Rilevamento e quantificazione in tempo reale del DNA del virus dell'epatite B basato sulla reazione a catena della polimerasi
Summary
Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell’epatite B (HBV) basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale sono un metodo sensibile e accurato per diagnosticare e monitorare l’infezione da HBV. Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento del DNA dell’HBV e la misurazione della carica virale di un campione.
Abstract
Il virus dell’epatite B (HBV) è una causa significativa di malattie del fegato in tutto il mondo. Può portare a infezioni acute o croniche, rendendo gli individui altamente suscettibili alla cirrosi fatale e al cancro al fegato. Il rilevamento e la quantificazione accurati del DNA dell’HBV nel sangue sono essenziali per la diagnosi e il monitoraggio dell’infezione da HBV. Il metodo più comune per rilevare il DNA dell’HBV è la PCR in tempo reale, che può essere utilizzata per rilevare il virus e valutare la carica virale per monitorare la risposta alla terapia antivirale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione e la quantificazione del DNA dell’HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato su PCR in tempo reale marcato IVD. Il kit utilizza primer e sonde che mirano alla regione centrale altamente conservata del genoma dell’HBV e possono quantificare con precisione tutti i genotipi di HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). Il kit include anche un controllo interno endogeno per monitorare l’eventuale inibizione della PCR. Questo test viene eseguito per 40 cicli e il suo cutoff è di 38 Ct. Per la quantificazione del DNA dell’HBV nei campioni clinici, con il kit viene fornito un set di 5 standard di quantificazione. Gli standard contengono concentrazioni note di DNA specifico per l’HBV che sono calibrate rispetto al 4° standard internazionale dell’OMS per il DNA dell’HBV per il test dell’acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Gli standard sono utilizzati per convalidare la funzionalità dell’amplificazione del DNA HBV-specifico e per generare una curva standard, consentendo la quantificazione del DNA dell’HBV in un campione. Il DNA dell’HBV fino a 2,5 UI/mL è stato rilevato utilizzando il kit PCR. L’elevata sensibilità e riproducibilità del kit lo rendono un potente strumento nei laboratori clinici, aiutando gli operatori sanitari a diagnosticare e gestire efficacemente le infezioni da HBV.
Introduction
Il virus dell’epatite B (HBV) è un virus a DNA parzialmente a doppio filamento del genere Orthohepadnavirus e della famiglia Hepadnaviridae 1. Può scatenare un’infezione cronica che persiste per tutta la vita, portando potenzialmente a cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare 2,3,4. Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2019 una popolazione stimata di 296 milioni di persone conviveva con l’infezione cronica da epatite B e 1,5 milioni di persone venivano infettate ogni anno5.
L’identificazione e la misurazione del DNA dell’HBV in campioni di siero o plasma sono un metodo prezioso per rilevare gli individui con un’infezione da epatite B in corso, valutare l’efficacia del trattamento antivirale e prevedere la probabilità di successo del trattamento 6,7,8,9,10,11. Un’elevata carica virale è associata a un aumentato rischio di progressione della malattia epatica, tra cui cirrosi e cancro al fegato12,13. Pertanto, la misurazione precisa della carica virale è fondamentale per monitorare la progressione dell’infezione da HBV e prendere decisioni informate in merito al trattamento.
I saggi quantitativi di PCR in tempo reale hanno una maggiore sensibilità, un intervallo dinamico più ampio e una quantificazione più accurata del DNA dell’HBV rispetto alle tecniche di PCR convenzionali 14,15,16,17. Sul mercato sono disponibili diversi kit diagnostici molecolari commerciali basati sulla PCR in tempo reale per la quantificazione del DNA dell’HBV in campioni di siero o plasma. In questo articolo, descriviamo un flusso di lavoro dettagliato per il rilevamento e la quantificazione del DNA dell’HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato sulla PCR in tempo reale disponibile in commercio e marcato IVD. Il kit è un test18,19 ampiamente utilizzato, a basso costo, ma altamente sensibile, e le sue caratteristiche prestazionali sono paragonabili a quelle di altri kit con marchio CE disponibili in commercio18. Oltre all’amplificazione della regione bersaglio dell’HBV, nel kit è incluso anche un gene di controllo interno endogeno per verificare la qualità dei campioni, la qualità del DNA estratto, l’amplificazione della PCR e l’eventuale inibizione della PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al codice NIBSC 10/266 è stata assegnata un’unità di 9,55,000 UI/mL quando ricostituito in 0,5 mL di acqua priva di nucleasi secondo le informazioni del fornitore21. Questo può essere considerato un campione positivo all’HBV ad alto carico. La carica virale dell’HBV determinata dal kit di carica virale utilizzato in questo studio è stata di 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Poiché l’efficienza di estrazione del DNA di qualsiasi kit di estrazione del DNA non è del 100%,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita e Shikha per la loro assistenza tecnica.
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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