Här beskriver vi en plattform som möjliggör icke-invasiv in vivo-avbildning av leversfäroider inympade i den främre kammaren i musögat. Arbetsflödet sträcker sig från generering av sfäroider från primära leverceller till transplantation i musögat och in vivo-avbildning med cellulär upplösning genom konfokalmikroskopi.
Biomedicinska studier av levern hos däggdjur hindras av att det saknas metoder för in vivo icke-invasiv longitudinell avbildning med cellulär upplösning. Hittills har optisk avbildning av levern in situ varit möjlig genom intravital avbildning, som erbjuder högupplöst avbildning på cellulär nivå men som inte kan utföras flera gånger och därför i längdriktningen på samma djur. Icke-invasiva avbildningsmetoder, såsom bioluminiscens, tillåter upprepade avbildningssessioner på samma djur men uppnår inte cellupplösning. För att ta itu med denna metodlucka har vi utvecklat en plattform för icke-invasiv in vivo-avbildning av leversfäroider transplanterade i den främre kammaren i musögat. I det arbetsflöde som beskrivs i denna studie genereras primära leversfäroider från möss in vitro och transplanteras in i den främre kammaren i ögat hos mottagande möss, där de transplanterar på iris. Hornhinnan fungerar som ett naturligt kroppsfönster genom vilket vi kan avbilda de transplanterade sfäroiderna med konventionell konfokalmikroskopi. Sfäroiderna överlever i månader i ögat, under vilka cellerna kan studeras i samband med hälsa och sjukdom, samt övervakas som svar på olika stimuli över upprepade avbildningssessioner med hjälp av lämpliga fluorescerande sonder. I det här protokollet ger vi en uppdelning av de nödvändiga stegen för att implementera detta bildsystem och förklarar hur man bäst utnyttjar dess potential.
Övervakningen av leverfunktionen hos däggdjur under hälsa och sjukdom begränsas av bristen på högupplösta, icke-invasiva in vivo-avbildningstekniker . Visualiseringen av detta organ hindras av dess otillgängliga läge, och för att pussla ihop cellulära processer förlitar sig in vivo-studier på att djur offras vid olika tidpunkter. För att kringgå denna avbildningsbegränsning förlitar sig mycket arbete på in vitro-modeller , där leverliknande mikrovävnader visualiseras och studeras i en kontrollerad miljö.
Under de senaste åren har utvecklingen av tredimensionella odlingssystem, såsom leversfäroider, hjälpt och främjat leverforskningen. Leversfäroider är flercelliga aggregat som i viss utsträckning efterliknar mikromiljön och komplexa cell-cellinteraktioner i levervävnad1 och erbjuder klara fördelar jämfört med traditionella monolagerkulturer 2,3. Leversfäroider används också som modeller för olika leversjukdomar 4,5,6 och har varit avgörande för att förstå sjukdomsmekanismer. Viktiga begränsningar med de nuvarande in vitro-levermodellerna är dock avsaknaden av en fysiologisk in vivo-miljö och den begränsade användningstiden i odling (cirka 20 dagar)3. Leversfäroider har tidigare transplanterats till olika platser in vivo, till exempel under njurkapseln7 eller intraperitonealt8, som inte är tillgängliga för optisk avbildning. Intravital leveravbildning är en toppmodern teknik som erbjuder cellupplösning i realtid. För närvarande är denna in situ leveravbildning endast möjlig på det exterioriserade organet, som är mycket invasivt och ofta terminal9. Även om montering av ett bukfönster skulle möjliggöra upprepade leveravbildningssessioner, innebär det komplex kirurgi och eftervård.
För att utföra longitudinell övervakning med cellulär upplösning utforskade vi transplantation av leversfäroider till den främre kammaren i ögat (ACE) hos möss, där den leverliknande vävnaden är inympad i en fysiologisk miljö, kopplad till kroppens stimuli och tillgänglig för optisk avbildning. Hornhinnan är en genomskinlig vävnad och fungerar som ett fönster genom vilket mikrovävnader som är transplanterade på iris kan avbildas icke-invasivt och longitudinellt genom konfokalmikroskopi. Här presenterar vi ett arbetsflöde för denna nyutvecklade plattform för in vivo avbildning av leversfäroider10. Detta protokoll är en steg-för-steg-guide för dess implementering, uppdelad i (1) extraktion av primära leverceller från möss och in vitro-bildning av leversfäroider, (2) transplantation av leversfäroider till ACE hos mottagande möss och (3) in vivo-avbildning av transplanterade leversfäroider i sövda möss. Dessutom kommer vi att visa upp några av möjligheterna och tillämpningarna av denna bildbehandlingsplattform.
Detta protokoll beskriver en ny plattform för intraokulär in vivo-avbildning av leversfäroider inympade i ACE. ACE har tidigare använts som en transplantationsplats för andra organ-härledda mikrovävnader, såsom bukspottkörtelns öar 11,12, på grund av dess unika engraftmentmikromiljö, som är rik på kärl, nerver och syre, och tillgången till avbildning genom hornhinnan. Medan intravital leveravbildning möjliggör visualisering av celler och processer in situ, är longitudinell övervakning inte möjlig. Leveravbildning genom ett bukfönster innebär komplex kirurgi, och organets rörelse i kroppen gör det svårt att spåra enskilda celler över tid. Följaktligen möjliggör denna nya avbildningsmetod icke-invasiv, longitudinell övervakning av leverceller med encellsupplösning.
Detta protokoll är uppdelat i tre delar. Den första är isoleringen av primära hepatocyter via tvåstegs kollagenasperfusion, anpassad från Charni-Natan et al.13, med skillnaden att vi utför leverperfusionen på den döda musen istället för de sövda levande djuren. Denna variation ger vissa fördelar, såsom färre etiska överväganden och undvikande av anestesirester i organismen. I detta arbete genererar vi leversfäroider från den hepatocytberikade fraktionen av isoleringen, men detta utesluter inte potentialen att isolera andra icke-parenkymala cellpopulationer med hjälp av andra specialiserade protokoll för att göra samkultursfäroider med olika sammansättning14,15.
Den andra delen av detta protokoll innebär transplantation av leversfäroiderna till ACE hos mottagarmöss. Detta är en snabb (under 10 min) och enkel operation som utförs på sövda möss och som inte kräver någon postoperativ behandling. Hornhinnan punkterar sig själv och läker under 3-5 dagar. Ibland, under läkningsprocessen, observeras en viss disning runt snittet, men detta försvinner inom några dagar. Vi har inte upplevt några fall av främre synechia hos opererade djur. Vi utför transplantationsprocedurerna i ett rent men öppet laboratorium och utan problem med infektioner i de opererade ögonen. Inokulering och ingrepp av sfäroider i ögat äventyrar inte synen eller förändrar beteendet hos mottagardjuret. I detta protokoll använder vi isoflurananenestesi för både transplantationskirurgi och in vivo-avbildning , vilket tolereras väl i möss. På grund av dess dosberoende effekt kan den enkelt justeras under hela proceduren och ger fördelen att minska sömn- och uppvakningstiderna. Alternativa injicerbara bedövningsmedel kan dock användas. Efter transplantation tillåter vi i allmänhet 1 månad för sfäroiderna att helt transplantera, bli vaskulariserade och innerverade, innan behandlingsinterventioner och in vivo-avbildning utförs. Vi har också visat att transplantation och engraftment är möjligt med hjälp av humana leversfäroider och immunsupprimerade mottagarmöss10.
Den tredje delen av denna metod är in vivo-avbildning av de transplanterade leversfäroiderna i ACE. Detta protokoll beskriver in vivo-avbildningsuppställningen, som använder mikroskopiutrustning som vanligtvis finns i forskningsanläggningar. Dessutom är de specialiserade materialen, som hållaren för mushuvudet och plastkanylen, nu kommersiellt tillgängliga. Med denna bildbehandlingsuppställning kan vi fånga z-sektioner och få en tredimensionell rekonstruktion av sfäroidarkitekturen, beroende på djupet av laserpenetration och fluorescensdetektering. Övervakning av cellulär funktion i de transplanterade leversfäroiderna bygger på visualisering av fluorescerande proteiner som rapporterar om celltyper, cellulära funktioner och dynamik. Således kan denna avbildningsplattform utnyttjas med hjälp av olika modaliteter, ensamma eller i kombination: (1) Fluorescerande sonder kan administreras intravenöst, t.ex. antikroppar för att märka och spåra celler samt funktionella färgämnen; (2) Leversfäroider kan genereras från celler isolerade från reportermusmodeller som uttrycker leverspecifika fluorescerande proteiner, t.ex. FUCCI-leversfäroider som rapporterar om cellcykelns dynamik; (3) Bildandet av leversfäroider in vitro kan kombineras med transfektion eller transduktion för att utrusta sfäroiderna med fluorescerande proteiner och biosensorer. t.ex. adenoassocierade virus. I våra experimentella miljöer och genom att använda en enda foton för excitation är det avbildningsdjup som är möjligt att uppnå ungefär 60-100 μm. Detta är dock beroende av laserns effekt och multifotonavbildningens tillgänglighet, fluorescenssondens emissionsegenskaper och känsligheten hos detektorerna, samt vinkeln på ögat som sfäroiden är inympad i. Efter bildinsamling kan bildanalysen nedströms utföras med hjälp av populära program som Image J och Imaris. Till exempel, i fallet med FUCCI-rapportören, kan cellcykelaktiva celler i grönt räknas och kontrasteras mot antalet totala röda blodkroppar för att bedöma cellcykelaktiviteten inom den transplanterade sfäroiden. Dessutom gör ACE-avbildningsplattformen det möjligt att applicera ämnen på ögat (i form av ögondroppar) eller injiceras direkt i ACE för att behandla transplantatet och övervaka dess reaktion. Efter döden kan de transplanterade sfäroiderna enkelt återfinnas genom manuell mikrodissektion och kan ge värdefull information genom ex vivo-tekniker, såsom immunofluorescensfärgning, transkriptomisk analys, etc.10.
Denna teknik har vissa begränsningar. Den första är att enligt vår erfarenhet måste mottagarmössen vara albino, dvs ha icke-pigmenterad iris. Vid engraftment blir leversfäroiderna täckta av ett monolager av irisceller, vilket inte påverkar sfäroidernas livskraft eller funktion, men pigmentet i iriscellerna förhindrar avbildning. En andra faktor är stabiliteten under intraokulär avbildning hos sövda möss. Under in vivo-avbildningssessionerna måste anestesikoncentrationen och andningen hos djuret övervakas noggrant för att minimera rörelse. Med hjälp av de bildinställningar som anges här kan vi dock uppnå högupplöst avbildning på encellsnivå.
För att sammanfatta beskriver detta protokoll implementeringen av en icke-invasiv in vivo-avbildningsplattform av leverliknande vävnad inympad i ögonen på möss. Vi använder enkla procedurer, vanlig utrustning och prisvärda material, vilket gör det till ett uppnåeligt tillvägagångssätt för många utredare. Denna modell kombinerar fördelarna med in vitro 3D-leversfäroider med in vivo-miljön och den optiska tillgängligheten som tillhandahålls av ACE för att skapa en värdefull plattform för att studera leverfysiologi och patologi i grundforskning och prekliniska miljöer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Svenska Diabetesförbundet, Karolinska Institutets fonder, Vetenskapsrådet, Novo Nordisk Fonden, Familjen Erling-Perssons Stiftelse, Strategiska forskningsprogrammet inom diabetes vid Karolinska Institutet, Familjen Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse, Jonas & Christina af Jochnicks Stiftelse, Svenska Diabetologiförbundet och ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. Figurritningarna skapades av FL-B med hjälp av BioRender.com.
27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
Absorbent pad | Attends | 203903 | |
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
FBS | Gibco | N/A | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
Isoflurane | Baxter | N/A | |
Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
Oculentum simplex | APL | N/A | |
PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
Viscotears | Novartis | N/A | |
William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |