Polymeraskedjereaktionsbaserad detektion och kvantifiering av hepatit B-virus-DNA i realtid

Summary

Realtidsdetektion och kvantifiering av hepatit B-virus (HBV) DNA är en känslig och exakt metod för att diagnostisera och övervaka HBV-infektion. Här presenterar vi ett protokoll för HBV-DNA-detektion och virusmängdsmätning av ett prov.

Abstract

Hepatit B-virus (HBV) är en betydande orsak till leversjukdom över hela världen. Det kan leda till akuta eller kroniska infektioner, vilket gör individer mycket mottagliga för dödlig skrumplever och levercancer. Noggrann detektion och kvantifiering av HBV-DNA i blodet är avgörande för att diagnostisera och övervaka HBV-infektion. Den vanligaste metoden för att detektera HBV-DNA är realtids-PCR, som kan användas för att upptäcka viruset och bedöma virusmängden för att övervaka svaret på antiviral behandling. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för detektion och kvantifiering av HBV-DNA i humant serum eller plasma med hjälp av ett IVD-märkt realtids-PCR-baserat kit. Satsen använder primers och sonder som riktar sig mot den mycket konserverade kärnregionen av HBV-genomet och kan exakt kvantifiera alla HBV-genotyper (A, B, C, D, E, F, G, H, I och J). Satsen innehåller också en endogen intern kontroll för att övervaka eventuell PCR-hämning. Denna analys körs i 40 cykler och dess cutoff är 38 Ct. För kvantifiering av HBV-DNA i kliniska prover medföljer en uppsättning av 5 kvantifieringsstandarder med satsen. Standarderna innehåller kända koncentrationer av HBV-specifikt DNA som kalibreras mot WHO:s 4:^e internationella standard för HBV-DNA för nukleinsyratestet (NIBSC-kod 10/266). Standarderna används för att validera funktionaliteten hos den HBV-specifika DNA-amplifieringen och för att generera en standardkurva som möjliggör kvantifiering av HBV-DNA i ett prov. HBV-DNA så lågt som 2,5 IE/ml detekterades med hjälp av PCR-kitet. Satsens höga känslighet och reproducerbarhet gör det till ett kraftfullt verktyg i kliniska laboratorier och hjälper vårdpersonal att effektivt diagnostisera och hantera HBV-infektioner.

Introduction

Hepatit B-virus (HBV) är ett delvis dubbelsträngat DNA-virus från släktena Orthohepadnavirus och Hepadnaviridae-familjen ¹. Det kan utlösa en kronisk infektion som kvarstår under hela livet, vilket kan leda till levercirros och hepatocellulärt karcinom ^2,3,4. Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) levde en uppskattad befolkning på 296 miljoner människor med kronisk hepatit B-infektion 2019, och 1,5 miljoner människor smittades varje år⁵.

Identifiering och mätning av HBV-DNA i serum- eller plasmaprover fungerar som en värdefull metod för att upptäcka individer med en pågående hepatit B-infektion, bedöma effekten av antiviral behandling och förutsäga sannolikheten för behandlingsframgång 6,7,8,9,10,11. Hög virusmängd är förknippad med en ökad risk för progression av leversjukdom, inklusive skrumplever och levercancer^12,13. Därför är exakt mätning av virusmängd avgörande för att spåra utvecklingen av HBV-infektion och informera beslut om behandling.

Kvantitativa realtids-PCR-analyser har högre känslighet, bredare dynamiskt omfång och mer exakt kvantifiering av HBV-DNA än konventionella PCR-tekniker 14,15,16,17. Det finns flera kommersiella realtids-PCR-baserade molekylära diagnostiska kit för kvantifiering av HBV-DNA i serum- eller plasmaprover på marknaden. Här beskriver vi ett detaljerat arbetsflöde för detektion och kvantifiering av HBV-DNA i humant serum eller plasma med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt, IVD-märkt realtids-PCR-baserat kit. Satsen är en allmänt använd ^18,19, billig, men ändå mycket känslig analys, och dess prestandaegenskaper är jämförbara med andra kommersiellt tillgängliga CE-märkta ^satser18. Förutom amplifieringen av HBV-målregionen ingår också en endogen intern kontrollgen i satsen för att verifiera kvaliteten på prover, kvaliteten på extraherat DNA, PCR-amplifiering och eventuell PCR-hämning.

Protocol

Denna studie involverade inga mänskliga deltagare eller kliniska prover. Det enda biologiska material som användes var den 4:e internationella WHO-standarden för HBV-DNA för nukleinsyratest (NIBSC-kod 10/266). Denna standard är ett offentligt tillgängligt referensmaterial som inte innehåller någon personlig information eller identifierbar data. Som sådan krävdes inget etiskt godkännande för denna studie. 1. DNA-extraktion Extrahera virus-DNA fr…

Representative Results

Ett schematiskt diagram över arbetsflödet för att detektera och kvantifiera HBV-DNA från human plasma/serum visas i figur 1. Ett förstärkningsdiagram för Standard 2 (används som PC) och NTC för både HBV och IC visas i figur 2. Figur 3 visar amplifieringskurvorna för ett HBV-positivt prov, ett HBV-negativt prov och ett prov med PCR-hämning. Förstärkningskurvan, Ct-värdet för HBV och erhållen HBV-koncentration i inter…

Discussion

NIBSC-kod 10/266 har tilldelats en enhet på 9,55 000 IE/ml när den bereds i 0,5 ml nukleasfritt vatten enligt leverantörsinformationen²¹. Detta kan betraktas som ett positivt HBV-prov med hög belastning. HBV-virusmängden som bestämdes av det virusmängdskit som användes i denna studie var 6,65,900 IE/ml (Figur 4). Eftersom DNA-extraktionseffektiviteten för alla DNA-extraktionssatser inte är 100 %, går en del DNA ofta förlorat under reningsprocessen. Även o…

Materials

4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198