זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת של DNA של נגיף הפטיטיס B
Summary
זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) של DNA של נגיף הפטיטיס B (HBV) היא שיטה רגישה ומדויקת לאבחון וניטור זיהום HBV. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי DNA HBV ומדידת עומס נגיפי של דגימה.
Abstract
נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא גורם משמעותי למחלות כבד ברחבי העולם. זה יכול להוביל לזיהומים חריפים או כרוניים, מה שהופך אנשים רגישים מאוד שחמת קטלנית וסרטן הכבד. זיהוי וכימות מדויקים של DNA HBV בדם חיוניים לאבחון וניטור זיהום HBV. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי DNA HBV היא PCR בזמן אמת, אשר ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הנגיף ולהעריך את העומס הנגיפי כדי לפקח על התגובה לטיפול אנטי ויראלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או פלזמה באמצעות ערכה מבוססת PCR בזמן אמת המסומנת IVD. הערכה משתמשת בפריימרים ובבדיקות המכוונים לאזור הליבה השמור ביותר של גנום HBV ויכולים לכמת במדויק את כל הגנוטיפים של HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I ו-J). הערכה כוללת גם בקרה פנימית אנדוגנית לניטור עיכוב PCR אפשרי. בדיקה זו נמשכת 40 מחזורים, והחיתוך שלה הוא 38 Ct. לכימות DNA HBV בדגימות קליניות, מסופקת ערכה של 5 תקני כימות עם הערכה. התקנים מכילים ריכוזים ידועים של DNA ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). התקנים משמשים לאימות הפונקציונליות של הגברה ספציפית ל- HBV DNA וליצירת עקומה סטנדרטית, המאפשרת לכמת DNA HBV בדגימה. DNA HBV נמוך של 2.5IU/mL זוהה באמצעות ערכת PCR. הרגישות הגבוהה ויכולת השחזור של הערכה הופכות אותה לכלי רב עוצמה במעבדות קליניות, ומסייעת לאנשי מקצוע בתחום הבריאות באבחון וניהול יעיל של זיהומי HBV.
Introduction
נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא נגיף DNA דו-גדילי חלקית מהסוג Orthohepadnavirus וממשפחת Hepadnaviridae 1. זה יכול לעורר זיהום כרוני שנמשך לאורך כל החיים, מה שעלול להוביל שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular 2,3,4. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), אוכלוסייה מוערכת של 296 מיליון אנשים חיו עם זיהום כרוני הפטיטיס B בשנת 2019, ו -1.5 מיליון אנשים נדבקו חדשים מדי שנה5.
זיהוי ומדידה של DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה משמשים כשיטה רבת ערך לאיתור אנשים עם זיהום מתמשך בהפטיטיס B, הערכת יעילות הטיפול האנטי-ויראלי וחיזוי ההסתברות להצלחת הטיפול 6,7,8,9,10,11. עומס נגיפי גבוה קשור לסיכון מוגבר להתקדמות מחלות כבד, כולל שחמת הכבד וסרטן הכבד12,13. לפיכך, מדידה מדויקת של עומס נגיפי היא חיונית למעקב אחר התקדמות זיהום HBV ולקבלת החלטות לגבי הטיפול.
לבדיקות PCR כמותיות בזמן אמת יש רגישות גבוהה יותר, טווח דינמי רחב יותר וכימות מדויק יותר של DNA HBV מאשר טכניקות PCR קונבנציונליות 14,15,16,17. מספר ערכות אבחון מולקולריות מסחריות בזמן אמת מבוססות PCR לכימות DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה זמינות בשוק. במאמר זה אנו מתארים תהליך עבודה מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או בפלזמה באמצעות ערכה מסחרית זמינה מסחרית המבוססת על PCR בזמן אמת. הערכה נמצאת בשימוש נרחב18,19, בעלות נמוכה אך רגישה מאוד, ומאפייני הביצועים שלה דומים לערכות אחרות הזמינות מסחרית עם סימון CE18. מלבד הגברה של אזור היעד HBV, גן בקרה פנימית אנדוגני כלול גם בערכה כדי לאמת את איכות הדגימות, איכות ה- DNA שחולץ, הגברת PCR ועיכוב PCR אפשרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
קוד NIBSC 10/266 הוקצה ליחידה של 9,55,000 IU/mL כאשר הוא מורכב מחדש ב- 0.5 מ”ל של מים ללא Nuclease בהתאם למידע הספק21. זה יכול להיחשב מדגם חיובי HBV עומס גבוה. העומס הנגיפי של HBV שנקבע על-ידי ערכת העומס הנגיפי ששימשה במחקר זה היה 6,65,900 IU/mL (איור 4). מכיוון שיעילות מיצוי הדנ”א של כל ערכת מי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפראבין, קוסום, צ’נדאן, אישה, רשמי, בבלי, שיבני, אנקיטה ושייקה על עזרתם הטכנית.
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- . World Health Organization fact sheet Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023)
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -. Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -. J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -. A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. . Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- . Nibsc-14/198 Available from: https://www.nibsc.org/ (2023)
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
