende twee weken worden voltooid, waarbij twee koolstofverdampingsstappen nodig zijn en een week na elk om de koolstof voldoende te laten verouderen. (B) Ingezoomd op een rastervierkant van een streptavidine-affiniteitsraster met de lagen waaruit het raster bestaat na voltooiing van het fabricageproces, inclusief het standaard cryo-EM-raster met goudstaven en holey-koolstoffilm, de eerste verdampte koolstoflaag, lipidemonolaag, 2D-streptavidinekristal en de achterste verdampte koolstofondersteuningslaag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Lipide monolaag en streptavidine kristallisatie (A) Afbeeldingen die laten zien hoe de lipide monolaag in de kleine petrischaal met succes kan worden gevormd met behulp van talkpoeder om een grens te creëren voor de ricinusolie die een constante oppervlaktedruk creëert tijdens het vormen van de lipide monolaag. (B) Afbeeldingen die laten zien hoe streptavidinekristallen op cryo-EM-roosters kunnen worden gekweekt. Eerst wordt de koolstofzijde van de roosters aangeraakt tot aan de lipide monolaag en gevolgd door drie opeenvolgende wasbeurten in de kristallisatiebuffer. Streptavidine wordt toegevoegd en roosters worden gedurende 2 uur in een vochtigheidskamer geïncubeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeldparameters voor het process_subtraction.cfg-bestand voor het aftrekken van streptavidineroosters van microfoto's (stap 6). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van succesvolle fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters. (A) Cryo-EM-microfoto van gebiotinyleerde eiwit/nucleosoomcomplexen, bereid met zelfgemaakte streptavidine-affiniteitsroosters. De FFT is rechts afgebeeld en toont het streptavidinekristaldiffractiepatroon. (B) Dezelfde microfoto als in paneel A wordt getoond na de procedure voor het aftrekken van het rooster om het signaal van het 2D-streptavidinkristal uit het originele beeld te verwijderen. (C) Een voorbeeld van een microfoto verkregen door negatieve kleuring van een gebiotinyleerd monster gebonden aan streptavidin-affiniteitsroosters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve resultaten van mislukte fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters. (A) Microfoto van de mobilisatie van de streptavidine-monolaag uit de roostergaten wanneer de roosters ouder zijn dan zes maanden. (B) Microfoto met streptavidinroosters met een hoge mozaïekiteit die gemakkelijk kunnen worden beschadigd tijdens zowel cryo-EM- als minatieve-kleurstofmonstervoorbereidingsprocedures. (C) Microfoto van de fragmentatie van het streptavidinrooster tijdens de voorbereiding van het cryo-EM-monster wanneer de koolstofverdampingslaag in stap 3.21 te dun is of is weggelaten. (D) Representatieve microfoto die besmet is met lipideblaasjes, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende wassen tijdens stap 3.13 of het nat worden van de gouden kant van het rooster tijdens stap 3.13-3.20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Gids voor het oplossen van problemen om veelvoorkomende uitdagingen te overwinnen die zich voordoen bij de fabricage van niet-succesvolle streptavidine-affiniteitsrasters. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 1: lsub.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 2: process_subtration.sh Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 3: process_subtraction.cfg Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 4: bg_drill_hole.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 5: bg_FastSubtract_standard.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 7: bg_push_by_rot.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 8: ReadMRC.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 9: WriteMRC.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend coderingsbestand 10: WriteMRCHeader.m Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Ons protocol beschrijft hoe streptavidine-affiniteitsrasters moeten worden gemaakt en gebruikt en hoe de gegevens die het streptavidine-diffractiesignaal bevatten, moeten worden verwerkt. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol die speciale aandacht vereisen.
Mislukte rasterbatches zijn terug te voeren op verschillende veelvoorkomende fouten. De meest voorkomende bron van fouten komt voort uit het gebruik van verouderde reagentia of reagentia van slechte kwaliteit. Het is vooral belangrijk om de gebiotinyleerde lipide-oplossing precies zo te bereiden als beschreven in het protocol. Verder kunnen eventuele onzuiverheden, zoals wasmiddelresten op het laboratoriummateriaal of van nature aanwezige oliën op de huid, de kwaliteit van de streptavidinkristallen en dus de kwaliteit van de resulterende beelden beïnvloeden. Het wordt daarom aanbevolen om vóór de eerste koolstofverdamping drie wascycli voor de roosters uit te voeren om mogelijke verontreiniging van oppervlakteactieve stoffen door de fabrikant van het rooster te verwijderen (stap 2.1). Bovendien is waargenomen dat verontreiniging of onzuiverheid van de ricinusolie de kristalvorming op het rooster belemmert.
Het maken en oppakken van de lipide monolaag is een taak die een paar keer moet worden geoefend om een gevoel te krijgen voor de kleine lipidevolumes. Het is niet ongebruikelijk dat deze stap de eerste twee of drie keer mislukt voordat een adequate lipidemonolaag kan worden geproduceerd, zoals uiteindelijk wordt weerspiegeld in de kwaliteit van streptavidinekristallen die worden gezien in negatief gekleurde roosters (Figuur 4C).
Het is belangrijk om de achterkant (gouden kant, lipidezijde) van het rooster nooit nat te laten worden tijdens het fabricageproces van het rooster (stappen 3.12-3.20). In het geval dat de achterkant toch nat wordt, is het aan te raden om het rooster weg te gooien. Dit kan resulteren in het verschijnen van grote lipideblaasjes die de beeldkwaliteit verstoren (Figuur 5D) (Rij 3, Tabel 1). Lipideblaasjes kunnen ook worden waargenomen als gevolg van onvoldoende wassen nadat de lipide monolaag is aangebracht (stap 3.13). Drie opeenvolgende wasbeurten met kristallisatiebuffer worden aanbevolen na het aanraken van de lipide-monolaag voorafgaand aan het toevoegen van streptavidine.
Nadat een dunne laag koolstof is verdampt op in trehalose ingebedde roosters, kan de achterkant van het rooster nat worden zonder de kwaliteit van het rooster te beschadigen. Bevochtiging van de achterkant wordt bijvoorbeeld vaak waargenomen wanneer de monsterbuffer zelfs maar minimale hoeveelheden wasmiddel bevat. Bevochtiging van de achterkant door het monster kan resulteren in niet-specifieke binding van monsters aan de dunne koolstoffilm aan de achterkant, wat de effectiviteit vermindert van het voorkomen dat deeltjes diffunderen naar het lucht-watergrensvlak of het gebruik van affiniteitsbinding voor zuiveringsstrategieën op het net. Voeg indien mogelijk het monster toe aan het rooster als er geen wasmiddel is. Wasmiddel en andere additieven kunnen vervolgens worden toegevoegd tijdens de wasstappen van het rooster of in een laatste stap vóór de vitrificatie. Dit is een beperking van het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters; Als het doel echter is om de voorkeursoriëntatie te verbeteren, is de monstervoorbereiding met buffers, inclusief wasmiddel, met succes uitgevoerd11.
Een veel voorkomende bron van fouten is terug te voeren op de ouderdom van de roosters ten opzichte van beide koolstofverdampingsstappen (stap 2.3 en stap 3.21). In dit protocol is de aanbevolen wachttijd 5-7 dagen na de koolstofverdamping aan de achterkant voordat streptavidineroosters voor cryo-EM worden gebruikt. Wanneer roosters te snel na fabricage worden gebruikt, is waargenomen dat het rooster en de lipide-monolaag uit de roostergaten mobiliseren. Een soortgelijke waarneming kan worden gedaan wanneer de roosters te oud zijn en na zes maanden worden gebruikt (figuur 5A) (rij 1, tabel 1). We veronderstellen dat deze waarneming wordt verklaard door veranderingen in de hydrofobiciteit van de koolstofrug die wordt toegepast om de lipide monolaag en streptavidine kristallen te stabiliseren. Bovendien kunnen streptavidineroosters mozaïek lijken (figuur 5B) (rij 3, tabel 1) en gebroken zijn in zowel negatieve-kleuring als cryo-EM als de monolaag wordt aangebracht op roosters waar de eerste koolstofverdampingslaag (stap 2.3) niet voldoende is verouderd.
Een andere veel voorkomende bron van fouten kan worden herleid tot de kwetsbaarheid van de kristallijne monolaag van streptavidine (de lipidemonolaag is zelf vloeibaar en kan omkeerbaar uitzetten of samendrukken). De koolstofverdamping aan de achterkant (stap 3.21) zorgt voor kritische stabiliteit van zowel de monolaag als het streptavidinrooster tijdens het adsorptie-, was- en cryo-EM-blottingproces van het monster. Bij gebrek aan voldoende koolstofverdamping aan de achterkant van het rooster, zullen streptavidineroosters vaak gefragmenteerd lijken na deppen/bevriezen (Figuur 5C) (Rij 2, Tabel 1). In dit protocol raden we het gebruik van een eenzijdige geautomatiseerde dompelvriezer aan voor enkelzijdig blotting. Deze methode levert zeer reproduceerbare blotting-condities op die het streptavidinerooster behouden tijdens het invriesproces en een gestroomlijnde optimalisatie van de monstertoepassing en blotting-parameters mogelijk maken. Als alternatief zijn andere geautomatiseerde invriesapparaten gebruikt in combinatie met handmatig deppen. Om dit te doen, wordt de eigenlijke blotting-functie uitgeschakeld in de apparaatinstellingen en wordt het raster in plaats daarvan gedept door met een pincet vloeipapier door de zij-ingang te reiken. Met deze methode kunnen hoogwaardige resultaten worden behaald voor laboratoria zonder een enkelzijdig apparaat voor blotting en invriezen; De reproduceerbaarheid van raster tot net is echter een uitdaging.
Hoewel het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters veel voordelen heeft, moet rekening worden gehouden met enkele beperkingen van deze methode. Vanwege de aard van de procedure is het meestal niet mogelijk om de kwaliteit van het streptavidinrooster te beoordelen totdat het hele proces is voltooid. Er wordt voorgesteld om de kwaliteit van elke batch snel te screenen op negatieve kleuring voordat monsters worden ingevroren. Vanwege het signaal dat door het streptavidinrooster aan de onbewerkte beelden wordt bijgedragen, kan het in sommige gevallen een uitdaging zijn om op basis van de beelden alleen te beoordelen of er voldoende intacte, verspreide deeltjes zijn. Om dezelfde reden is on-the-fly verwerking van cryo-EM-gegevens tijdens data-acquisitie niet mogelijk, tenzij de procedure voor het aftrekken van het streptavidinesignaal is opgenomen in de datavoorverwerkingspijplijn. Omdat het streptavidine-signaal meestal wordt afgetrokken van de bewegingsgecorrigeerde beelden en niet van de frames zelf, kan Bayesiaans polijsten, zoals geïmplementeerd in populaire softwaresuites, mislukken bij het gebruik van de aftrekprocedures zoals beschreven. Het wordt daarom aanbevolen om bewegingscorrectie in meerdere patches uit te voeren om de beweging van deeltjes vanaf het begin van de gegevensverwerking te minimaliseren16.
Ondanks deze beperkingen bieden streptavidine-affiniteitsroosters veel voordelen. Twee grote voordelen die streptavidine-affiniteitsroosters bieden ten opzichte van standaard cryo-EM-roosters met open gaten, zijn een middel om monsters te beschermen tegen het lucht-watergrensvlak en om monsters met een lage abundantie (10-100 nM) op het rooster te concentreren. Andere steunlagen, zoals koolstof en grafeenoxide, kunnen ook worden gebruikt als strategieën om deze knelpunten bij de monstervoorbereiding te overwinnen. In één voorbeeld waren streptavidine-affiniteitsroosters de enige oplossing voor het verkrijgen van een intacte reconstructie van een eiwit-nucleïnezuurinteractie die onverenigbaar was met cross-linking-benaderingen. 12 okt.
Een ander groot voordeel dat streptavidine-affiniteitsroosters bieden, is een oplossing voor monsters die adsorberen aan andere steunlagen, zoals koolstof of grafeenoxide, met voorkeursoriëntaties die het vermogen belemmeren om een 3D-reconstructie van het monster van belang te verkrijgen. Willekeurige biotinylering van monsters met behulp van in de handel verkrijgbare kits maakt het mogelijk om het monster van belang willekeurig aan de streptavidine-monolaag te hechten om meer potentiële weergaven te verkrijgen om deze uitdaging te overwinnen.
Bovendien bieden streptavidine-affiniteitsroosters voordelen die uniek zijn voor op affiniteit gebaseerde rasters. De hoge affiniteit en specificiteit van de streptavidine-biotine-interactie maken de koppeling van streptavidine-affiniteitsroosters mogelijk met andere workflows waarbij biotine betrokken is om interessante complexen te zuiveren. In een gepubliceerd voorbeeld immobiliseerden de auteurs een complex op streptavidine-affiniteitsrasters en incubeerden ze een bindingspartner van onbekende stoichiometrie in grote overmaat. Na het afwassen van een ongebonden eiwit werd het correct geassembleerde supercomplex verkregen en kon het onmiddellijk worden geanalyseerd met cryo-EM11. Een mogelijke toekomstige toepassing kan zijn om streptavidine-bindende eiwitlabels, het Avi-tag-systeem of nabijheidslabelingbenaderingen te combineren met streptavidine-affiniteitsroosters om afzonderlijke eiwitten en/of eiwitcomplexen rechtstreeks uit recombinante of endogene bronnen te extraheren zonder standaard uitgebreide zuiveringsschema's.
Door dit protocol aan te bieden, zouden laboratoria in staat moeten zijn om de fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters gemakkelijk te reproduceren en ze vast te stellen als een meer algemeen gebruikt hulpmiddel voor structurele analyse van eiwitcomplexen door cryo-EM.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
TC werd ondersteund door de opleidingsbeurs voor moleculaire biofysica GM-08295 van het National Institute of General Medical Sciences en de National Science Foundation graduate research fellowship onder subsidienummer DGE 2146752. R.G. en B.H. werden gesteund door de National Institute of Health-subsidie R21-GM135666 toegekend aan R.G. en B.H. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de subsidie R35-GM127018 van het National Institute of General Medical Sciences, toegekend aan E.N. E.N. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt | Avanti Polar Lipids | 870285P | Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1–10 mg/mL in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 °C |
| 200 proof pure ethanol | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| 5 μL Hamilton Syringe | Hamilton | 87930 | 5 µL Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2 |
| Castor Oil | Sigma Adrich | 259853 | |
| Cell culture dishes untreated (35 mm) | Bio Basic | SP22146 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650471 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, ≥99% | Sigma Aldrich | T9449 | |
| DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade | Ted Pella | 510-5NM | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | |
| Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater | Leica | ||
| Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer | Leica | ||
| Quantifoil R 2/1 Au300 | Quantifoil | Q84994 | |
| Steptavidin | New England Bioscience | N7021S | Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25–50 μL aliquots |
| Talcum powder | Carolina | 896060 | |
| Whatman Grade 1 filter paper | Cytiva | 1001-085 |
References
- Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).
- Carragher, B., et al. Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM. Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, e34257 (2018).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).
- Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
- Williams, R. C., Glaeser, R. M. Ultrathin carbon support films for electron microscopy. Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).
- Han, B. -G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).
- Han, B. -G., et al. Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals. Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).
- Domínguez-Martín, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
- Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).
- Lahiri, I., et al. 3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids. Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).
- Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
- Levine, M. J., Schwarz, J. A. Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques. Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
