Summary
Utforskningen av cellulärt beteende under mekanisk stress är avgörande för framsteg inom cellulär mekanik och mekanobiologi. Vi introducerar Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA) -tekniken, en ny metod som kombinerar kontrollerad mekanisk stimulering med omfattande analys av intracellulär signalering i enskilda celler. Denna teknik undersöker nya fördjupade studier av mekanobiologi i levande celler.
Abstract
Aspirationsanalyser med mikropipett har länge varit en hörnsten för undersökningen av levande cellers mekanik, vilket ger insikter i cellulära svar på mekanisk stress. Denna artikel beskriver en innovativ anpassning av den fluorescenskopplade mikropipettaspirationsanalysen (fMPA). fMPA-analysen introducerar förmågan att administrera exakta mekaniska krafter samtidigt som man övervakar de mekanotransduktionsprocesser som förmedlas av jonkanaler i levande celler. Den sofistikerade installationen innehåller en precisionskonstruerad mikropipett av borosilikatglas ansluten till en finreglerad vattenreservoar och ett pneumatiskt aspirationssystem, vilket underlättar kontrollerad tryckapplicering med steg så raffinerade som ± 1 mmHg. En betydande förbättring är integrationen av epifluorescensavbildning, vilket möjliggör samtidig observation och kvantifiering av cellmorfologiska förändringar och intracellulära kalciumflöden under aspiration. fMPA-analysen, genom sin synergistiska kombination av epi-fluorescensavbildning med mikropipettaspiration, sätter en ny standard för studier av cellmekanosensering i mekaniskt utmanande miljöer. Detta mångfacetterade tillvägagångssätt kan anpassas till olika experimentella uppställningar, vilket ger viktiga insikter i mekanismerna för mekanosens med en cell.
Introduction
De nya upptäckterna inom cellulära beteenden har accentuerat den roll som mekaniska stimuli, såsom spänning, vätskeskjuvspänning, kompression och substratstyvhet, spelar för att diktera dynamiska cellulära aktiviteter som vidhäftning, migration och differentiering. Dessa mekanobiologiska aspekter är av största vikt för att belysa hur celler interagerar med och svarar på sin fysiologiska miljö, vilket påverkar olika biologiska processer 1,2.
Under det senaste decenniet har mikropipettbaserade aspirationsanalyser utmärkt sig som ett mångsidigt verktyg för att studera olika cellulära svar på mekaniska stimuli. Denna teknik ger värdefulla insikter om de inneboende mekaniska egenskaperna hos levande celler på encellsnivå, inklusive cellulär elasticitetsmodul, styvhet och kortikal spänning. Dessa analyser möjliggör mätning av olika mekaniska parametrar, såsom cellmembranspänning, tryck som utövas på cellmembranet och kortikal spänning (sammanfattat i tabell 1). Att studera aspirationskrafterna har berikat vår förståelse för hur de påverkar cellulära funktioner och processer, särskilt inom området membrandynamik, inklusive fragmentering, förlängning och spirande 3,4.
| Mekanisk parameter | Beskrivning | Banbrytande tillvägagångssätt |
| Cellens styvhet | Mätning av en cells mekaniska styvhet och elasticitet. | Aspiration av cellmembranet och analys av deformationsrespons på undertrycket20,21. |
| Vidhäftningsstyrka | Utvärdering av hur starkt celler fäster på ytor. | Applicering av kontrollerad sugning för att lossa vidhäftade celler från ett substrat2,22. |
| Membran spänning | Bedömning av spänning eller spänning i cellmembran. | Mätning av membrandeformationen som svar på applicerat tryck23,24. |
| Viskoelastiska egenskaper | Karakterisering av en cells kombinerade viskösa och elastiska beteende. | Analys av den tidsberoende deformationsresponsen på aspiration23,25. |
| Deformerbarhet | Bestämning av hur lätt en cell kan ändra form. | Utvärdering av graden av deformation under kontrollerad sugning20,24. |
| Ytspänning | Mätning av spänningen vid cellens yta. | Bedömning av det tryck som krävs för att bilda ett membranutsprång med mikropipett26. |
| Interaktion mellan cell och material | Studie av interaktioner mellan celler och material eller substrat. | Aspiration av celler i kontakt med olika material och observation av interaktioner2,24. |
| Cell-cellinteraktion | Undersökning av interaktioner mellan närliggande celler. | Aspiration av en grupp celler och analys av deras intercellulära krafter27. |
Tabell 1: Mekaniska parametrar som karakteriseras av mikropipettaspirationsanalysen.
Den mikropipettbaserade aspirationstekniken har använts i stor utsträckning för att studera röda blodkroppar (RBC), bedöma deformerbarheten och olika mekaniska egenskaper hos röda blodkroppar, vilket är viktigt för att förstå deras funktion i cirkulationssystemet. RBC:er uppvisar anmärkningsvärd anpassningsförmåga och bevarar sin mekaniska mångsidighet mot deformation när de navigerar genom det intrikata kapillärnätverket och interendotelklyftor 5,6. Under denna resa måste RBC:er passera genom passager så smala som 0,5-1,0 μm och utsätta sig för en mängd mekaniska krafter, inklusive spänning och kompression 7,8,9. De har också hög känslighet för den skjuvspänning som genereras av blodflödet under cirkulationen10. Dessa processer främjar aktiveringen av regleringsmekanismer som involverar kalciuminflöde, en avgörande signalhändelse med väletablerade roller i cellulära svar på mekaniska stimuli11,12. De komplexa mekanismerna som styr den kalciummedierade mekanosenseringen är fortfarande angelägna ämnen för pågående forskning.
I detta sammanhang är fMPA ett effektivt tillvägagångssätt för att avslöja omfattningen av kalciummobilisering under exakt kontrollerade mekaniska krafter, vilket möjliggör samtidig tillämpning av mekanisk modulering (med hjälp av mikropipettaspirationssystemet) och visualisering av kalciumintensitet (med hjälp av fluorescerande indikatorer). Det efterliknar särskilt det fysiologiska scenariot när RBC färdas genom förträngande blodkärl. Det är värt att notera att det fMPA-system vi utvecklat kan generera tryck med en upplösning på 1 mmHg. Den implementerade höghastighetskameran kan uppnå en tidsupplösning på 100 ms och en rumslig upplösning på submikrometernivå. Dessa konfigurationer säkerställer exakt applicering av mekaniska krafter på levande celler och fångar samtidigt upp den resulterande cellulära signaleringen. Dessutom, på grund av den integrativa konstruerade karaktären hos denna uppställning, kan mikropipettaspirationsanalysen lätt anpassas för att komplettera annan utrustning eller tekniker, vilket möjliggör ytterligare utforskning av cellmekanikens komplexitet. Denna mångsidighet är ytterligare en fördel med detta tillvägagångssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer riktlinjerna från och har godkänts av Human Research Ethics Committee vid University of Sydney. Informerat samtycke inhämtades från donatorerna för denna studie.
1. Isolering av röda blodkroppar hos människa
OBS: Steg 1.1 bör utföras av en utbildad flebotomist med hjälp av ett protokoll som har godkänts av Institutional Review Board.
- Dra upp 5 ml blod från medianen cubital venen med en 19 G fjärilsnål.
- Överför det uppsamlade blodet till ett 15 ml rör som innehåller 1:200 enoxaparin för att förhindra koagulering.
- Späd 5 μl enoxaparin-antikoagulerat blod i 1 ml karbonat-/bikarbonatbuffert (C-buffert, pH = 8,5-9; Materialförteckning).
- Centrifugera det utspädda blodprovet vid 900 × g i 1 minut för att sedimentera de röda blodkropparna. Dekantera försiktigt supernatanten utan att störa pelleten.
- Utför två tvättar av RBC-pelleten med 1 ml C-buffert (materialtabell), centrifugera varje gång vid 900 × g i 1 minut.
- Tvätta därefter RBC-pelleten 2 gånger med 1 ml Tyrodes buffert under samma centrifugeringsförhållanden och återsuspendera sedan den slutliga pelleten i 1 ml Tyrodes buffert för att erhålla den tvättade stam-RBC-suspensionen.
2. Laddning av kalciumindikator
- Justera koncentrationen av den tvättade stam-RBC-lösningen till 10 × 106 celler/ml i tyrodes buffert, baserat på cellantalet som erhålls med hjälp av en automatisk cellräknare (Materialtabell).
- Märk kalciumet inuti de röda blodkropparna genom att inkubera med 16,67 μM Cal-520 AM, ett kalciumkänsligt färgämne, medan du rör om på en roterande rörblandare i 1 timme.
- Späd ut de röda blodkropparna i Tyrodes buffert som innehåller 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) i förhållandet 1:50. Cellerna är nu redo för experimentell användning.
3. Tillverkning av mikropipetter
- Montera kapillärröret av borosilikatglas (1 mm ytterdiameter x 0,6 mm innerdiameter) på P-1000 mikropipettavdragaren för att producera två motsvarande mikropipetter med stängda spetsar vid dragstället med hjälp av det förinställda dragprogrammet. För denna inställning, använd följande dragprogramvärden: heat 516, pull 150, velocity 75, time 250 och pressure 500.
OBS: Uppvärmnings- och dragparametrar som ställts in i dragprogrammet kan anpassas och är beroende av de önskade inställningarna för den experimentella designen12. kontrollpunkt (se kompletterande tabell S1). - Öppna den stängda spetsen genom att montera en av de slutna mikropipetterna som anskaffas efter att ha dragit i mikropipettskäraren. Justera uppvärmningstemperaturen till cirka 50-60 °C.
- Leta reda på mikropipetten med ett 10x okular. Flytta mikropipetten nära borosilikatglaspärlan genom att använda vreden för justering.
- Byt okularet till 30x innan du placerar mikropipetten så nära borosilikatglaspärlan som möjligt utan att böja pipettspetsen.
- Mjuka upp borosilikatglaspärlan med värme genom att trampa på värmepedalen. För försiktigt in den råa stängda mikropipettspetsen i den mjukade pärlan tills önskad ändpunkt, öppningsdiametern, har uppnåtts.
- Släpp fotpedalen och låt glaspärlan svalna. Se till att spetsen på mikropipetten alltid är kvar inuti pärlan.
OBS: Att sätta in spetsen ytterligare leder till större öppningsdiametrar. - Dra försiktigt ut mikropipetten, vilket leder till ett tydligt rakt snitt på den stängda mikropipetten. Kontrollera att kapillärens slutliga diameter är 1 μm.
OBS: KONTROLLPUNKT (se kompletterande tabell S1)
4. Förberedelse av cellkammare
- Använd en diamantpenna för att dela upp en standard 40 mm x 22 mm x 0,17 mm glastäcke i tre lika stora remsor.
- Fäst en bit av det skurna glaset på botten av en hemmagjord kammarhållare med vakuumfett.
OBS: Kammarhållaren består av två metallrutor (koppar/aluminium) som är sammanlänkade med ett böjt handtag. Avståndet mellan metallblocken måste spänna över mindre än 40 mm för att det skurna täckglaset ska fästa vid hållaren för att bilda en parallell kammare. - Fäst den andra delen av det skurna glaset på toppen av den hemgjorda kammarhållaren med vakuumfett.
OBS: KONTROLLPUNKT (se kompletterande tabell S1) - Injicera 200 μl av den märkta RBC-suspensionen mellan två täckglas med en 200 μL pipettpistol (figur 1).
Figur 1: Illustration av cellkammaren. Två skurna bitar av ett 40 mm x 22 mm x 0,17 mm glastäcke fästs på kammarhållaren med fett. Mellan de två täckta glasen sås cirka 200 μL av celllösningen i Tyrodes buffert. Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Aspirationsenhet med mikropipett
- Montera cellkammaren på hållaren stage finns på mikroskopplattformen. Justera positionen så att cellkammaren är direkt ovanför objektivet (Figur 2B).
- Sänk mikropipetthållaren till under vätskenivån i den anslutna vattenbehållaren.
- Injicera antingen demineraliserat vatten eller tyrodes buffert i den tillverkade mikropipetten och avlägsna försiktigt alla luftbubblor med hjälp av en spruta kopplad till en 34 G nål (se materialförteckning).
- Skruva loss änden av mikropipetthållaren halvvägs och låt vattnet droppa från mikropipetthållaren i några sekunder.
OBS: KONTROLLPUNKT (se kompletterande tabell S1) - Sätt in mikropipetten i hållarens spets. Dra åt hållarskruven för att säkerställa att mikropipetten sitter fast.
- Sätt in mikropipetten i cellkammaren och placera mikropipetten och de röda blodkropparna under mikroskopet. Använd mikromanipulatorn för att justera positionen.
- Sänk mikropipettspetsen ytterligare för att säkerställa att spetsen är i nivå med den lokaliserade RBC:n.
OBS: KONTROLLPUNKT (se kompletterande tabell S1) - Nollställ hydraultrycket vid mikropipettspetsen genom att justera höjden på vattenbehållaren. Höj sedan vattenbehållaren något för att generera ett subtilt övertryck vid spetsen.
6. Utför den fluorescenskopplade mikropipettaspirationsanalysen
- Slå på 488 nm lysrörsljuskällan. Slå inte på fluorescensslutaren i detta skede för att undvika fotoblekning (Figur 2C). Slå på fluorescenskameran och den sända kameran.
OBS: Båda kamerorna drivs med lämplig programvara (se materialförteckning). - Ställ in önskad exponeringstid (100 ms för båda kamerorna i denna studie), intresseområde (ROI), binningstorlek (ingen för denna studie) för båda kamerorna i programvaran. Öppna den flerdimensionella förvärvspanelen för att ställa in bildnumret för förvärvet, 2 000 för den här studien, och spara katalogen.
OBS: Förvärvsramnumret beror på det önskade antalet aspirationshändelser som ska registreras. För 1 aspirationshändelse bör intervallet för förvärvsnumret ställas in inom 100-500, vilket är ungefär 10-50 s. - Hitta mikropipetten under synfältet med hjälp av mikromanipulatorn.
- Slå på det pneumatiska trycket clamp, inklusive kontrollboxen och clamp system (Figur 2A). Se till att kontrollboxen är i EXTRNL-läge. Kompensera för eventuellt förskjutningstryck inuti systemet genom att långsamt vrida på ratten.
- Slå på den separata programvaran som styr den pneumatiska klämman. Programvaran har en elektrisk kontrollpanel för att styra den diskreta analoga ingången till clamp-systemet. Trycket regleras med en omvandlingsfaktor på 20 mV/mmHg.
- Nollställ trycket inuti systemet. Flytta försiktigt mikropipetten nära de röda blodkropparna. Justera vattenbehållarens läge tills ett subtilt positivt tryck märks vid mikropipettspetsen.
- Starta registreringen i kamerans operativsystem. Slå på fluorescensslutaren.
- Aspirera en RBC genom att skriva in den beräknade spänningsstorleken i kontrollpanelen för att nå önskat tryck.
OBS: Trycket för aspirering av en RBC ligger vanligtvis i intervallet Δp = -5 till -40 mmHg. Det bör finnas en märkbar tungförlängning i mikropipettspetsen (Figur 2D). - Håll trycket under en förinställd period; Släpp sedan trycket.
- Flytta mikropipetten för att plocka upp nästa cell och upprepa experimentet.
7. Analys av fluorescensintensitet
- Ladda de sparade fluorescensbilderna i analysprogrammet.
- Justera intensitetströskeln med hjälp av fliken för skärmjustering . Gör detta genom att antingen mata in värdena manuellt eller använda skjutreglaget för att säkerställa att fluorescensbilderna visar en tydlig kontrast av cellen i analysprogramvaran (se Kompletterande File 1-Kompletterande figur S1).
- Bläddra till tidslinjen längst ner i programvaran. Leta reda på den angivna aspirationshändelsen.
- Klicka på Lägg till nya ytor. Definiera analysens ROI.
OBS: Programvaran tillhandahåller en guidad femstegsprocess för att justera och slutföra segmenteringen (se Kompletterande File 1-Kompletterande Figur S2 och Kompletterande Figur S3).
OBS: Håll ROI så liten som möjligt för att spara beräkningsresurser. - Använd skjutreglaget för subtraktion i bakgrunden och justera segmenteringströskeln med skjutreglaget för att få bästa segmenteringsresultat.
OBS: Detta innebär att bortsett från aspirationshändelsen bör bakgrunden segmenteras så exakt som möjligt (se kompletterande fil 1 - kompletterande figur S4 och kompletterande figur S5). - Lägg till ett områdesfilter för att utesluta bakgrundsljud (se Kompletterande File 1-Kompletterande figur S6).
OBS: Detta slutförs i efterprocessstadiet. - Välj fliken Statistik | Fliken Detaljerad | Fliken Medelvärden . Bläddra för att hitta och välja intensitetsmedelvärdet (se Kompletterande File 1-Kompletterande figur S7).
- Exportera fluorescenssignalspåret över tid till en .csv file.
- Öppna den exporterade csv-filen. Subtrahera bakgrundssignalerna, Fb, från alla mätningar.
- Beräkna kalciumintensitetsförändringen, ΔFmax, med hjälp av ekvation (1):
Nej (1)
Där ΔFmax är den maximala kalciumintensitetsförändringen, Fb är bakgrundsintensiteten och F0 är vilointensiteten.
Nej (1)
Figur 2: Aspirationsenhet för fluorescenskopplad mikropipett. (A) En översikt över fMPA-hårdvarusystemet som innehåller det inverterade mikroskopet i kombination med ljusfälts- och fluorescenskamerorna. Den vänstra sidan av bilden visar den hemmagjorda vattenmanometern och kontrollboxen som gör det möjligt att exakt ställa in trycket på den pneumatiska tryckpumpen. B) Mikroskopsteget som avbildar experimentets cellkammare och mikromanipulatorsystem med en enda mikropipett. (C) Schematisk bild av fMPA-systeminställningen. Samtidig avbildning av ljusfälts- (gul) och fluorescenssignaler (blå emission, grön excitation) med hjälp av två dikroiska speglar för att rikta ljusbanorna från fluorescensljuskällan (blå) till målet och sedan till kamerorna för avbildning (grön). (D) Den översta raden visar ljusfältsbilderna medan den nedre raden visar fluorescensbilderna. Den vänstra representerar mikropipettens position före aspiration när RBC är i vila. Den mellersta kolumnen ögonblicksbilder av aspirationsprocessen där RBC upplever ett undertryck på -40 mmHg. Till höger avbildas cellens morfologi efter att ha upplevt det negativa aspirationstrycket. Skalstapel = 5 μm. Förkortningar: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration; DM = dikroisk spegel; RBC = röda blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att etablera aspirationsanalyser med mikropipetter konstruerade vi först en anpassad cellkammare bestående av två metallrutor (koppar/aluminium) som är förbundna med ett handtag. Två tredje skurna glasglas (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) fästes för att skapa en kammare fylld med 200 μL röda blodkroppar upphängda i Tyrodes buffert. Efter att ha fört in röda blodkroppar i kammaren fästes en skräddarsydd borosilikatmikropipett på en hållare och placerades försiktigt i kammaren med hjälp av en mikromanipulator. Därefter fördes mikropipetten närmare för att fånga upp mål-RBC.
För cellaspiration användes en pneumatisk höghastighetstryckklämma för att finjustera det negativa aspirationstrycket. Fluorescensavbildning utfördes sedan för att undersöka kalciummobiliseringen vid de olika negativa aspirationstrycken som applicerades.
Genom att använda fMPA för att undersöka hur röda blodkroppar reagerar på varierande negativt aspirationstryck, visar våra resultat att det finns ett tydligt proportionellt samband mellan det negativa trycket som appliceras och kalciuminflödet som finns i den aspirerade röda blodkropparna. För att bestämma kalciumintensitetsförändringen dividerades den maximala intensiteten för den enstaka aspirerade cellen (Fmax) minus bakgrundsintensiteten (Fb) med vilointensiteten (F0) minus Fb. Det skedde en motsvarande ökning av inflödet av kalciumjoner till de röda blodkropparna när trycket stegvis ökades mellan -10 mmHg (Figur 3A) till -40 mmHg (Figur 3D). Detta tyder på att röda blodkroppar har förmågan att känna av förändringar i sin mekanik och reagera genom snabba kalciumspecifika kanalaktiviteter14,15.
Figur 3: Fluorescensavbildning med en grafisk representation av normaliserade intensitetsförändringar mot tiden. Horisontellt över visar fluorescensbilder av de röda blodkropparna i vila (vänster) och de mänskliga röda blodkropparna som aspireras av mikropipetten (mitten). Representativa spår av att de röda blodkropparna aspireras vid multipelt negativt aspirationstryck (Δp) kan ses till höger. Det negativa aspirationstrycket ökas stegvis, med början vid (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg och (D) Δp = -40 mmHg. När tungan på RBC förlängs under aspiration kan en signifikant kalciummobilisering observeras, vilket visas av den ökade Cal-520 AM-veckförändringen. F/F0 användes för att undersöka kalciummobiliseringen inuti den aspirerade röda blodkropparna. Från ovanstående kurvor visade den observerade trenden att Cal-520 AM-signalen ökade proportionellt med ökningen av det applicerade negativa aspirationstrycket. Skalstapel = 5 μm. Förkortning: RBC = röda blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell S1: Kontrollpunkter för kritiska steg i fMPA-förberedelseprotokollen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 1: En guidad process för att justera och utföra segmentering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aspirationsanalyser med mikropipett förkroppsligar en förfinad metodik som använder betydande tryckmodulering, exakt rumslig orkestrering och tillförlitlig tidsmässig urskiljning för att undersöka de djupa krångligheterna i cellulär biomekanik. Denna studie lägger särskild vikt vid tillämpningen av fMPA som ett avgörande verktyg för att avslöja de nyanserade mekanokänsliga svar som uppvisas av röda blodkroppar under varierande stimuli. Den samtidiga användningen av ljusfälts- och fluorescenssignaler möjliggjorde en mångfacetterad utforskning av cellulära fenomen, vilket främjade övervakning och detektion av intracellulärt kalciuminflöde i realtid. Detta tillvägagångssätt ger en integrativ inblick i de komplexa mekanosensreaktionerna hos röda blodkroppar.
Det är viktigt att notera att tillämpligheten av fMPA-tekniken sträcker sig bortom röda blodkroppar, eftersom den kan användas med andra celltyper som inte tillämpar hög mekanisk känslighet, såsom blodplättar och neuroner9. Dessutom, på grund av dess minimala påverkan på cellintegriteten under experimentell hantering, garanterar fMPA bevarandet av cellens naturliga tillstånd, vilket gör den mycket lämplig för användning med primära celler1. Dessutom erbjuder fMPA-metoden mångsidighet genom mikropipetternas avstämbara geometri, vilket möjliggör ett bredare utbud av experimentella designer skräddarsydda för specifika forskningsfrågor och effektiv utforskning av olika mekaniska tillstånd.
Dessutom, med förbättringen av den optiska vägen som förbättrar den samtidiga användningen av multifluorescensavbildning, möjliggör fMPA-systemet realtidsdetektering av intracellulär kalciumkoncentration vid aspiration. Denna förmåga öppnar en möjlighet att utforska kalciumrelaterade molekyler, såsom den mekanokänsliga jonkanalen, PIEZO1, som har visat sig förmedla och uppfatta mekaniska signaler från de yttre miljöerna 7,14. Ny litteratur belyser en ökning av membranspänningen som en betydande faktor som stimulerar PIEZO1-kanalaktiviteten, vilket därefter underlättar Ca2+-inflödet6. Detta understryker en viktig tillämpning av fMPA, vilket är att undersöka samspelet mellan membranspänning, PIEZO1 och kalciuminflöde, vilket belyser de intrikata mekanosenseringsprocesserna i celler.
Ur ett tekniskt perspektiv är det värt att nämna att de två primära komponenterna i fMPA-systemet, som ansvarar för att generera aspirationskraften (mekaniska stimuli) och utföra fluorescensavbildning i realtid, är den pneumatiska tryckpumpen respektive fluorescenskameran. Valet av lämplig pump och kamera för systemet bör baseras på den specifika celltyp och biologiska process som studeras. Pumpen som används i vårt system arbetar inom ett stabilt tryckområde på ± 200 mmHg och kan svara på kommandon för tryckförändringar så stora som ± 200 mmHg. Tryckstegringstiden och falltiden bör inte överstiga 6-8 ms för ett steg på 20 mmHg och 15-20 ms för ett steg på 200 mmHg. För att säkerställa kraftupplösning bör ljudnivån i HSPC-systemet vara mindre än ± 0.5 mmHg, topp-till-topp. Dessa krav tillämpas i den här konfigurationen. Ett intervall på ± 40 mmHg är dock tillräckligt för att uppnå ett svar för experimentprotokollet15. När det gäller fluorescenskameran valde vi funktioner med en 95 % kvanteffektivitet och ett chip med pixelstorlek på 11 μm x 11 μm. Denna känsliga sensorkonfiguration fångar effektivt upp fluorescenssignalen vid hög hastighet. Dessutom är det viktigt att upprätthålla ett medianläsbrus på 1,6e- för ett adekvat signal-brusförhållande under avbildning16.
Ur ett procedurperspektiv kräver exekvering av fMPA en uppsättning avancerade kunskaper. Att tillverka mikropipetter med hjälp av mikropipettskäraren kräver till exempel precision och fingerfärdighet, tillsammans med noggrann kontroll av temperatur och positionering. Att placera mikropipetten inom mikroskopets synfält kräver noggrann ansträngning för att undvika skador på både mikropipettspetsen och cellkammaren. Dessutom är en vanlig utmaning i samband med fluorescensavbildning fotoblekning. För att mildra detta problem är det viktigt att minimera provets exponeringstid för belysningssystemet. Med hänvisning till protokollet för "fluorescenskopplad mikropipettaspirationsanalys" förblir excitationsljuskällans fluorescensslutare avstängd tills alla parametrar har matats in via kamerans programvara och aspirationssystemet är klart för experiment. Först då slås fluorescensslutaren på för att påbörja avbildningen. För att ytterligare minska fotoblekningen rekommenderas att använda den lägsta ljuskällans intensitet som fortfarande ger tillräckligt fluorescensuttryck i provet.
Dessutom gör den nuvarande manuella operationen som krävs för fMPA-analyser denna teknik arbetskrävande. Följaktligen härrör de inkonsekvenser som kan uppstå i denna analys främst från operatörsberoende variabler, såväl som de faktorer som är förknippade med variationer i glödtrådsförvärmning och kapillärglasegenskaper. I framtiden måste man överväga potentiella tandemimplementeringar för att optimera prestandan för den här tekniken. Till exempel, i kombination med mikrofluidiska enheter, kan mikropipettaspirationen omvandlas till en plattform med hög genomströmning, vilket avsevärt ökar den experimentella hastigheten från att studera cirka 20 celler per timme till cirka 1 000 celler/h17,18. Denna inkorporering förbättrar också reproducerbarheten av data. Dessutom har vissa vägar framgångsrikt utforskats genom att integrera automatiserings- och bildanalyssystem19. Finita elementanalys (FEA) är ett beräkningsverktyg som vanligtvis används för att modellera aspirationsanalyser av mikropipetter. FEA kan förutsäga det cellulära svaret på mekaniska stimuli och karakterisera deras mekaniska egenskaper. Det har potential att optimera mikropipettdesignen och ytterligare validera de experimentella resultaten19.
Sammanfattningsvis ger fMPA-metoden värdefulla insikter om de mekanokänsliga beteendena hos röda blodkroppar när det gäller att reagera på mekaniska stimuli. Denna studie etablerar ett grundläggande ramverk för framtida undersökningar av de intrikata mekanismerna för mekanotransduktion inom röda blodkroppar och i bredare biologiska system. Sådana undersökningar är mycket lovande för att öka vår förståelse av dessa mekanismer och reda ut deras omfattande implikationer i olika fysiologiska sammanhang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen att rapportera om den aktuella studien.
Acknowledgments
Vi tackar Nurul Aisha Zainal Abidin och Laura Moldovan för ytterligare rekrytering av donatorer, blodinsamling och stöd för flebotomi. Vi tackar Tomas Anderson och Arian Nasser för att ha organiserat utrustningen och reagenserna. Forskningen finansierades av Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); National Health and Medical Research Council (NHMRC) i Australien Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); NHMRC Equipment Grant-L.A.J.; NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Grant-L.A.J.); NSW CVRN-VCCRI forsknings- och innovationsbidrag; Kontoret för globalt engagemang och forskningsengagemang (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. är National Heart Foundation Future Leader Fellow Level 2 (105863) och Snow Medical Research Foundation Fellow (2022SF176).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
| 1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
| 200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
| 22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
| 50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
| Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
| DAQami | Diligent | ||
| Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
| Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
| High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
| Imaris | Oxford Instruments | ||
| Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
| Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
| Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
| Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
| Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
| Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
| Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
| Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) |
Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
| Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
| X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
References
- González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
- Mierke, C. T. Physics of Cancer, Volume 3 (Second Edition): Experimental biophysical techniques in cancer research. , IOP Publishing. (2021).
- Chen, Y., et al. Loss of the F-BAR protein CIP4 reduces platelet production by impairing membrane-cytoskeleton remodeling. Blood. 122 (10), 1695-1706 (2013).
- Shin, J. -W., Swift, J., Spinler, K. R., Discher, D. E. Myosin-II inhibition and soft 2D matrix maximize multinucleation and cellular projections typical of platelet-producing megakaryocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 11458-11463 (2011).
- Liapis, H., Foster, K., Miner, J. H. Red cell traverse through thin glomerular basement membrane. Kidney International. 61 (2), 762-763 (2002).
- Wang, H., et al. Fluorescence-coupled micropipette aspiration assay to examine calcium mobilization caused by red blood cell mechanosensing. European Biophysics Journal. 51 (2), 135-146 (2022).
- Danielczok, J. G., et al. Red blood cell passage of small capillaries is associated with transient Ca2+-mediated adaptations. Frontiers in Physiology. 8, 979 (2017).
- Diez-Silva, M., Dao, M., Han, J., Lim, C. -T., Suresh, S. Shape and biomechanical characteristics of human red blood cells in health and disease. MRS Bulletin. 35 (5), 382-388 (2010).
- Maître, J. -L., Niwayama, R., Turlier, H., Nédélec, F., Hiiragi, T. Pulsatile cell-autonomous contractility drives compaction in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (7), 849-855 (2015).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. eLife. 5, e15447 (2016).
- Bogdanova, A., Makhro, A., Wang, J., Lipp, P., Kaestner, L. Calcium in red blood cells-a perilous balance. International Journal of Molecular Sciences. 14 (5), 9848-9872 (2013).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018. , Available from: https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf (2018).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Sforna, L., et al. Piezo1 controls cell volume and migration by modulating swelling-activated chloride current through Ca2+ influx. Journal of Cellular Physiology. 237 (3), 1857-1870 (2022).
- High speed pressure clamp. ALA Scientific Instruments. , ALA Scientific. Available from: https://alascience.com/products/hspc-2sb/ (2023).
- Teledyne Imaging Prime 95BTM Scientific CMOS Camera Datasheet. , Available from: https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2019/10/Prime-95B-Datasheet-07172020.pdf (2020).
- Lee, L. M., Lee, J. W., Chase, D., Gebrezgiabhier, D., Liu, A. P. Development of an advanced microfluidic micropipette aspiration device for single cell mechanics studies. Biomicrofluidics. 10 (5), 054105 (2016).
- Weaver, W. M., et al.
- Zhou, E. H., Lim, C. T., Quek, S. T. Finite element simulation of the micropipette aspiration of a living cell undergoing large viscoelastic deformation. Mechanics of Advanced Materials and Structures. 12 (6), 501-512 (2005).
- Oh, M. -J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness. Journal of Visualized Experiments. (67), e3886 (2012).
- Rand, R. P., Burton, A. C. Mechanical properties of the red cell membrane. Biophysical journal. 4 (4), 303-316 (1964).
- Hogan, B., Babataheri, A., Hwang, Y., Barakat, A. I., Husson, J. Characterizing cell adhesion by using micropipette aspiration. Biophysical Journal. 109 (2), 209-219 (2015).
- Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration. The European Physical Journal E. 14 (2), 149-167 (2004).
- Hochmuth, R. M.
- Pu, H., et al. Micropipette aspiration of single cells for both mechanical and electrical characterization. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 66 (11), 3185-3191 (2019).
- Guevorkian, K., Maître, J. -L. Chapter 10 - Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods in Cell Biology. , 187-201 (2017).
- Biro, M., Maître, J. -L. Chapter 14 - Dual pipette aspiration: A unique tool for studying intercellular adhesion. Methods in Cell Biology. 125, 255-267 (2015).
