Detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B basada en la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real
Summary
La detección y cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B (VHB) basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real es un método sensible y preciso para diagnosticar y controlar la infección por el VHB. Aquí, presentamos un protocolo para la detección de ADN del VHB y la medición de la carga viral de una muestra.
Abstract
El virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de enfermedad hepática en todo el mundo. Puede provocar infecciones agudas o crónicas, lo que hace que las personas sean muy susceptibles a la cirrosis mortal y al cáncer de hígado. La detección y cuantificación precisas del ADN del VHB en la sangre son esenciales para el diagnóstico y el seguimiento de la infección por el VHB. El método más común para detectar el ADN del VHB es la PCR en tiempo real, que se puede utilizar para detectar el virus y evaluar la carga viral para monitorear la respuesta a la terapia antiviral. Aquí, describimos un protocolo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD. El kit utiliza cebadores y sondas que se dirigen a la región central altamente conservada del genoma del VHB y pueden cuantificar con precisión todos los genotipos del VHB (A, B, C, D, E, F, G, H, I y J). El kit también incluye un control interno endógeno para monitorizar la posible inhibición de la PCR. Este ensayo tiene una duración de 40 ciclos y su punto de corte es de 38 Ct. Para la cuantificación del ADN del VHB en muestras clínicas, se proporciona un conjunto de 5 patrones de cuantificación con el kit. Los patrones contienen concentraciones conocidas de ADN específico del VHB que están calibradas con respecto al4º Estándar Internacional de la OMS para el ADN del VHB para la prueba de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Los patrones se utilizan para validar la funcionalidad de la amplificación de ADN específica del VHB y para generar una curva estándar, que permite la cuantificación del ADN del VHB en una muestra. El ADN del VHB tan bajo como 2,5 UI/ml se detectó utilizando el kit de PCR. La alta sensibilidad y reproducibilidad del kit lo convierten en una poderosa herramienta en los laboratorios clínicos, ayudando a los profesionales de la salud a diagnosticar y manejar eficazmente las infecciones por VHB.
Introduction
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN parcialmente bicatenario del género Orthohepadnavirus y de la familia Hepadnaviridae 1. Puede desencadenar una infección crónica que persiste durante toda la vida, lo que puede conducir a cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular 2,3,4. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que en 2019 una población de 296 millones de personas vivía con una infección crónica por hepatitis B, y 1,5 millones de personas se infectaban cada año5.
La identificación y medición del ADN del VHB en muestras de suero o plasma sirve como un método valioso para detectar individuos con una infección continua por hepatitis B, evaluar la eficacia del tratamiento antiviral y predecir la probabilidad de éxito del tratamiento 6,7,8,9,10,11. La carga viral alta se asocia con un mayor riesgo de progresión de la enfermedad hepática, incluida la cirrosis y el cáncer de hígado12,13. Por lo tanto, la medición precisa de la carga viral es crucial para rastrear la progresión de la infección por VHB e informar las decisiones sobre el tratamiento.
Los ensayos cuantitativos de PCR en tiempo real tienen mayor sensibilidad, un rango dinámico más amplio y una cuantificación más precisa del ADN del VHB que las técnicas de PCR convencionales 14,15,16,17. En el mercado existen varios kits comerciales de diagnóstico molecular basados en PCR en tiempo real para la cuantificación del ADN del VHB en muestras de suero o plasma. Aquí, describimos un flujo de trabajo detallado para la detección y cuantificación del ADN del VHB en suero o plasma humano utilizando un kit basado en PCR en tiempo real marcado con IVD disponible comercialmente. El kit es un ensayo18,19 ampliamente utilizado, de bajo costo, pero altamente sensible, y sus características de rendimiento son comparables con otros kits con marcado CE disponibles comercialmente18. Además de la amplificación de la región diana del VHB, también se incluye en el kit un gen de control interno endógeno para verificar la calidad de las muestras, la calidad del ADN extraído, la amplificación por PCR y la posible inhibición por PCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Al código NIBSC 10/266 se le ha asignado una unidad de 9,55.000 UI/mL cuando se reconstituye en 0,5 mL de agua libre de nucleasa, según la información del proveedor21. Esto puede considerarse una muestra positiva para el VHB de alta carga. La carga viral del VHB determinada por el kit de carga viral utilizado en este estudio fue de 6,65,900 UI/mL (Figura 4). Como la eficiencia de extracción de ADN de cualquier kit de extracción de ADN no es del 100%, a menudo se …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita y Shikha por su asistencia técnica.
Materials
| 4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
| ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
| HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
| QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
| TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
| TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |
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