Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В в режиме реального времени на основе полимеразной цепной реакции
Summary
Обнаружение и количественная оценка ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени является чувствительным и точным методом диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Здесь мы представляем протокол обнаружения ДНК ВГВ и измерения вирусной нагрузки в образце.
Abstract
Вирус гепатита В (ВГВ) является одной из основных причин заболеваний печени во всем мире. Это может привести к острым или хроническим инфекциям, что делает людей очень восприимчивыми к смертельному циррозу и раку печени. Точное обнаружение и количественное определение ДНК ВГВ в крови имеют важное значение для диагностики и мониторинга инфекции ВГВ. Наиболее распространенным методом обнаружения ДНК ВГВ является ПЦР в реальном времени, которая может быть использована для обнаружения вируса и оценки вирусной нагрузки для мониторинга ответа на противовирусную терапию. В этой статье мы опишем подробный протокол обнаружения и количественного определения ДНК ВГВ в сыворотке или плазме крови человека с использованием набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. В наборе используются праймеры и зонды, которые нацелены на высококонсервативную основную область генома ВГВ и могут точно количественно определить все генотипы ВГВ (A, B, C, D, E, F, G, H, I и J). Набор также включает в себя эндогенный внутренний контроль для мониторинга возможного ингибирования ПЦР. Этот анализ рассчитан на 40 циклов, а его пороговое значение составляет 38 Ct. Для количественного определения ДНК HBV в клинических образцах в комплекте с набором поставляется набор из 5 стандартов количественного определения. Стандарты содержат известные концентрации ДНК, специфичной для ВГВ, которые откалиброваны в соответствии с4-м Международным стандартом ВОЗ по ДНК ВГВ для теста на нуклеиновые кислоты (код NIBSC 10/266). Стандарты используются для проверки функциональности амплификации ДНК, специфичной для ВГВ, и для создания стандартной кривой, позволяющей количественно определить ДНК ВГВ в образце. С помощью набора для ПЦР была выявлена ДНК вируса гепатита В до 2,5 МЕ/мл. Высокая чувствительность и воспроизводимость набора делают его мощным инструментом в клинических лабораториях, помогая медицинским работникам эффективно диагностировать и лечить инфекции ВГВ.
Introduction
Вирус гепатита В (HBV) представляет собой частично двухцепочечный ДНК-вирус из рода Orthohepadnavirus и семейства Hepadnaviridae 1. Он может спровоцировать хроническую инфекцию, которая сохраняется на протяжении всей жизни, потенциально приводя к циррозу печени и гепатоцеллюлярной карциноме 2,3,4. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 2019 году население страны составляло 296 миллионов человек с хронической инфекцией гепатита В, икаждый год 1,5 миллиона человек заражались новыми инфекциями.
Идентификация и измерение ДНК ВГВ в образцах сыворотки или плазмы служат ценным методом для выявления лиц с текущей инфекцией гепатита В, оценки эффективности противовирусного лечения и прогнозирования вероятности успеха лечения 6,7,8,9,10,11. Высокая вирусная нагрузка связана с повышенным риском прогрессирования заболеваний печени, включая цирроз и рак печени12,13. Следовательно, точное измерение вирусной нагрузки имеет решающее значение для отслеживания прогрессирования инфекции ВГВ и принятия обоснованных решений о лечении.
Количественные ПЦР-анализы в реальном времени обладают более высокой чувствительностью, более широким динамическим диапазоном и более точным количественным определением ДНК ВГВ, чем традиционные методы ПЦР 14,15,16,17. На рынке доступно несколько коммерческих наборов молекулярной диагностики на основе ПЦР в реальном времени для количественного определения ДНК ВГВ в образцах сыворотки или плазмы. В этой статье мы подробно опишем рабочий процесс обнаружения и количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке или плазме крови человека с использованием коммерчески доступного набора для ПЦР в реальном времени с маркировкой IVD. Этот набор представляет собой широко используемый18,19, недорогой, но высокочувствительный анализ, и его эксплуатационные характеристики сопоставимы с другими коммерчески доступными наборами с маркировкой CE18. Помимо амплификации целевой области ВГВ, в набор также включен эндогенный ген внутреннего контроля для проверки качества образцов, качества выделенной ДНК, амплификации ПЦР и возможного ингибирования ПЦР.
Protocol
Representative Results
Discussion
Коду NIBSC 10/266 присвоена единица 9,55,000 МЕ/мл при восстановлении в 0,5 мл безнуклеазной воды в соответствии с информацией поставщика21. Это можно считать высоконагруженным HBV-положительным образцом. Вирусная нагрузка ВГВ, определенная с помощью набора вирусной нагрузки, использ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Выражаем благодарность за техническую помощь Правину, Кусуму, Чандану, Ише, Рашми, Бабли, Шивани, Анките и Шикхе.
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
References
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , (2016).
- Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 20 (6), 833-843 (2005).
- Iloeje, U. H., et al. Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating Hepatitis B viral load. Gastroenterology. 130 (3), 678-686 (2006).
- Huang, Y. -. T., et al. Lifetime risk and sex difference of hepatocellular carcinoma among patients with chronic Hepatitis B and C. Journal of Clinical Oncology. 29 (27), 3643 (2011).
- . World Health Organization fact sheet Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets (2023)
- Watanabe, M., Toyoda, H., Kawabata, T. Rapid quantification assay of hepatitis b virus DNA in human serum and plasma by fully automated genetic analyzer mutaswako g1. PLoS One. 18 (2), e0278143 (2023).
- Chan, H. L. -. Y., et al. Viral genotype and Hepatitis B virus DNA levels are correlated with histological liver damage in HBeAg-negative chronic Hepatitis B virus infection. The American Journal of Gastroenterology. 97 (2), 406-412 (2002).
- Liu, C. J., et al. Viral factors correlate with Hepatitis B e antigen seroconverson in patients with chronic Hepatitis B. Liver International. 26 (8), 949-955 (2006).
- Liu, C. -. J., et al. Role of Hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in Hepatitis B carriers. The Journal of Infectious Diseases. 193 (9), 1258-1265 (2006).
- Yeo, W., et al. Hepatitis B viral load predicts survival of HCC patients undergoing systemic chemotherapy. Hepatology. 45 (6), 1382-1389 (2007).
- Yim, H. J., et al. Levels of Hepatitis B virus (HBV) replication during the nonreplicative phase: HBV quantification by real-time PCR in korea. Digestive Diseases and Sciences. 52, 2403-2409 (2007).
- Noh, R., et al. Clinical impact of viral load on the development of hepatocellular carcinoma and liver-related mortality in patients with hepatitis c virus infection. Gastroenterology Research and Practice. 2016, 7476231 (2016).
- Mendy, M., et al. Hepatitis B viral load and risk for liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in the Gambia, West Africa. Journal of Viral Hepatitis. 17 (2), 115-122 (2010).
- Abe, A., et al. Quantitation of Hepatitis B virus genomic DNA by real-time detection PCR. Journal of Clinical Microbiology. 37 (9), 2899-2903 (1999).
- Pas, S. D., Fries, E., De Man, R. A., Osterhaus, A. D., Niesters, H. G. Development of a quantitative real-time detection assay for Hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. Journal of Clinical Microbiology. 38 (8), 2897-2901 (2000).
- Ronsin, C., Pillet, A., Bali, C., Denoyel, G. R. -. A. Evaluation of the cobas ampliprep-total nucleic acid isolation-cobas Taqman Hepatitis B Virus (HBV) quantitative test and comparison to the versant HBV DNA 3.0 assay. Journal of Clinical Microbiology. 44 (4), 1390-1399 (2006).
- Sum, S. S. M., Wong, D. K. H., Yuen, J. C. H., Lai, C. L., Yuen, M. F. Comparison of the cobas taqman™ HBV test with the cobas amplicor monitor™ test for measurement of Hepatitis B virus DNA in serum. Journal of Medical Virology. 77 (4), 486-490 (2005).
- Lall, S., Choudhary, M. C., Mahajan, S., Kumar, G., Gupta, E. Performance evaluation of TRUPCR® HBV real-time PCR assay for Hepatitis B virus DNA quantification in clinical samples: Report from a tertiary care liver centre. Virusdisease. 30 (2), 186-192 (2019).
- Garg, G., et al. Presence of entry receptors and viral markers suggest a low level of placental replication of Hepatitis B virus in a proportion of pregnant women infected with chronic Hepatitis B. Scientific Reports. 12 (1), 17795 (2022).
- NIBSC-Code:10/266. . Standard for Hepatitis B Virus (Hbv) DNA for Nucleic Acid Amplification Techniques (NAT). , (2016).
- Kim, H., Hur, M., Bae, E., Lee, K. A., Lee, W. I. Performance evaluation of cobas HBV real-time PCR assay on Roche cobas 4800 system in comparison with cobas Ampliprep/cobas Taqman HBV test. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 56 (7), 1133-1139 (2018).
- Madihi, S., Syed, H., Lazar, F., Zyad, A., Benani, A. Performance comparison of the artus HBV QS-RGQ and the CAP/CTM HBV v2.0 assays regarding HEPATITIS B virus DNA quantification. BioMed Research International. 2020, 4159189 (2020).
- . Nibsc-14/198 Available from: https://www.nibsc.org/ (2023)
- Guvenir, M., Arikan, A. Hepatitis B virus: From diagnosis to treatment. Polish Journal of Microbiology. 69 (4), 391-399 (2020).
