In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden

Summary

Hier beschreiben wir eine Plattform, die die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden ermöglicht, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden. Der Arbeitsablauf reicht von der Erzeugung von Sphäroiden aus primären Leberzellen über die Transplantation in das Mausauge bis hin zur In-vivo-Bildgebung mit zellulärer Auflösung durch konfokale Mikroskopie.

Abstract

Biomedizinische Untersuchungen der Leber an Säugetieren werden durch den Mangel an Methoden für die nichtinvasive longitudinale Bildgebung in vivo mit zellulärer Auflösung behindert. Bisher ist die optische Bildgebung der Leber in situ durch Intravitalbildgebung möglich, die eine hochauflösende Bildgebung auf zellulärer Ebene ermöglicht, aber nicht mehrfach und damit longitudinal am selben Tier durchgeführt werden kann. Nichtinvasive bildgebende Verfahren wie die Biolumineszenz ermöglichen wiederholte Bildgebungssitzungen am selben Tier, erreichen jedoch keine Zellauflösung. Um diese methodische Lücke zu schließen, haben wir eine Plattform für die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung von Leber-Sphäroiden entwickelt, die in die vordere Kammer des Mausauges transplantiert wurden. In dem in dieser Studie beschriebenen Arbeitsablauf werden primäre Mausleber-Sphäroide in vitro erzeugt und in die vordere Augenkammer der Empfängermäuse transplantiert, wo sie sich auf der Iris einnisten. Die Hornhaut fungiert als natürliches Körperfenster, durch das wir die transplantierten Sphäroide mit der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie abbilden können. Die Sphäroide überleben monatelang im Auge, während derer die Zellen in Kontexten von Gesundheit und Krankheit untersucht werden können und in ihrer Reaktion auf verschiedene Reize in wiederholten Bildgebungssitzungen mit geeigneten Fluoreszenzsonden überwacht werden können. In diesem Protokoll geben wir eine Aufschlüsselung der notwendigen Schritte zur Implementierung dieses Bildgebungssystems und erklären, wie sein Potenzial am besten genutzt werden kann.

Introduction

Die Überwachung der Leberfunktion bei Säugetieren während der Gesundheit und Krankheit ist durch den Mangel an hochauflösenden, nicht-invasiven In-vivo-Bildgebungsverfahren eingeschränkt. Die Visualisierung dieses Organs wird durch seinen unzugänglichen Ort behindert, und um zelluläre Prozesse zusammenzusetzen, stützen sich In-vivo-Studien auf die Tötung von Tieren zu verschiedenen Zeitpunkten. Um diese Einschränkung der Bildgebung zu umgehen, stützt sich ein Großteil der Arbeit auf In-vitro-Modelle , in denen leberähnliche Mikrogewebe in einer kontrollierten Umgebung sichtbar gemacht und untersucht werden.

In den letzten Jahren hat die Entwicklung von dreidimensionalen Kultursystemen, wie z. B. Lebersphäroiden, die Leberforschung unterstützt und vorangetrieben. Leber-Sphäroide sind mehrzellige Aggregate, die die Mikroumgebung und komplexe Zell-Zell-Interaktionen von Lebergewebe bis zu einem gewissen Grad nachahmen¹ und klare Vorteile gegenüber herkömmlichen Monolayer-Kulturen bieten ^2,3. Leber-Sphäroide werden auch als Modelle für verschiedene Lebererkrankungen verwendet ^4,5,6 und haben maßgeblich zum Verständnis von Krankheitsmechanismen beigetragen. Die wichtigsten Einschränkungen der aktuellen in vitro Lebermodelle sind jedoch das Fehlen eines physiologischen in vivo Milieus und die begrenzte Nutzungszeit in Kultur (etwa 20 Tage)³. Lebersphäroide wurden zuvor in vivo an verschiedene Stellen transplantiert, wie z. B. unter die Nierenkapsel⁷ oder intraperitoneal⁸, die für die optische Bildgebung nicht zugänglich sind. Die intravitale Leberbildgebung ist eine hochmoderne Technik, die eine zellaufgelöste Echtzeit-Bildgebung ermöglicht. Derzeit ist diese in situ Leberbildgebung nur am exteriorisierten Organ möglich, das hochinvasiv und oft terminal ist⁹. Das Einsetzen eines Bauchfensters würde zwar wiederholte Bildgebungsuntersuchungen der Leber ermöglichen, ist aber mit einer komplexen Operation und Nachsorge verbunden.

Um ein longitudinales Monitoring mit zellulärer Auflösung durchzuführen, untersuchten wir die Transplantation von Lebersphäroiden in die vordere Augenkammer (ACE) von Mäusen, wo das leberähnliche Gewebe in ein physiologisches Milieu transplantiert, mit den Körperreizen verbunden und für die optische Bildgebung zugänglich gemacht wird. Die Hornhaut ist ein transparentes Gewebe und fungiert als Fenster, durch das Mikrogewebe, das auf der Iris transplantiert wurde, nicht-invasiv und longitudinal durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden kann. Hier stellen wir einen Workflow dieser neu entwickelten Plattform für die in vivo Bildgebung von Leber-Sphäroiden^{vor 10}. Dieses Protokoll ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für seine Implementierung, unterteilt in (1) die Extraktion von primären Leberzellen der Maus und die In-vitro-Bildung von Lebersphäroiden, (2) die Transplantation von Lebersphäroiden in das ACE von Empfängermäusen und (3) die In-vivo-Bildgebung von transplantierten Lebersphäroiden in anästhesierten Mäusen. Darüber hinaus werden wir einige der Möglichkeiten und Anwendungen dieser Bildgebungsplattform vorstellen.

Protocol

Alle Eingriffe, die an Tieren durchgeführt wurden, wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Karolinska Institutet genehmigt. 1. Extraktion von primären Leberzellen der Maus und Erzeugung von Lebersphäroiden in vitro PräparatFür die Kanülierung, Leberresektion und Isolierung primärer Leberzellen sind zusätzlich zu serologischen Pipetten und Zentrifugenröhrchen folgende sterile oder Einwegmaterialien vorzubereiten (Abbildung 1A): Peristaltikpumpe, Schwenkbecherzentrifuge, saugfähiges Pad, Dissektionsmatte, zwei Pinzetten mit gebogener Spitze, chirurgische Schere, eine 27-G-Schmetterlingsnadel, ein 70-μm-Zellsieb, ein Zelllifter, eine 100-mm-Petrischale, Zellzählkammer und 96-Well-Mikrotiterplatten mit U-förmigem Boden. Bereiten Sie die Lösungen vor, die für die Leberperfusion, die Isolierung primärer Leberzellen und die Erzeugung von Lebersphäroiden verwendet werden, wie in Tabelle 1 aufgeführt.HINWEIS: Der Aufschlusspuffer und die Gradientenlösung sollten frisch zubereitet werden. Richten Sie das Perfusionssystem ein, das aus einer Peristaltikpumpe besteht, die Lösungen aus dem 42 °C warmen Wasserbad in die Leber leitet (Abbildung 1A). Die höhere Temperatur des Wasserbades sorgt dafür, dass die Puffer mit der optimalen Temperatur von 37 °C in der Leber ankommen. Passen Sie dies je nach Rohrlänge und Raumtemperatur (RT) an. Für die Kanülierung setzen Sie eine 27 G Schmetterlingsnadel an das Ende des Schlauches. Halten Sie das in den letzten Isolationsschritten verwendete Beschichtungsmedium bei 4 °C. VerfahrenDie folgenden Lösungen werden im 42 °C-Wasserbad in 50-ml-Zentrifugenröhrchen vorerhitzt: 40 mL PBS, 20 mL Perfusionspuffer und 12 mL Aufschlusspuffer. Um die Pumpschläuche zu reinigen und zu erwärmen, zirkulieren ca. 20 mL des vorgewärmten PBS. Wechseln Sie den Schlauch zum Perfusionspuffer, grundieren Sie den Schlauch und die Butterfly-Nadel und stellen Sie die Flussrate auf 4 ml/min ein. Stellen Sie sicher, dass während des Pufferwechsels während des gesamten Protokolls keine Blasen im Schlauch vorhanden sind. Euthanasieren Sie die Maus durch Gebärmutterhalsluxation und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Nadeln am Präparierbrett. Befeuchten Sie das Bauchfell mit 70% Ethanol und zerlegen Sie es, um Zugang zu den Verdauungsorganen zu erhalten. Bewegen Sie den Darm nach rechts, um die Pfortader und die Vena cava inferior freizulegen (Abbildung 1B). Kanülieren Sie die Hohlvene etwa auf halber Länge mit der Nadel in horizontaler Position, stellen Sie sicher, dass sie stabil ist, und starten Sie die Pumpe. Wenn sich die Leber aufzublähen beginnt oder weiße Punkte in den engeren Lappen erscheinen, durchtrennen Sie die Pfortader, damit das Blut und der Perfusionspuffer abfließen können. Die Leber sollte sofort anfangen zu blanchieren. Fördern Sie die Reinigung mit einer gebogenen Pinzette, um die Pfortader im Abstand von 5 s zu klemmen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.9, bis die Leber gelb und blutfrei ist (ca. 15-20 ml Perfusionspuffer). Stoppen Sie die Peristaltikpumpe, um den Schlauch zum Aufschlusspuffer zu wechseln und die Pumpe neu zu starten. Wenn der Aufschlusspuffer die Leber erreicht, reduzieren Sie die Flussrate auf 2,5 ml/min.HINWEIS: Das Phenolrot im Verdauungspuffer ermöglicht eine Unterscheidung zwischen seiner Ankunft in der Leber und ermöglicht die Anpassung der Pumpenparameter während der Behandlung. Um zu erreichen, dass der Puffer alle Leberlappen erreicht, und um eine ordnungsgemäße Verdauung zu gewährleisten, wiederholen Sie Schritt 1.2.9 mehrmals. Stoppen Sie den Fluss der Schlauchpumpe, wenn der Verdauungspuffer erschöpft ist oder die Leber ausreichend verdaut aussieht.HINWEIS: Der Grad der Verdauung kann visuell überwacht werden, indem die Leberlappen vorsichtig mit einer Pinzette zusammengedrückt und überprüft werden, ob kleine Flecken auf dem Gewebe erscheinen. Auch die Leber wird dünn. Um die Leber zu extrahieren, durchtrennen Sie die Leberbänder und -verbindungen in der Bauchhöhle mit dem Ziel, sie vollständig zu entfernen, und legen Sie sie in die Petrischale mit 10 ml kaltem Beschichtungsmedium (Tabelle 1). Nachdem Sie die Gallenblase entfernt haben, kneifen Sie mit einer Pinzette kleine Kneifungen an den Lappen und reißen Sie die Leberkapsel leicht auf. Wenn Sie die Leber in der Schale schütteln, beobachten Sie, wie Zellen in das Medium strömen. Halten Sie die Leber mit einer Pinzette fest und ziehen Sie den Zellheber vorsichtig entlang der Lappen, um die Zellen freizusetzen.HINWEIS: Ein korrekter interlobulärer Verdau führt zu einer Zellsuspension im Medium, nicht in Gewebefragmenten. Sammeln Sie mit einer serologischen Pipette die Zellsuspension aus der Petrischale und filtrieren Sie sie durch das 70-μm-Zellsieb, das auf einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen platziert ist. Verwenden Sie frische Beschichtungsmedien, um die Schale mit verdauten Leberzellen zu waschen und in den Filter zu übertragen. Zentrifugieren Sie bei 50 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand, lassen Sie ca. 1 ml übrig, um das Zellpellet zu bedecken, schwenken Sie das Röhrchen, um die Zellen wieder zu resuspendieren, und fügen Sie dann nach und nach 10 ml kaltes Beschichtungsmedium hinzu. Geben Sie die 10 mL Gradientenlösung in die Zellsuspension und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig 10 Mal um. Bei 200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Das Pellet enthält lebensfähige Leberzellen, die mit Hepatozyten angereichert sind, während der Überstand abgestorbene Zellen und Ablagerungen enthält. Entsorgen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette, so dass ca. 1 ml übrig bleibt, und resuspendieren Sie das Pellet durch leichtes Schwenken. Geben Sie 20 mL kaltes Beschichtungsmedium in die Zellsuspension und zentrifugieren Sie bei 50 x g für 5 min bei 4 °C, um die Gradientenlösung abzuwaschen. Entfernen Sie den Überstand, lassen Sie ca. 1 ml über dem Pellet und resuspendieren Sie die Zellen in 20 mL kaltem Beschichtungsmedium.HINWEIS: Hier kann das Zellpellet verdichtet werden, verwenden Sie daher bei Bedarf eine 10 mL serologische Pipette, um die Zellen sanft zu dissoziieren. Bestimmen Sie die Zellanzahl und Viabilität manuell mit einer Zellzählkammer und Trypanblau.HINWEIS: Die Hepatozytenzellen fallen im Röhrchen schnell aus; Um sie wieder zu resuspendieren, drehen Sie die Röhre einige Male vorsichtig um. Aussaat der Leberzellen in 200 μl/Well Plattierungsmedium mit 1200 Zellen/Well in 96-Well-Platten mit extrem niedriger Adhärenz.HINWEIS: Das optimale Medienvolumen pro Vertiefung beträgt 200 μl; Es ist jedoch möglich, Zellen in 100 μl/Vertiefung zu säen. Drehen Sie die Platten 3 Minuten lang bei 200 x g , um die Zellen in der Mitte der Vertiefungen zu sammeln. Inkubieren Sie die Zellen (37 °C, 5 % CO2) und lassen Sie sie 5 Tage lang auf natürliche Weise Sphäroide bilden (Abbildung 1C). Entfernen Sie an Tag 5 vorsichtig die Hälfte des Mediums aus der Vertiefung und ersetzen Sie es durch serumfreie Erhaltungsmedien (Tabelle 1). Wiederholen Sie diesen Schritt alle 48 Stunden bis zum 10. Tag, wenn die Lebersphäroide zur Transplantation bereit sind.HINWEIS: Die Bildung einer kapselartigen Struktur in kultivierten Lebersphäroiden zeigt eine gute Aggregation und Lebensfähigkeit. 2. Transplantation von Lebersphäroiden in die vordere Augenkammer (ACE) PräparatFür die Transplantation von Lebersphäroiden in das ACE stellen Sie sicher, dass die folgenden Ressourcen angeordnet sind (Abbildung 2A): Stereomikroskop, Isofluran-Anästhesiegerät, Induktionskammer, Isofluran, Heizkissen, maßgefertigte Metallgrundplatte, Mauskopfhalterung und Gasmaske, Pinzette, die am festen Kreuzgelenk befestigt ist, Hamilton 500 μL Kolbenspritze mit Gewinde, Silikon, Polyethylen und Pumpenschlauch, maßgefertigte stumpfe Glaskanüle oder 24 G Katheter, Ethanol 70%, sterile Kochsalzlösung, sterile 23 g Nadeln, Augensalbe (flüssiges Paraffin und Vaseline im Verhältnis 1:1), Einwegspritze 1 ml und Zellsuspensionsschale 35 mm. Reinigen Sie die Hamilton-Spritze, den Schlauch und die Kanüle, indem Sie 70 % Ethanol und Kochsalzlösung passieren. Füllen Sie die Hamilton-Spritze, den Schlauch und die Glaskanüle mit Kochsalzlösung und befestigen Sie die Hamilton-Spritze mit Klebeband in horizontaler Position auf dem Tisch (Abbildung 2A). Verwenden Sie eine speziell angefertigte stumpfe Glaskanüle.Verlängern Sie eine Borosilikatglaskapillare mit einem zweistufigen Mikropipettenabzieher auf einen Innendurchmesser von >300 μm, um die Aspiration der Sphäroide zu ermöglichen. Schrägen Sie die Spitze mit einem Mikroelektroden-Anfaser ab und setzen Sie die Kanülenspitze einige Sekunden lang einer Flamme aus, um die Ränder weicher zu machen.HINWEIS: Der Mikroelektroden-Anfaser besteht aus einem rotierenden Schleifstein, der manuell betätigt wird; Daher sind bestimmte Einstellungen nicht anwendbar. Alternativ können Sie eine Kanüle mit dem Kunststoffteil eines 24-G-Katheters konstruieren (Abbildung 2B). Bereiten Sie die Anästhesie-Isofluran-Einheit vor und erwärmen Sie das Heizkissen auf 37 °C. Decken Sie die Spitzen der Pinzette, die an dem festen Kreuzgelenk befestigt ist, mit einem Stück Polyethylenschlauch ab, um eine Schlaufe zu bilden, die zur Stabilisierung des Auges beiträgt. Übertragen Sie die Lebersphäroide von der 96-Well-Platte mit einer Pipette und einer 200-μl-Spitze in eine 35-mm-Zellsuspensionsschale mit Erhaltungsmedium. VerfahrenBetäuben Sie die Maus in der Induktionskammer mit einer Dosis von 2,5 % Isofluran und 280 ml/min Luft. Wenn die Maus bewusstlos ist, senken Sie die Anästhesie auf 1,8 % Isofluran und 280 ml/min Luft, schließen Sie den Anästhesieschlauch an den Kopfhalter an und übertragen Sie das Tier schnell auf das Heizkissen, wobei Sie die Nase im Kopfhalter positionieren. Den Kopf mit den Schrauben ruhigstellen, das Auge vorsichtig aus der Augenhöhle schieben und mit der Pinzette fixieren und einen Tropfen Kochsalzlösung auf beide Augen geben, um ein Austrocknen zu verhindern. Verwenden Sie die Hamilton-Spritze, um die Lebersphäroide unter dem Stereoskop in die Spitze der Kanüle zu aspirieren und zu sammeln, und lassen Sie sie horizontal auf einer sauberen Oberfläche ruhen.HINWEIS: Das Absaugen von Medien zusammen mit den Lebersphäroiden verhindert, dass sie an den Kanülenwänden haften bleiben. Stechen Sie die Hornhaut vorsichtig mit einer 23 G Nadel ein und trocknen Sie das austretende Kammerwasser mit einem Taschentuch ab. Um den Schnitt bei Bedarf breiter zu machen, schieben Sie die Nadel vorsichtig zur Seite, um die Hornhaut zu durchschneiden.HINWEIS: Für die Durchführung der Hornhautpunktion wird eine sterile Einwegnadel verwendet, sodass die Hornhaut vor dem Einschnitt nicht desinfiziert wird. Geben Sie Kochsalztropfen auf das Auge, um ein Austrocknen zu vermeiden. Nehmen Sie die Kanüle mit den Lebersphäroiden und halten Sie sie senkrecht, damit die Sphäroide zur Spitze der Kanüle ziehen können. Führen Sie die Kanüle vorsichtig in das Loch ein und verwenden Sie die Hamilton-Spritze, um die Lebersphäroide langsam in das ACE auszustoßen, wobei die Fase zur Pupille gerichtet ist (Abbildung 2C).HINWEIS: Es wird empfohlen, vor dem Entfernen der Kanüle einige Sekunden zu warten, bis sich der Flüssigkeitsdruck innerhalb und außerhalb des Auges wieder eingestellt hat, um zu verhindern, dass die Sphäroide wieder aus dem Auge entweichen. Positionieren Sie die Lebersphäroide von außerhalb der Hornhaut um die Pupille und weg von der Inzision, indem Sie die Hornhaut vorsichtig mit der Spitze der Kanüle anstoßen (Abbildung 2C). Warten Sie ~5-10 Minuten, bis sich die Lebersphäroide auf der Iris abgesetzt haben, bevor Sie das Auge von der Pinzette lösen. Tragen Sie Vaseline-Augensalbe auf das operierte Auge auf, die hilft, die Hornhaut zu schmieren und zu heilen. Falls gewünscht, fahren Sie mit der Operation des zweiten Auges nach der gleichen Methode fort. Vor dem Aufwachen der Maus ist ein Analgetikum zu verabreichen, um postoperative Beschwerden zu vermeiden, z. B. 0,1 mg/kg Buprenorphin in steriler Kochsalzlösung, subkutan verabreicht.HINWEIS: Den Mäusen wurde nur eine Dosis Analgetika verabreicht, da sie sich schnell von diesem kleinen Eingriff erholten und keine Anzeichen von Schmerzen oder verändertem Verhalten zeigten. Da dieses Verfahren sehr schnell ist (weniger als 10 Minuten) und nur geringe Beschwerden verursacht, benötigen die Mäuse keine postoperative Versorgung, abgesehen von der postoperativen Analgesie, die vor dem Aufwecken des Tieres verabreicht wird. 3. In vivo Bildgebung von transplantierten Lebersphäroiden im ACE PräparatBereiten Sie die folgenden Materialien und Instrumente für die nichtinvasive In-vivo-Bildgebung von Lebersphäroiden vor, die in ACE transplantiert wurden (Abbildung 3A): aufrechtes konfokales Mikroskop, Wassertauchobjektiv mit großer Arbeitsdistanz, Isofluran-Anästhesiegerät, Induktionskammer, Isofluran, Heizkissen, maßgefertigte Metallgrundplatte, Mauskopfhalter und Gasmaske, Pinzette am festen Kreuzgelenk, künstliches Tränengel, Augensalbe (flüssiges Paraffin und Vaseline im Verhältnis 1:1). Zu den optionalen Materialien gehören injizierbare Fluoreszenzsonden, Einwegspritzen und 27-G-Nadeln für die intravenöse Injektion mit dem Schwanz. VerfahrenBetäuben Sie die Maus in der Induktionskammer mit einer Dosis von 2,5 % Isofluran und 280 ml/min Luft. Wenn die Maus bewusstlos ist, senken Sie die Anästhesie auf 1,8 % Isofluran und 280 ml/min Luft, schließen Sie den Anästhesieschlauch an den Kopfhalter an und übertragen Sie das Tier schnell auf das Heizkissen, wobei Sie die Nase im Kopfhalter positionieren. Fixieren Sie den Kopf mit den Schrauben in der Kopfhalterung. Geben Sie einen Tropfen künstliches Tränengel auf beide Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Zu diesem Zeitpunkt intravenös Fluoreszenzsonden durch die Schwanzvene injizieren und unmittelbar danach ein Bild aufnehmen. Neigen Sie den Kopf, schieben Sie das Auge vorsichtig aus der Augenhöhle und befestigen Sie es mit einer Pinzette unter dem Objektiv. Tragen Sie eine großzügige Menge künstliches Tränengel auf, um den Raum zwischen der Hornhaut und dem Objektiv zu füllen, und fokussieren Sie sich durch das Okular auf die Lebersphäroide.HINWEIS: Wenn möglich, entfernen Sie das Okular eines der Okulare, um eine nicht vergrößerte Sicht zu erhalten und die Sphäroide auf der Iris leichter zu lokalisieren. Um trotz der Atembewegungen des Tieres eine hochauflösende Bildgebung zu erhalten, verwenden Sie 25-fache Objektive und folgende Bildeinstellungen: Format 512 x 512 Pixel, Scangeschwindigkeit von 600 Hz und eine Z-Stapel-Dicke von 3 μm. Detaillierte Imaging-Einstellungen finden Sie in Tabelle 2.HINWEIS: Während der gesamten Bildgebung wird die Anästhesiekonzentration von 1,6 bis 2,2 ml/h Isofluran angepasst, um einen flachen, kontrollierten Atemrhythmus zu erreichen und dadurch die Bewegung des Tieres zu minimieren. Behandeln Sie die abgebildeten Augen am Ende der Bildgebungssitzung mit Vaseline-Augensalbe, bevor Sie Isofluran entfernen und das Tier aufwecken.

Representative Results

Primäre Leberzellen, die mit Hepatozyten angereichert waren, wurden aus der Mausleber durch zweistufige Kollagenase-Perfusion isoliert, wobei eine peristaltische Pumpe verwendet wurde, um warme Puffer durch die Leber zu zirkulieren, wobei das Gefäßsystem des Organs genutzt wurde, um Dissoziationsenzyme an alle Zellen abzugeben (Abbildung 1A). Zu diesem Zweck wurde die untere Hohlvene kanüliert und die Pfortader durchtrennt, um den Durchfluss der Puffer zu ermöglichen (Abbildung 1B). Zuerst wurde ein HBSS-basierter Puffer durch die Leber gespült, um das Blut zu reinigen. Ist die Kanülierung erfolgreich und es sind keine Blutgerinnsel vorhanden, wird die Leber blanchierend und vergilbt innerhalb weniger Sekunden. Zweitens wurde ein Verdauungspuffer, der die Libase-Enzymmischung enthielt, durch die Leber zirkuliert, um das Gewebe in eine einzellige Suspension zu dissoziieren. Die Zellen wurden manuell gezählt und in 96-Well-Ultra-Low-Adherence (ULA)-Platten ausgesät, die die Selbstorganisation zu Sphäroiden innerhalb weniger Tage ermöglichen. An Tag 5 werden die Sphäroide gebildet, und die dünne Kapsel, die an die Sphäroide grenzt, zeigt eine erfolgreiche Aggregation an (Abbildung 1C). Wir warten bis zum 10. Tag mit der Transplantation, dann sind die Sphäroide kompakt und haben starke Zell-Zell-Verbindungen entwickelt. Die Anzahl der ausgesäten Zellen pro Vertiefung bestimmte die Größe des Lebersphäroids, wobei 1000, 1200 und 1500 Zellen/Vertiefung Sphäroide von 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm bzw. 298 μm ± 19 μm (mittlere ± SD) Durchmesser ergaben (Abbildung 1C, D). Für die Transplantation wählen wir Sphäroide mit einem Durchmesser von ca. 250 μm aus folgenden Gründen aus: (1) Die Größe der Sphäroide sollte nicht zu groß sein, um Hypoxie und nekrotischen Kern zu vermeiden, aber sie sollte genügend Zellen enthalten, um die Zell-Zell-Kommunikation zu unterstützen und einen Transplantatumbau im Auge zu ermöglichen, (2) das Gewicht von Sphäroiden dieser Größe ermöglicht es ihnen, sich in Richtung der Iris zu bewegen und ihre Transplantation zu verbessern, (3) Diese Größe ist in Bezug auf die Transplantation von 5-10 Sphäroiden pro Mausauge angemessen. Für die Transplantation wird eine Spritze mit manuellem Gewinde benötigt, die mit einer Glaskanüle verbunden ist (Abbildung 2A). Die Glaskanüle besteht aus einer Borosilikatglaskapillare, die im eigenen Haus mit einem Mikropipettenabzieher und einem Anfaser zu einer feinen stumpfen Spitze modifiziert wurde. Eine einfachere alternative Kanüle kann mit einem handelsüblichen Kunststoffkatheter hergestellt werden, der mit dem Spritzenschlauch verbunden und in einer Pipettenspitze stabilisiert wird (Abbildung 2B). Die Operation besteht in der Inokulation von Lebersphäroiden in die ACE durch einen Schnitt in der Hornhaut (Abbildung 2C). Die Sphäroide wurden an den Rändern der Pupille positioniert, um sie für die Bildgebung besser zugänglich zu machen und ein Verschieben in den Augenwinkel zu vermeiden. Für die Transplantation wurden Albino-Mäuse verwendet, da ihre unpigmentierte Iris die in vivo Bildgebung der transplantierten Lebersphäroide ermöglicht. Empfängermäuse wurden mit 7-10 Sphäroiden/Auge in beide Augen transplantiert, und stereoskopische Bilder wurden 3 Tage nach der Transplantation (Post-Tx) sowie 1 Woche und 1 Monat nach der Tx aufgenommen, um die Heilung der Hornhaut und den Erfolg der Sphäroidtransplantation zu dokumentieren (Abbildung 2D). Bemerkenswert ist, dass die Veränderung des Aussehens der Lebersphäroide im ACE zwischen der frischen Transplantation und der vollständigen Transplantation auf die Ablagerung des Transplantats auf die Iris sowie auf das Wachstum einer Monoschicht von Iriszellen über dem Sphäroid zurückzuführen ist. Die Erfolgsrate der Transplantation von Lebersphäroiden im ACE beträgt 70% (n = 9 Augen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen) (Abbildung 2E). Die ersten Tage nach der Tx sind die kritischsten für das Überleben und die Transplantation, wahrscheinlich weil das Empfängertier sich die Augen reibt und die Sphäroide entfernt, bevor die Hornhaut verheilt ist. Die Größe der Lebersphäroide unterscheidet sich nach der Tx nicht signifikant und Formveränderungen werden auf den Transplantatumbau und die Transplantation zurückgeführt (Abbildung 2F). 1 Monat nach der Tx waren alle transplantierten Sphäroide, die auf der Iris vorhanden waren, vaskularisiert und innerviert, wie durch Immunfluoreszenzfärbung gezeigt wurde (Abbildung 2G). Die nichtinvasive In-vivo-Bildgebung wird an anästhesierten Empfängermäusen unter Verwendung eines aufrechten konfokalen Mikroskops und eines Langstrecken-Tauchobjektivs durchgeführt (Abbildung 3A, Tabelle 2). Die Fluoreszenzbildgebung in der ACE kann durch verschiedene Ansätze erreicht werden, wie in Abbildung 3B dargestellt. Die Injektion von Fluoreszenzsonden in den Kreislauf der Empfängermaus ermöglicht die Visualisierung verschiedener Zelltypen und Strukturen innerhalb der Sphäroide. Wir verwendeten Lektin zur Markierung von Blutgefäßen (Abbildung 3C), CMFDA zur Beobachtung des Gallenkanalnetzwerks (Abbildung 3D) und pHrodo-LDL, das die aktive LDL-Aufnahme in die Sphäroidzellen bestätigte (Abbildung 3E). Leber-Sphäroide, die aus Reporter-Mausmodellen generiert wurden, können ebenfalls verwendet werden. Albumin-Cre:tdTomato-Sphäroide ermöglichten die Markierung und Verfolgung von Hepatozyten (Abbildung 3F), und Sphäroide, die den Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) Biosensor exprimieren, wurden verwendet, um die Zellzyklusdynamik mit Einzelzellauflösung zu visualisieren (Abbildung 3G). Schließlich können Leber-Sphäroide in vitro vor der Transplantation genetisch verändert werden, und im Fall der Adeno-assoziierten Virus (AAV)-GFP-Transduktion wurde die Expression über einen Zeitraum von mehr als 6 Monaten in vivo beobachtet (Abbildung 3H). Abbildung 1: Isolierung von primären Maus-Hepatozyten und Erzeugung von Leber-Sphäroiden. (A) Material und Ausrüstung für die Isolierung von primären Maus-Hepatozyten: 1. Isolationspuffer; 2. Wasserbad; 3. Peristaltische Pumpe; 4. Petrischale; 5. Zellensieb; 6. Saugfähiges Pad; 7. Seziermatte; 8. Zell-Lifter; 9. Schmetterlingsnadel 27 G; 10. Sezieren von Werkzeugen. (B) Bauchhöhle während der Operation: Die Hohlvene wird kanüliert und perfundiert, und die Pfortader wird durchtrennt, um den Durchfluss der Puffer zu ermöglichen. (C) Hellfeldbilder der Bildung von hepatischen Sphäroiden in vitro 0 (d0), 5 (d5) und 10 (d10) Tage nach der Aussaat, Maßstabsbalken = 200 μm. (D) Größe der Leber-Sphäroide bei verschiedenen Konzentrationen der Zellaussaat, n = 21 Sphäroide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Transplantation und Transplantation von Lebersphäroiden in das ACE von Mäusen. (A) Materialien und Geräte, die für die Transplantation (Tx) von Lebersphäroiden in das ACE verwendet werden: 1. Lebersphäroide in der Kulturschale; 2. Sterile Kochsalzlösung; 3. Augensalbe; 4. Nadeln 23 g; 5. Kanüle; 6. Hamilton-Spritze; 7. Anästhesie-Gasschlauch; 8. Kopfhalterung und Gasmaske; 9. Heizkissen; 10. Maßgeschneiderte Grundplatte aus Metall; 11. Pinzette und solides Kreuzgelenk. (B) Aufbau der Kanüle und der Hamilton-Spritze: 1. Glaskanüle, die über einen Portex-Schlauch und eine 27G-Nadel mit der Hamilton-Spritze verbunden ist; 2. Die Glaskanüle ist über zusätzliche Segmente aus Silikonschläuchen und PharMed-Schläuchen mit dem Portex-Schlauch verbunden. 3. alternativ zusammengesetzte Kunststoffkanüle; 4. Teile, aus denen die Kunststoffkanüle besteht: 24G BD Insyte Kunststoffkatheter, der über einen PharMed-Schlauch angeschlossen und mit einer abgeschnittenen 10-μl-Pipettenspitze ummantelt ist, um Stabilität und Halt zu gewährleisten. (C) Darstellung der Tx-Operationsschritte: 1. Die Sphäroide werden in der Kanüle gesammelt; 2. Die Hornhaut wird mit einer Nadel durchstochen; 3. Die Kanüle wird in den Schnitt eingeführt und die Sphäroide werden in den ACE freigesetzt. 4. Von der Außenseite des Auges werden die Sphäroide nahe der Pupille und weg von der Inzision positioniert. (D) Stereoskopische Bilder von Lebersphäroiden (sph) im Mausauge am Tag der Operation und 3, 7 und 30 Tage nach der Tx. Pfeile zeigen lebensfähige Sphäroide an. (E) Transplantationsrate des Lebersphäroids (Größe von 1200 Zellen/Well) nach Tx, n= 9 Augen bei 6 Empfängermäusen. (F) Größe der Lebersphäroide in Kultur vor der Transplantation (in vitro n = 20 Sphäroide aus einer einzigen Präparation) und 1 Monat nach Tx in der ACE (in vivo n = 16 Sphäroide bei 3 Empfängermäusen), berechnet durch Mittelung des vertikalen und horizontalen Durchmessers. (G) Immunfluoreszenzfärbung von transplantierten Lebersphäroiden 2 Monate nach Tx, mit Vaskularisation (CD31, rosa, gestrichelte Linie markiert die Sphäroidmasse) und sympathischer Innervation (Tyrosinhydroxylase (TH), orange), Maßstabsbalken = 100 μm. Die Daten für Panel F wurden mit Genehmigung von Lazzeri-Barcelo et al.10 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Nichtinvasive intraokulare in vivo-Bildgebung von transplantierten Lebersphäroiden. (A) Material und Ausrüstung für die In-vivo-ACE-Bildgebung : 1. Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop; 2. Dunkler Kasten; 3. Motorisierter XYZ-Tisch; 4. Tauch-Ziel; 5. Kopfhalterung und Gasmaske; 6. Pinzette und solides Kreuzgelenk; 7. Heizkissen; 8. Maßgeschneiderte Grundplatte aus Metall. (B) Diagramm, das verschiedene Ansätze für die In-vivo-Bildgebung von Fluoreszenz-Messwerten in Leber-Sphäroiden darstellt, die in das Auge transplantiert wurden. (C-H) Repräsentative Bilder von ACE-Leber-Sphäroiden während der in vivo Bildgebung mittels konfokaler Mikroskopie. Das Rückstreusignal wird verwendet, um das Volumen und die Struktur des Sphäroids zu beobachten; (C) Blutgefäße, die durch intravenöse Injektion von fluoreszierendem Lektin markiert wurden, Maßstabsbalken = 100 μm; (D) Gallenkanal-Netzwerk, markiert durch Injektion von fluoreszierender CMFDA, Maßstabsbalken = 50 μm; (E) LDL-Aufnahme durch Injektion einer fluoreszierenden pHrodo-LDL-Sonde, Maßstabsbalken = 100 μm; (F) Td-Tomaten-exprimierende Hepatozyten, Pfeilspitzen kennzeichnen Zellkerne und Sternchen kennzeichnen intrasphäroide Gefäße, Maßstabsbalken = 50 μm; (G) Überwachung der Zellzyklusdynamik in FUCCI-exprimierenden Lebersphäroiden, Skalenbalken = 50 μm (Hauptbild) und 20 μm (Blow-up). (H) Lebersphäroide, die in vitro mit AAV8-GFP vor Tx transduziert und 6 Monate nach Tx im Auge abgebildet wurden, Skalenbalken = 50 μm. Das Bild in Panel G wurde mit Genehmigung von Lazzeri-Barcelo et al.10 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Tabelle 1: Lösungen für die Isolierung von primären Maus-Hepatozyten. Zusammensetzung der Lösungen und Puffer, die für die Isolierung von Hepatozyten bei Mäusen benötigt werden. Die Komponenten des Aufschlusspuffers und der Gradientenlösung sollten am Tag der Isolierung frisch gemischt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Tabelle 2. Konfokale Leica SP5 Mikroskopeinstellungen für die intraokulare In-vivo-Bildgebung von Leber-Sphäroiden. Die Tabelle wurde mit Genehmigung von Lazzeri et al.10 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Plattform für die intraokulare in vivo-Bildgebung von Leber-Sphäroiden, die in den ACE transplantiert wurden. Das ACE wurde zuvor als Transplantationsstelle für andere aus Organen gewonnene Mikrogewebe, wie z. B. Pankreasinseln^{11,12, verwendet,} da es eine einzigartige Transplantationsmikroumgebung aufweist, reich an Gefäßen, Nerven und Sauerstoff ist und den Zugang zur Bildgebung durch die Hornhaut ermöglicht. Während die intravitale Bildgebung der Leber die Visualisierung von Zellen und Prozessen in situ ermöglicht, ist ein longitudinales Monitoring nicht möglich. Die Bildgebung der Leber durch ein Bauchfenster erfordert eine komplexe Operation, und die Bewegung des Organs im Körper erschwert die Verfolgung einzelner Zellen im Laufe der Zeit. Daher ermöglicht dieses neuartige bildgebende Verfahren die nicht-invasive, longitudinale Überwachung von Leberzellen mit Einzelzellauflösung.

Dieses Protokoll gliedert sich in drei Teile. Die erste ist die Isolierung von primären Hepatozyten durch zweistufige Kollagenase-Perfusion, adaptiert von Charni-Natan et ^al.13, mit dem Unterschied, dass wir die Leberperfusion an der toten Maus und nicht an den anästhesierten lebenden Tieren durchführen. Diese Variation bringt gewisse Vorteile mit sich, wie z.B. weniger ethische Überlegungen und die Vermeidung von Narkoserückständen im Organismus. In dieser Arbeit generieren wir Lebersphäroide aus der hepatozytenangereicherten Fraktion der Isolierung, was jedoch nicht das Potenzial ausschließt, andere nicht-parenchymale Zellpopulationen unter Verwendung anderer spezialisierter Protokolle zu isolieren, um Sphäroide unterschiedlicher Zusammensetzung zu kokulturieren^14,15.

Der zweite Teil dieses Protokolls beinhaltet die Transplantation der Lebersphäroide in das ACE von Empfängermäusen. Dies ist eine schnelle (unter 10 Minuten) und einfache Operation, die an anästhesierten Mäusen durchgeführt wird und keine postoperative Behandlung erfordert. Die Hornhautpunktion dichtet sich selbst ab und heilt über 3-5 Tage. Gelegentlich wird während des Heilungsprozesses eine gewisse Trübungen um den Schnitt herum beobachtet, die jedoch innerhalb weniger Tage abklingen. Wir haben keine Fälle von anterioren Synechien in den Augen von operierten Tieren erlebt. Wir führen die Transplantationen in einem sauberen, aber offenen Labor und ohne Probleme mit Infektionen in den operierten Augen durch. Die Inokulation und Transplantation von Sphäroiden im Auge beeinträchtigt nicht das Sehvermögen und verändert nicht das Verhalten des Empfängertieres. In diesem Protokoll verwenden wir die Isofluran-Anästhesie sowohl für die Transplantationschirurgie als auch für die In-vivo-Bildgebung , die bei Mäusen gut vertragen wird. Durch seine dosisabhängige Wirkung lässt es sich während der gesamten Eingriffe leicht anpassen und bringt den Vorteil, dass die Schlaf- und Aufwachzeiten verkürzt werden. Es können jedoch auch alternative injizierbare Anästhetika verwendet werden. Nach der Transplantation lassen wir in der Regel 1 Monat warten, bis sich die Sphäroide vollständig transplantiert, vaskularisiert und innerviert haben, bevor wir Behandlungseingriffe und In-vivo-Bildgebung durchführen. Wir haben auch gezeigt, dass eine Transplantation und Transplantation mit humanen Lebersphäroiden und immungeschwächten Empfängermäusen möglich ist¹⁰.

Der dritte Teil dieser Methode ist die in vivo Bildgebung der transplantierten Lebersphäroide im ACE. Dieses Protokoll beschreibt den In-vivo-Bildgebungsaufbau , bei dem Mikroskopiegeräte verwendet werden, die üblicherweise in Forschungsbildgebungseinrichtungen zu finden sind. Darüber hinaus sind die Spezialmaterialien, wie z. B. die Mauskopfhalterung und die Kunststoffkanüle, jetzt kommerziell erhältlich. Mit diesem bildgebenden Aufbau sind wir in der Lage, Z-Schnitte zu erfassen und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Sphäroidarchitektur zu erhalten, abhängig von der Eindringtiefe des Lasers und der Fluoreszenzdetektion. Die Überwachung der zellulären Funktion in den transplantierten Lebersphäroiden beruht auf der Visualisierung fluoreszierender Proteine, die über Zelltypen, zelluläre Funktionen und Dynamik berichten. Somit kann diese Bildgebungsplattform mit verschiedenen Modalitäten, allein oder in Kombination, genutzt werden: (1) Fluoreszenzsonden können intravenös verabreicht werden, z. B. Antikörper zur Markierung und Verfolgung von Zellen sowie funktionelle Farbstoffe; (2) Lebersphäroide können aus Zellen erzeugt werden, die aus Reporter-Mausmodellen isoliert wurden, die leberspezifische fluoreszierende Proteine exprimieren, z. B. FUCCI-Lebersphäroide, die über die Dynamik des Zellzyklus berichten; (3) Die Bildung von Leber-Sphäroiden in vitro kann mit Transfektion oder Transduktion kombiniert werden, um die Sphäroide mit fluoreszierenden Proteinen und Biosensoren auszustatten. z. B. Adeno-assoziierte Viren. In unseren experimentellen Einstellungen und unter Verwendung eines einzelnen Photons zur Anregung beträgt die mögliche Abbildungstiefe etwa 60-100 μm. Dies hängt jedoch von der Laserleistung und der Verfügbarkeit der Multiphotonenbildgebung, den Emissionseigenschaften der Fluoreszenzsonde und der Empfindlichkeit der Detektoren sowie dem Blickwinkel ab, in den das Sphäroid eingepflanzt wird. Nach der Bildaufnahme kann die nachgelagerte Bildanalyse mit gängigen Programmen wie Image J und Imaris durchgeführt werden. Im Fall des FUCCI-Reporters können beispielsweise die zellzyklusaktiven Zellen in grün gezählt und der Anzahl der gesamten roten Blutkörperchen gegenübergestellt werden, um die Zellzyklusaktivität innerhalb des transplantierten Sphäroids zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht die ACE-Imaging-Plattform das Auftragen von Substanzen auf das Auge (in Form von Augentropfen) oder die direkte Injektion in das ACE, um das Transplantat zu behandeln und seine Reaktion zu überwachen. Postmortal können die transplantierten Sphäroide leicht durch manuelle Mikrodissektion entnommen werden und können durch Ex-vivo-Techniken wie Immunfluoreszenzfärbung, Transkriptomanalyse usw. wertvolle Informationen ^liefern.10.

Diese Technik hat gewisse Einschränkungen. Die erste ist, dass es sich bei den Empfängermäusen nach unserer Erfahrung um Albinos handeln muss, d.h. um eine nicht pigmentierte Iris. Bei der Transplantation werden die Leber-Sphäroide von einer Monoschicht aus Iriszellen bedeckt, was die Lebensfähigkeit oder Funktion der Sphäroide nicht beeinträchtigt, aber das Pigment in den Iriszellen verhindert die Bildgebung. Eine zweite Überlegung ist die Stabilität während der intraokularen Bildgebung bei anästhesierten Mäusen. Während der In-vivo-Bildgebungssitzungen müssen die Anästhesiekonzentration und die Atmung des Tieres genau überwacht werden, um Bewegungen zu minimieren. Nichtsdestotrotz sind wir mit den hier angegebenen Bildgebungseinstellungen in der Lage, eine hochauflösende Bildgebung auf Einzelzellebene zu erreichen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll die Implementierung einer nicht-invasiven In-vivo-Bildgebungsplattform von leberähnlichem Gewebe beschreibt, das in die Augen von Mäusen transplantiert wurde. Wir verwenden einfache Verfahren, gängige Geräte und erschwingliche Materialien, was es für viele Ermittler zu einem erreichbaren Ansatz macht. Dieses Modell kombiniert die Vorteile von in vitro 3D-Lebersphäroiden mit dem in vivo Milieu und der optischen Zugänglichkeit, die das ACE bietet, um eine wertvolle Plattform für die Untersuchung der Leberphysiologie und -pathologie in der Grundlagenforschung und im präklinischen Umfeld zu schaffen.

Materials

27 G butterfly needle	Venofix	4056388
AAV8-CAG-GFP	Charles River	CV17169-AV9	Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol	N/A	N/A
Absorbent pad	Attends	203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson	#003574 and #007914	Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)	Jackson	#000058	Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH	INFRAFRONTIER/EMMA	EM:08395	Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in	BD Medical	381212
Borosillicate standard glass cappilaries	World Precision Instruments	1B150-4
Cell lifter	Corning	3008
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Custom-made metal plate	Hardware store	N/A
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	Model PC-100
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Electric heating pad	Hardware store	N/A
FBS	Gibco	N/A
GlutaMAX	Gibco	35050061
Green CMFDA	Abcam	ab145459	Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe	Hamilton	81242	Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red	Gibco	14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective	Leica	N/A
HEPES	Gibco	15630080
Induction chamber 0.8 L	Univentor	8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G)	Gibco	41400045
Isoflurane	Baxter	N/A
Lectin DyLight-649	Invitrogen	L32472	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001
Microelectrode beveler	World Precision Instruments	Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask	Narshige	Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Fisher	174929
Oculentum simplex	APL	N/A
PBS 10x	Gibco	14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644
Peristaltic pump	Ismatec	Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing	VWR	VERN070540-07	Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL	Invitrogen	L34356	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing	Smiths Medical	800/100/140	Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat	Hardware store	N/A
Sodium chloride 0.9%	Braun	N/A
Solid Universal Joint	Narshige	Model UST-2
Stereomicroscope	Leica	Model M80
Suspension culture dish 35 mm	Sarstedt	833900500
Temgesic	Indivor	N/A	Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing	VWR	228-1450	Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Univentor 400 Anesthesia unit	Univentor	8323001
Upright laser scanning confocal microscope	Leica	Model TCS SP5 II
Viscotears	Novartis	N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red	Gibco	22551089