التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في الغرفة الأمامية لعين الفأر
Summary
هنا ، نصف منصة تسمح بالتصوير غير الجراحي في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في الغرفة الأمامية لعين الفأر. يمتد سير العمل من توليد كرويات من خلايا الكبد الأولية إلى الزرع في عين الفأر والتصوير في الجسم الحي بدقة خلوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر.
Abstract
تعوق الدراسات الطبية الحيوية للكبد في الثدييات بسبب عدم وجود طرق للتصوير الطولي غير الباضع في الجسم الحي بدقة خلوية. حتى الآن ، يمكن التصوير البصري للكبد في الموقع عن طريق التصوير داخل الجسم ، والذي يوفر تصويرا عالي الدقة على المستوى الخلوي ولكن لا يمكن إجراؤه عدة مرات ، وبالتالي طوليا في نفس. تسمح طرق التصوير غير الباضعة ، مثل التلألؤ البيولوجي ، بجلسات تصوير متكررة على نفس ولكنها لا تحقق دقة الخلية. لمعالجة هذه الفجوة المنهجية ، قمنا بتطوير منصة للتصوير غير الجراحي في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في الغرفة الأمامية لعين الفأر. في سير العمل الموصوف في هذه الدراسة ، يتم إنشاء كرويات كبد الفأر الأولية في المختبر وزرعها في الغرفة الأمامية لعين الفئران المتلقية ، حيث تنقش على القزحية. تعمل القرنية كنافذة طبيعية للجسم يمكننا من خلالها تصوير الكرات المطعمة بواسطة المجهر التقليدي متحد البؤر. تعيش الأجسام الكروية لعدة أشهر في العين ، يمكن خلالها دراسة الخلايا في سياقات الصحة والمرض ، بالإضافة إلى مراقبتها استجابة للمحفزات المختلفة خلال جلسات التصوير المتكررة باستخدام مجسات الفلورسنت المناسبة. في هذا البروتوكول ، نقدم تفصيلا للخطوات اللازمة لتنفيذ نظام التصوير هذا ونشرح أفضل طريقة لتسخير إمكاناته.
Introduction
إن مراقبة وظائف الكبد في الثدييات أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب عدم وجود تقنيات تصوير عالية الدقة وغير جراحية في الجسم الحي . يعوق تصور هذا العضو موقعه الذي يتعذر الوصول إليه ، ومن أجل تجميع العمليات الخلوية معا ، تعتمد الدراسات في الجسم الحي على التضحية بالحيوانات في نقاط زمنية مختلفة. للتحايل على هذا الحد من التصوير ، يعتمد الكثير من العمل على النماذج المختبرية ، حيث يتم تصور الأنسجة الدقيقة الشبيهة بالكبد ودراستها في بيئة خاضعة للرقابة.
في السنوات الأخيرة ، ساعد تطوير أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد ، مثل كرويات الكبد ، في أبحاث الكبد المتقدمة. كرويات الكبد هي مجاميع متعددة الخلايا تحاكي البيئة الدقيقة والتفاعلات المعقدة بين الخلايا والخلايا لأنسجة الكبد إلى حد ما1 وتوفر مزايا واضحة على الثقافات أحادية الطبقة التقليدية 2,3. تستخدم كرويات الكبد أيضا كنماذج لأمراض الكبد المختلفة4،5،6 وكانت مفيدة لفهم آليات المرض. ومع ذلك ، فإن القيود الرئيسية لنماذج الكبد الحالية في المختبر هي عدم وجود بيئة فسيولوجية في الجسم الحي ووقت الاستخدام المحدود في الثقافة (حوالي 20 يوما) 3. تم زرع كرويات الكبد سابقا في مواقع مختلفة في الجسم الحي ، مثل تحت كبسولة الكلى7 أو داخل الصفاق8 ، والتي لا يمكن الوصول إليها للتصوير البصري. تصوير الكبد داخل الجسم هو تقنية حديثة تقدم تصويرا في الوقت الفعلي بدقة الخلايا. حاليا ، هذا التصوير الكبدي في الموقع ممكن فقط على العضو الخارجي ، وهو شديد التوغل وغالبا ما يكون المحطة9. على الرغم من أن تركيب نافذة البطن سيسمح بجلسات تصوير الكبد المتكررة ، إلا أنه يستلزم جراحة معقدة ورعاية لاحقة.
لإجراء مراقبة طولية بدقة خلوية ، استكشفنا زرع كرويات الكبد في الغرفة الأمامية للعين (ACE) للفئران ، حيث يتم غرس الأنسجة الشبيهة بالكبد في بيئة فسيولوجية ، متصلة بمحفزات الجسم ، ويمكن الوصول إليها للتصوير البصري. القرنية عبارة عن نسيج شفاف ويعمل كنافذة يمكن من خلالها تصوير الأنسجة الدقيقة المحفورة على القزحية بشكل غير جراحي وطولي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. هنا ، نقدم سير عمل هذه المنصة المطورة حديثا للتصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد10. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لتنفيذه ، مقسم إلى (1) استخراج خلايا كبد الفأر الأولية وتشكيل كرويات الكبد في المختبر ، (2) زرع كرويات الكبد في ACE للفئران المتلقية ، و (3) التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة في الفئران المخدرة. علاوة على ذلك ، سنعرض بعض إمكانيات وتطبيقات منصة التصوير هذه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول منصة جديدة للتصوير داخل العين في الجسم الحي لكرويات الكبد المحفورة في ACE. تم استخدام ACE سابقا كموقع زرع للأنسجة الدقيقة الأخرى المشتقة من الأعضاء ، مثل جزر البنكرياس11,12 ، نظرا لبيئتها الدقيقة الفريدة من نوعها ، كونها غنية بالأوعية والأعصاب والأكسجين ، والوصول إلى التصوير من خلال القرنية. بينما يتيح تصوير الكبد داخل الجسم تصور الخلايا والعمليات في الموقع ، فإن المراقبة الطولية غير ممكنة. يستلزم تصوير الكبد من خلال نافذة البطن جراحة معقدة ، كما أن حركة العضو داخل الجسم تجعل تتبع الخلية الواحدة بمرور الوقت أمرا صعبا. ومن ثم ، فإن طريقة التصوير الجديدة هذه تتيح المراقبة الطولية غير الغازية لخلايا الكبد بدقة خلية واحدة.
ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أجزاء. الأول هو عزل خلايا الكبد الأولية عن طريق نضح كولاجيناز من خطوتين ، مقتبس من Charni-Natan et al.13 ، مع اختلاف أننا نقوم بنضح الكبد على الفأر الميت بدلا من الحية المخدرة. هذا الاختلاف يجلب مزايا معينة ، مثل اعتبارات أخلاقية أقل وتجنب بقايا التخدير في الكائن الحي. في هذا العمل ، نقوم بتوليد كرويات الكبد من الجزء المخصب بخلايا الكبد من العزلة ، لكن هذا لا يستبعد إمكانية عزل مجموعات الخلايا غير المتنية الأخرى باستخدام بروتوكولات متخصصة أخرى لصنع كرويات مشتركة ذات تركيبة متنوعة14,15.
يتضمن الجزء الثاني من هذا البروتوكول زرع كرويات الكبد في ACE للفئران المتلقية. هذه عملية جراحية سريعة (أقل من 10 دقائق) وبسيطة يتم إجراؤها على الفئران المخدرة ولا تتطلب أي علاج بعد الجراحة. ثقب القرنية الأختام الذاتية ويشفى على مدى 3-5 أيام. في بعض الأحيان ، أثناء عملية الشفاء ، لوحظ بعض الضباب حول الشق ، ولكن هذا يزول في غضون أيام قليلة. لم نشهد حالات تزامن أمامي في عيون التي يتم تشغيلها. نقوم بإجراء عمليات الزرع في مختبر نظيف ولكن في الهواء الطلق وبدون مشاكل مع الالتهابات في العيون التي يتم تشغيلها. التلقيح وتطعيم الكرويات في العين لا يضر بالرؤية أو يغير سلوك المتلقي. في هذا البروتوكول ، نستخدم تخدير الأيزوفلوران لكل من جراحة الزرع والتصوير في الجسم الحي ، وهو أمر جيد التحمل في الفئران. نظرا لتأثيره المعتمد على الجرعة ، يمكن تعديله بسهولة طوال الإجراءات ويجلب ميزة تقليل أوقات النوم والاستيقاظ. ومع ذلك ، يمكن استخدام التخدير البديل عن طريق الحقن. بعد الزرع ، نسمح عموما بشهر 1 للكرويات للتطعيم الكامل ، وتصبح الأوعية الدموية ، وتعصب ، قبل إجراء التدخلات العلاجية والتصوير في الجسم الحي . لقد أظهرنا أيضا أن الزرع والنقش ممكن باستخدام كرويات الكبد البشري والفئران المتلقية التي تعاني من نقص المناعة10.
الجزء الثالث من هذه الطريقة هو التصوير في الجسم الحي لكرويات الكبد المطعمة في ACE. يصف هذا البروتوكول إعداد التصوير في الجسم الحي ، والذي يستخدم معدات الفحص المجهري الموجودة عادة في مرافق التصوير البحثية. علاوة على ذلك ، فإن المواد المتخصصة ، مثل حامل رأس الماوس والقنية البلاستيكية ، متاحة الآن تجاريا. باستخدام إعداد التصوير هذا ، يمكننا التقاط المقاطع z والحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للبنية الكروية ، اعتمادا على عمق اختراق الليزر واكتشاف التألق. تعتمد مراقبة الوظيفة الخلوية في كرويات الكبد المطعمة على تصور البروتينات الفلورية التي تقدم تقارير عن أنواع الخلايا والوظائف الخلوية والديناميكيات. وبالتالي ، يمكن استغلال منصة التصوير هذه باستخدام طرق مختلفة ، بمفردها أو مجتمعة: (1) يمكن إعطاء مجسات الفلورسنت عن طريق الوريد ، على سبيل المثال ، الأجسام المضادة لتسمية الخلايا وتتبعها وكذلك الأصباغ الوظيفية ؛ (2) يمكن توليد كرويات الكبد من الخلايا المعزولة من نماذج الفئران المراسلة التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الخاصة بالكبد ، على سبيل المثال ، كرويات الكبد FUCCI التي تقدم تقارير عن ديناميكيات دورة الخلية ؛ (3) يمكن الجمع بين تكوين كرويات الكبد في المختبر مع النقل أو التنبيغ ، لتزويد الكائنات الكروية ببروتينات الفلورسنت وأجهزة الاستشعار الحيوية. على سبيل المثال ، الفيروسات المرتبطة بالغدية. في إعداداتنا التجريبية وباستخدام فوتون واحد للإثارة ، يكون عمق التصوير الممكن تحقيقه حوالي 60-100 ميكرومتر. ومع ذلك ، فإن هذا يعتمد على قوة الليزر وتوافر التصوير متعدد الفوتونات ، وخصائص انبعاث مسبار مضان وحساسية أجهزة الكشف ، وكذلك زاوية العين التي يتم فيها نقش الكرة الكروية. بعد الحصول على التصوير ، يمكن إجراء تحليل الصورة النهائية باستخدام برامج شائعة مثل Image J و Imaris. على سبيل المثال ، في حالة مراسل FUCCI ، يمكن حساب الخلايا النشطة لدورة الخلية باللون الأخضر ومقارنتها بعدد الخلايا الحمراء الكلية لتقييم نشاط دورة الخلية داخل الكروية المطعمة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح منصة التصوير ACE-imaging بتطبيق المواد على العين (في شكل قطرات للعين) أو حقنها مباشرة في ACE لعلاج الكسب غير المشروع ومراقبة تفاعله. بعد الوفاة ، يمكن بسهولة استرداد الكرويات المزروعة عن طريق التشريح المجهري اليدوي ويمكن أن توفر معلومات قيمة عن طريق تقنيات خارج الجسم الحي ، مثل تلطيخ التألق المناعي ، والتحليل النسخي ، وما إلى ذلك.10.
هذه التقنية لها قيود معينة. الأول هو أنه من تجربتنا ، يجب أن تكون الفئران المتلقية ألبينو ، أي لديها قزحية غير مصطبغة. عند النقش ، تصبح كرويات الكبد مغطاة بطبقة أحادية من خلايا القزحية ، والتي لا تؤثر على صلاحية أو وظيفة الكائنات الكروية ، لكن الصباغ الموجود في خلايا القزحية يمنع التصوير. الاعتبار الثاني هو الاستقرار أثناء التصوير داخل العين في الفئران المخدرة. أثناء جلسات التصوير في الجسم الحي ، يجب مراقبة تركيز التخدير وتنفس عن كثب لتقليل الحركة. ومع ذلك ، باستخدام إعدادات التصوير المشار إليها هنا ، يمكننا تحقيق تصوير عالي الدقة على مستوى الخلية الواحدة.
للتلخيص ، يصف هذا البروتوكول تنفيذ منصة تصوير غير جراحية في الجسم الحي لأنسجة شبيهة بالكبد محفورة في عيون الفئران. نحن نستخدم إجراءات سهلة ومعدات مشتركة ومواد ميسورة التكلفة ، مما يجعلها نهجا يمكن تحقيقه للعديد من المحققين. يجمع هذا النموذج بين مزايا كرويات الكبد 3D في المختبر مع الوسط في الجسم الحي وإمكانية الوصول البصري التي يوفرها ACE لإنشاء منصة قيمة لدراسة فسيولوجيا الكبد وعلم الأمراض في البحوث الأساسية والإعدادات قبل السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية السويدية للسكري ، وصناديق معهد كارولينسكا ، ومجلس البحوث السويدي ، ومؤسسة نوفو نورديسك ، ومؤسسة فاميلي إيرلينج بيرسون ، وبرنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في معهد كارولينسكا ، ومؤسسة فاميلي كنوت وأليس والنبرغ ، ومؤسسة جوناس وكريستينا أف يوشنيك ، والجمعية السويدية لأمراض السكري و ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. تم إنشاء الرسومات الشكلية بواسطة FL-B باستخدام BioRender.com.
Materials
| 27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
| AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
| Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
| Absorbent pad | Attends | 203903 | |
| Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
| BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
| Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
| FBS | Gibco | N/A | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
| Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
| HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| Isoflurane | Baxter | N/A | |
| Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
| Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
| Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
| Oculentum simplex | APL | N/A | |
| PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
| PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
| PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
| pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
| Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
| Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
| Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
| Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
| Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
| Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
| Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
| Viscotears | Novartis | N/A | |
| William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |
References
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Sci Rep. 6, 25187 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration. Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248 (2020).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Sci Rep. 8 (1), 14297 (2018).
- Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. 3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications. Biotechnol J. 14 (7), e1800347 (2019).
- Shibuya, K., et al. The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation. Cell Transplant. 30, 9636897211000014 (2021).
- Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy. Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Lazzeri-Barcelo, F., et al. Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function. Nat Commun. 15 (1), 767 (2024).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Baze, A., et al. Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells. Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).
- Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).
