Quantificazione rapida di forme ossidate e ridotte di glutatione utilizzando l'orto-ftalaldeide in cellule di mammifero in coltura in vitro

Summary

La quantificazione delle forme ossidate e ridotte di glutatione (GSSG e GSH, rispettivamente) è stata ottenuta attraverso l’uso dell’orto-ftalaldeide (OPA). L’OPA diventa altamente fluorescente una volta coniugato al GSH, ma non è in grado di coniugare il GSSG fino a quando non viene ridotto. Qui, descriviamo un saggio multiparametrico per quantificare entrambi utilizzando la quantificazione delle proteine per la normalizzazione.

Abstract

Il glutatione è stato a lungo considerato un biomarcatore chiave per determinare la risposta antiossidante della cellula. Pertanto, è un marcatore primario per gli studi sulle specie reattive dell’ossigeno. Il metodo utilizza l’orto-ftalaldeide (OPA) per quantificare la concentrazione cellulare di glutatione/i. OPA si coniuga con glutatione ridotto (GSH) tramite legame sulfidrilico per formare successivamente un isoindolo, risultando in un coniugato altamente fluorescente. Per ottenere un risultato accurato sia del glutatione ossidato (GSSG) che del GSH, è necessaria una combinazione di agenti mascheranti e agenti riducenti, che sono stati implementati in questo protocollo. I trattamenti possono anche influire sulla vitalità cellulare. Pertanto, in questo saggio multiparametrico viene presentata la normalizzazione tramite saggio proteico. Il test dimostra un intervallo di rilevamento pseudo-lineare di 0,234 – 30μM (R²=0,9932±0,007 (N=12)) specifico per GSH. Il test proposto consente anche la determinazione del glutatione ossidato con l’aggiunta dell’agente mascherante N-etilmaleimmide per legare il glutatione ridotto, e l’agente riducente tris(2-carbossietil) fosfina viene introdotto per scindere il legame disolfuro nel GSSG per produrre due molecole di GSH. Il test viene utilizzato in combinazione con un test convalidato dell’acido bicinconninico per la quantificazione delle proteine e un test dell’adenilato chinasi per la valutazione della citotossicità.

Introduction

Le specie reattive dell’ossigeno (ROS) sono un induttore primario dello stress ossidativo; lo stress ossidativo è stato ben consolidato nella generazione di mutazioni del DNA, nell’invecchiamento/morte cellulare, in vari tipi di cancro, diabete, malattie neurologiche (come il Parkinson e l’Alzheimer) e in molte altre condizioni debilitanti per la vita 1,2,3,4,5. Una difesa chiave contro i ROS sono gli antiossidanti tiolici, non enzimatici, che sono in grado di ridurre gli ossidanti o i radicali agendo come donatori di protoni ^6,7. Il glutatione (GSH) e la cisteina sono i due tioli più diffusi trovati nei mammiferi⁸, mentre esistono vari altri tioli a basso peso molecolare (come l’ergotioneina), il GSH e la cisteina sono gli antiossidanti non enzimatici più comunemente misurati trovati in letteratura ^9,10,11 e hanno la massima rilevanza per combattere i ROS 8,12,13,14.

Quando il GSH viene utilizzato come antiossidante, due molecole di GSH sono legate insieme in modo covalente tramite un legame disolfuro per produrre glutatione disolfuro (GSSG). La deplezione di GSH è spesso usata come indicatore di stress ossidativo^15,16. Questa valutazione può anche essere combinata con la rilevazione del GSSG, sebbene l’aumento del GSSG nelle cellule sia spesso limitato da processi di esportazione attivi poiché il GSSG può essere relativamente reattivo nelle cellule, portando alla formazione di legami disolfuro con altri tioli proteici¹⁶.

I metodi tradizionali per misurare il GSH e il GSSG non sono processi semplici e richiedono numerosi passaggi, tra cui l’estrazione cellulare con reagenti litici^17,18. Il protocollo qui descritto semplifica questi metodi e consente la misurazione accurata di tioli non enzimatici e la normalizzazione utilizzando il contenuto proteico cellulare o il rilascio di adenilato chinasi. Inoltre, è possibile misurare la vitalità cellulare prima dell’estrazione di GSH/GSSG. Diversi metodi hanno precedentemente tentato di individuare e quantificare in modo efficiente i tioli non enzimatici ridotti e ossidati; metodi che includono l’uso di HPLC^19,20,21, saggio su piastra (biochimico)22,23,24,25 e che utilizzano reagenti comuni per la coniugazione dei tioli, come 5,5-ditio-bis-(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB/reagente di Ellman)¹⁹, monoclorobimane (mBCI)26,27,28. Diverse aziende hanno anche preparato kit proprietari per la rilevazione del glutatione; Tuttavia, non pubblicano le incompatibilità dei reagenti, il che presenta problemi che dipendono dai trattamenti utilizzati²⁹.

Questo protocollo delinea un test multiparametrico che rileva tioli ridotti (come il GSH ) tramite coniugazione orto-ftalaldeide (OPA) per produrre un segnale fluorescente rilevabile rispettivamente a 340/450 Ex/Em. Questo test facilita la rilevazione simultanea di GSH e GSSG (su piastra), attraverso l’uso di agenti mascheranti (N-etilmaleimmide) e agenti riducenti del GSSG (tris(2-carbossietil) fosfina). Questo protocollo multi-biomarcatore offre anche l’opportunità durante la fase di lisi cellulare di quantificare le proteine tramite il saggio dell’acido bicinconninico per la normalizzazione dei campioni al termine della misurazione finale o tramite un saggio dell’adenilato chinasi dal terreno cellulare. Questo test può essere eseguito utilizzando diversi reagenti prontamente disponibili nella maggior parte dei laboratori e richiede solo alcune sostanze chimiche non comuni aggiuntive. Il processo è semplice, accessibile e può essere eseguito senza fasi laboriose in meno di 2 ore.

In questo protocollo, sono stati scelti vari nanomateriali che in precedenza avevano dimostrato di indurre ROS o sospettati di indurre stress ossidativo ^30,31. È stato esplorato un intervallo di concentrazione per vedere gli effetti dell’esposizione di questi nanomateriali su varie linee cellulari e l’efficacia del test nel quantificare i tioli antiossidanti.

Protocol

NOTA: Il seguente protocollo è stato progettato con la capacità di essere utilizzato in combinazione con un test della proteina dell’acido bicinchoninico (BCA) e un test dell’adenilato chinasi (AK) per normalizzare i campioni ai trattamenti. Assicurarsi che l’operatore indossi un abbigliamento adeguato e le attrezzature di sicurezza necessarie, come un camice da laboratorio Howie, guanti in nitrile e occhiali di sicurezza di classe I, durante la preparazione e l’uso dei materiali. Il protocollo si articola in diverse fasi. 1. Preparazione delle soluzioni di magazzino e di lavoro Preparare soluzioni madre di 100 mM GSH standard in 1 mM di HCl (preparato con il 37% di HCl in acqua bidistillata (ddH2O)).NOTA: In caso di diluizione da acido altamente concentrato, come il 37% di HCl, assicurarsi che il processo di aggiunta di acido all’acqua sia corretto in una cappa aspirante di classe I. Preparare una scorta di 22,35 mM OPA in etanolo assoluto. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante di classe I. Preparare 25 mM di N-etilmaleimmide (NEM) in ddH2O. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante di classe I.NOTA: Queste tre soluzioni possono essere conservate a -20 °C per un massimo di 3 mesi. Preparare 0,01 M di Tris(2-carbossietil) fosfina (TCEP) fino a un volume totale di 500 μl, necessario per 100 pozzetti. Preparare 100 μl di 1 mM GSH standard, diluiti da 100 mM di stock utilizzando ddH2O. Utilizzare il tampone di lisi per immunoprecipitazione (IP) o la seguente formulazione: 394 mg di Tris-HCl (concentrazione finale 25 mM), 877 mg di NaCl (concentrazione finale 150 mM), 29 mg di EDTA (concentrazione finale 1 mM), 1 mL di 100% NP-40 o IGEPAL CA-630 (concentrazione finale di 1% V/V), 5 mL di glicerolo (concentrazione finale 5% V/V), 84 mL di ddH2O. Miscelare i componenti agitando delicatamente e regolare il pH a 7,4. Decantare in un matraccio tarato da 100 mL e aggiungere il volume rimanente di ddH2O per raggiungere un volume finale di 100 mL. Filtrare in modo sterile con un filtro da 0,22 μm e conservare a 2-8 °C per un massimo di 6 mesi.NOTA: Le soluzioni lisanti agiscono come contaminante/interferente in questo saggio; Pertanto, vengono specificate le formulazioni di cui sopra. Preparare 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato 0,1 M integrata con acido etilendiammina tetraacetico (PBS-EDTA) a 3 diversi valori di pH, in particolare 7,2, 8,5 e 9,0. Utilizzare un tampone PBS 0,1 M in commercio integrato con 1 mM di EDTA (292,24 mg/L) o la seguente formulazione 10x (1 L): 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, 800 mL di ddH2O. Aggiungere e mescolare; rabboccare fino a 1 L. Autoclavare la soluzione per la sterilità e conservarla per 12 mesi a temperatura ambiente. Dalla soluzione madre 10x, creare una soluzione funzionante di PBS e integrarla con EDTA (concentrazione come indicato in precedenza).NOTA: Il pH è di fondamentale importanza; assicurarsi che il pH sia accurato prima di iniziare il protocollo. Eseguire la diluizione seriale 1:2 di 1 mM GSH utilizzando ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM e 7,8125 μM). Aggiungere 10 μl di ciascuna concentrazione ai pozzetti standard (eseguito in duplicato). I campioni saranno ulteriormente diluiti in tampone di lisi; quindi, le concentrazioni saranno 1/5 della loro concentrazione originale in seguito (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM).NOTA: Le concentrazioni finali per la calibrazione saranno 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm e 234,4 nm. 2. Preparazione del saggio NOTA: Questo protocollo utilizza linee cellulari umane HepG2, A549 e J774, che sono state acquistate commercialmente da ATCC. Queste linee cellulari sono state utilizzate secondo le linee guida approvate delineate dagli atti e dai regolamenti sulle colture animali e tissutali dell’Università. A 24 ore prima dell’inizio del saggio, seminare le cellule alle concentrazioni indicate nella Tabella 1; Tuttavia, a seconda della linea/tipo di cella e del trattamento utilizzato, regolare la densità secondo necessità. Coltivare le cellule in un terreno di crescita completo (Eagles modified essentials medium (EMEM) con il 10% di siero fetale di vitello inattivato termicamente (HIFS), l’1% di Penstrep (10.000U/mL di penicillina/10mg/mL di streptomicina) e l’1% di aminoacidi non essenziali. Cellule di semina con metodi convenzionali di semina cellulare32. Seminare le cellule in piastre completamente nere se non si utilizza la microscopia post-analisi. Valutare la confluenza e la salute generale delle cellule nel pallone T75 prima dell’uso al microscopio. In una cabina di sicurezza biologica di classe II, pulita e sterile, e seguendo una rigorosa tecnica asettica, scartare il terreno cellulare, lavare delicatamente le cellule con ~15 mL di PBS sterile a temperatura ambiente (RT) e scartarle. Al pallone cellulare, aggiungere 5 mL di tripsina sterile 1x, agitare delicatamente per garantire la copertura del monostrato cellulare e riporre in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per facilitare il distacco delle cellule. Arrestare la tripsinizzazione con l’aggiunta di un terreno di coltura contenente siero fetale di vitello inattivato termicamente (10%), circa 10 ml. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 50 mL e pellettare a 200 x g per 5 minuti. Eliminare il supporto e sostituirlo con 5 ml dello stesso supporto. Risospendere le cellule nella provetta fino a quando non si osservano grumi omogenei e non si possono osservare grumi. Rimuovere 20 μl di sospensione cellulare e metterli in un emocitometro per il conteggio. Una volta calcolato il numero di cellule necessarie, eseguire una diluizione per ottenere una soluzione con la corretta densità cellulare. Terreni per pipette contenenti cellule in piastre a 96 pozzetti (capacità di 350 μl), con un volume massimo di 200 μl per pozzetto. Porre le cellule in un’incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per 24 ore per far aderire alla superficie della piastra. Per valutare sia il glutatione totale che il GSSG, trattare i campioni per entrambe le condizioni. Seminare e trattare 6 pozzetti per fornire 2 set ciascuno di GSH e GSSG con 3 ripetizioni tecniche (la Figura 1 mostra il layout). Assicurarsi che tutti i reagenti siano adeguatamente preparati prima dell’inizio del test; assicurarsi che tutti i componenti tampone e i reagenti siano in RT prima di iniziare la costruzione dei tamponi o l’uso nel test, ad eccezione del pH 7,4 PBS (senza EDTA), che deve essere conservato su ghiaccio/refrigerato fino all’uso.NOTA: È di fondamentale importanza limitare al minimo la formazione di bolle per consentire le reazioni desiderate all’interno del saggio e consentire una quantificazione accurata tramite lettore di piastre. Linea cellulare Densità di semina (piastra a 96 pozzetti) HepG2 10.000 celle / pozzetto Visualizzazione del materiale A549 5.000 celle/pozzetto J774 10.000 celle / pozzetto Tabella 1: Densità di semina suggerite per le linee cellulari scelte. Sono state dimostrate diverse densità di semina per tre diverse linee cellulari utilizzate nei dati rappresentati, in particolare A549, J774 e HepG2. Figura 1: Schema proposto per la semina di piastre a 96 pozzetti per la determinazione simultanea del glutatione totale e del glutatione disolfuro. Vengono inoltre dimostrati i pozzetti per la calibrazione e i controlli. I pozzi che non vengono utilizzati sono rappresentati con una croce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 3. Trattamento dei nanomateriali Pesa i nanomateriali (in particolare ZnO, TiO2, CuO e Ag) in una bilancia in grado di μg. Eseguire un calcolo per raggiungere una concentrazione iniziale di 1 mg/mL per nanomateriale. Trasferire le soluzioni di nanomateriali in un sonicatore e sonicare per 16 minuti utilizzando un bagno di sonicazione (38 W) per produrre una soluzione omogenea. Effettuare una serie di diluizioni per ogni nanomateriale a 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL. Rimuovere le cellule dall’incubatrice e lavare leggermente con RT PBS. Dopo essersi assicurati che tutto il PBS sia stato rimosso, aggiungere 100 μl di trattamenti alla piastra, con controlli (terreni di coltura senza HIFS). Dopo aver applicato il trattamento alle cellule, incubare con i nanomateriali in un incubatore a 37°C (5% CO2) per 4 ore; successivamente, utilizza il protocollo seguente per quantificare il GSH: GSSG, concentrazione proteica e rilascio di AK. 4. Protocollo di analisi Dopo l’esposizione al trattamento (Figura 2A), valutare la vitalità tramite l’attività dell’adenilato chinasi (AK) (opzionale). Utilizzare un kit commerciale per questo test seguendo le istruzioni del produttore. Centrifugare le piastre in una centrifuga a 200 x g per 5 minuti per trattare leggermente i pellet e i detriti cellulari (Figura 2B). Rimuovere delicatamente 20 μl di surnatante da ciascun campione e controllare il pozzetto (come specificato sopra) e pipettare in una piastra bianca adiacente a 96 pozzetti nello stesso formato di layout (Figura 2C). Aggiungere 100 μL di soluzione di lavoro dal kit AK a ciascun pozzetto, proteggere la piastra dalla luce e lasciare sviluppare per 10 minuti a temperatura ambiente. Registra la luminescenza utilizzando un lettore di piastre a 1000 conteggi/s. Per gli standard GSH, aggiungere 40 μl di tampone glutatione totale a ciascun pozzetto (Figura 2D; opzionale, necessario per la quantificazione). Aspirare il terreno rimanente dalla piastra e lavare 3 volte con 0,1 M PBS ghiacciato, pH 7,2, scartando ogni lavaggio (Figura 2E) ad eccezione degli standard. Lasciare il lavaggio finale nella piastra fino a quando la calibrazione GSH non è stata caricata nella piastra. Aggiungere 10 μl di ciascuna concentrazione di glutatione e bianco (ddH2O) in pozzetti in triplicato. Rimuovere il lavaggio PBS finale e aggiungere le miscele a ciascun pozzetto come indicato nella Tabella 2 per la quantificazione target desiderata (Figura 2E). Calcolare i volumi necessari prima di iniziare questo passaggio a causa di una perdita di attività sensibile al tempo con buffer completi. Assicurarsi che queste miscele di reagenti siano preparate prima di iniziare il processo di analisi, ma non lasciarle riposare per più di 30 minuti prima dell’uso. Posizionare su uno shaker orbitale per piastre e lasciare che la piastra agiti a 300 giri/min per 2 minuti (Figura 2F). Togliere dall’agitatore e aggiungere 5 μL di soluzione TCEP 0,01M a ciascun pozzetto, escluso il pozzetto di controllo NEM. Rimettere la piastra nell’agitatore e incubare per 10 minuti (Figura 2F). Trasferire la piastra in centrifuga e centrifugare a 200 x g per 5 min. Trasferire 25 μl da ciascun pozzetto del campione a un’altra piastra a 96 pozzetti (trasparente); Questo sarà utilizzato per la concentrazione proteica (vedi passaggio 4.15 ; Figura 2G). Non trasferire standard o controlli di dosaggio. Assicurarsi che il volume finale per ogni pozzetto sia di 30 μl; rimuovere il volume dai controlli e dagli standard per soddisfare questo requisito (Figura 2H). Aggiungere 170 μl di soluzione OPA di lavoro a ciascun pozzetto, proteggere la piastra dalla luce e posizionarla sull’agitatore per 15 minuti (Figura 2I). Leggere la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre a Ex340/Em450 (Figura 2J). Assicurarsi che non siano presenti bolle durante la fase di misurazione; Avranno un impatto negativo sia sulla reazione che sulla quantificazione tramite lettore di piastre. Per quantificare il contenuto proteico delle cellule lisate, utilizzare un kit di dosaggio BCA commerciale. Trasferire i campioni prelevati dal passaggio 4.12 a una nuova piastra a 96 pozzetti (trasparente) a 25 μl per pozzetto. Utilizzare un’albumina sierica bovina (BSA) standard diluita in tampone di lisi IP e aggiungere alla piastra in triplicato a 25 μl per pozzetto. Le concentrazioni esatte sono definite nel protocollo del kit BCA. Preparare una soluzione di lavoro composta da un rapporto 50:1 dei reagenti A e B del kit BCA e aggiungere 200 μl a ciascun pozzetto contenente campione, standard e controllo. Proteggere le piastre dalla luce e incubare a 37°C per 30 minuti (Figura 2K). Estrarre i campioni dall’incubatore, lasciarli equilibrare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi leggere l’assorbanza tramite lettore di piastre a 562 nm (Figura 2L). Miscela di reagenti per lisi con concentrazione totale di glutatione Componente Volume Tampone di lisi 50μl Volume totale / pozzetto 50μl Miscela di reagenti per lisi con concentrazione di glutatione ossidato Componente Volume Tampone di lisi 49,5 μl NEM (25mM) 0,5 μl Volume totale / pozzetto 50μl UTILIZZARE ENTRAMBE LE SOLUZIONI ENTRO 30 MINUTI DALLA COMPOSIZIONE DELLA MISCELA Componente della soluzione di rilevamento OPA Volume OPA 3mg/mL 5 μl PBS (pH 9,0) 165μL Volume totale / pozzetto 170μl Tabella 2: Volumi di reagenti necessari per l’esecuzione del protocollo. Volumi necessari per pozzetto per la determinazione del glutatione totale, del glutatione disolfuro e del reagente di lavoro richiesto. Assicurati che i volumi richiesti siano calcolati e che sia inclusa un’eccedenza per tenere conto della perdita di volume attraverso il trasferimento. Figura 2: Rappresentazione schematica del protocollo. (A) Semina iniziale, incubazione e trattamento delle cellule. (B) Centrifugazione per separare i mezzi dai solidi sospesi. (C) Trasferimento di terreni per il saggio dell’adenilato chinasi. (D) Aggiunta di concentrazioni di glutatione per l’intervallo di taratura. (E) Fasi di lavaggio e aggiunta di reagenti lizzanti. (F) Aggiunta di tampone e aggiunta di tris(2-carbossietil)fosfina con fase di agitazione. (G) Centrifugazione di cellule lisate per la rimozione di terreni per l’analisi delle proteine. (H) Rimozione del supporto per equalizzare il volume sulla lastra. (I) Aggiunta di soluzione di lavoro di orto-ftalaldeide con incubazione con agitazione. (J) Misurazione della fluorescenza dell’ortoftalaldeide tramite lettore di piastre. (K) Fasi di incubazione per il saggio dell’acido bicinconninico per la determinazione delle proteine. (L) Misura della concentrazione proteica, che consente la normalizzazione del glutatione: valori di glutatione disolfuro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Seguendo questo protocollo, le linee cellulari A549 e J774 sono state seminate a densità rispettivamente di 5.000 cellule/pozzetto e 10.000 cellule/pozzetto, e coltivate a 37 °C in CO2 al 5% per 48 ore. L’analisi dell’AK dopo il trattamento con nanomateriali è mostrata nella Tabella supplementare 1 e la concentrazione proteica è mostrata nella Tabella supplementare 2. Grafico di calibrazioneNella Figura 3 sono mostrate tre calibrazioni che utilizzano l’intervallo di concentrazione dichiarato (concentrazione finale 0,234 – 30 μM) da tre piastre separate di tre diversi tipi di celle (anche se non dovrebbero influire sulla calibrazione) in tre giorni diversi, non consecutivi. Mentre sono mostrati 3 campioni, è stato osservato un N di 12 e ha dimostrato regressioni lineari simili con un valore medio di R2 di 0,9932 ± 0,007. Figura 3: Grafici di calibrazione del glutatione per il saggio. Tre grafici di calibrazione da intervalli di calibrazione del glutatione in piastra separati, ciascuno eseguito a distanza di una settimana; barre di errore ± SD (n=3, N=12) n=repliche tecniche, N=repliche biologiche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Risultati di esempioLe cellule HepG2, A549 e J774 sono state utilizzate nella valutazione di vari nanomateriali sospettati di indurre cambiamenti nei meccanismi cellulari attraverso lo stress ossidativo. Sono stati utilizzati i protocolli di rilevamento e quantificazione descritti. I dati ricevuti dalle 3 misurazioni (AK, BCA e GSH/GSSG) sono stati gestiti come segue. Il test AK e BCA è stato implementato per la normalizzazione; il test AK, utilizzando il kit consigliato, fornirà i dati più rapidi e semplici per la quantità di AK rilasciata nel terreno cellulare. Si prevede un aumento dei valori di AK per aumentare la morte cellulare. Pertanto, è necessario un controllo -ve (Vivo) e +ve (Morto). Ciò consentirà la normalizzazione in base alla percentuale. Il dosaggio dei BCA è un processo più lungo, ma consente di acquisire risultati quantificabili tramite la quantificazione delle proteine (mg/mL). Questo non richiede un controllo -ve o +ve come nell’AK, ma richiederà comunque un controllo generale -ve (cellule non trattate) per consentire il raggiungimento della normalizzazione dei valori. In questa sezione rappresentativa dei risultati, è stato riscontrato che il trattamento (nanomateriali) aveva il potenziale di causare interferenze con il test AK. Pertanto, tutta la normalizzazione è stata eseguita utilizzando i dati BCA. Pertanto, le informazioni sono presentate come la concentrazione delle specie rilevate (GSH o GSH+GSSG (tuttavia, viene eseguita una sottrazione della concentrazione di GSH dalla concentrazione totale di GSH+GSSG per ottenere la concentrazione di GSSG) per mg/mL di proteine (tramite il saggio BCA). Se lo si desidera, questo può essere convertito in un rapporto per valutare la variazione di GSH: GSSG rispetto al trattamento desiderato. Nella Figura 4 sono mostrati i dati del rapporto GSH: GSSG da tre diverse linee cellulari (A549, J774 e HepG2) acquisiti utilizzando il protocollo OPA e normalizzati all’espressione proteica tramite BCA (μg/mL), ulteriori dati che specificano ulteriori valori di GSH e GSSG possono essere trovati nella Figura 1 supplementare. Figura 4: Glutatione: Rapporto glutatione disolfuro dall’esecuzione del test. Sono mostrati i rapporti glutatione: glutatione disolfuro di 3 linee cellulari, vale a dire (A) A549, (B) J774 e (C) HepG2. Le cellule sono state incubate con trattamenti (vari nanomateriali in terreni privi di siero) per 4 ore. Le cellule sono state elaborate utilizzando questo protocollo per quantificare le variazioni del glutatione e del glutatione disolfuro e normalizzate tramite quantificazione delle proteine, barre di errore ± SE (n=3, N=3) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. La piastra contiene anche una serie di controlli per garantire che il test sia stato eseguito correttamente. NEM viene aggiunto come componente individuale per dimostrare la mancanza di interazione con i mezzi di rilevamento OPA. Lo standard di calibrazione dimostra un aumento lineare con la concentrazione di GSH, il che dimostra l’effettiva capacità del reagente di rilevamento OPA di legarsi efficacemente a concentrazioni crescenti di GSH. Va notato che questo test si rivolge specificamente ai gruppi sulfidrilici liberi che si trovano comunemente nei tioli (come il GSH, che sono comunemente considerati antiossidanti). Una potenziale interazione è il legame dell’OPA ai tioli proteici, che comporterebbe una raccolta di dati imprecisa. Pertanto, il test BCA è una fase cruciale per normalizzare i dati in proteine e consentire una riflessione accurata del GSH libero. Figura supplementare 1: Figure che dimostrano il glutatione, il glutatione disolfuro e il rapporto glutatione: glutatione disolfuro da 3 linee cellulari, vale a dire, (A) A549, (B) J774 e (C) HepG2. Le cellule sono state incubate con trattamenti (vari nanomateriali in terreni privi di siero) per 4 ore. Le cellule sono state elaborate utilizzando questo protocollo per quantificare le variazioni del glutatione e del glutatione disolfuro e normalizzate tramite quantificazione delle proteine, barre di errore ± SE (n=3, N=3) Clicca qui per scaricare questo file. Tabella supplementare 1: Metadati dei valori di adenilato chinasi per le cellule A549 e J774. Clicca qui per scaricare questo file. Tabella supplementare 2: Metadati dei valori dell’acido bicinconninico con calibrazione per le cellule A549, J774 e HepG2. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Come detto, la necessità di comprendere la redox cellulare, monitorare gli stati di stress ossidativo e la risposta antiossidante è sempre stata cruciale per comprendere e prevenire una miriade di malattie, come i tumori e le neurodegenerazioni^33,34. Qui viene dimostrato un mezzo per migliorare il panorama traslazionale aumentando l’accessibilità di un rilevamento GSH accurato: GSSG con una preparazione rapida e minima.

Questo protocollo dimostra una sequenza multiparametrica di saggi per la determinazione di specie intracellulari di glutatione/tiolo (ridotte e ossidate), con 2 mezzi di normalizzazione tramite saggio della proteina BCA e/o saggio AK. Questo test può anche essere modificato per rilevare vari altri marcatori attraverso la fase iniziale di estrazione del mediatore e può essere semplificato in modo da fornire semplicemente un rapporto tiolico ossidato/ridotto con l’esclusione dell’intervallo di calibrazione.

Quando si considera la valutazione degli analiti, sia mBCI che OPA sono stati esplorati e confrontati per l’uso. Sebbene mBCl abbia inizialmente dimostrato un buon potenziale di segnale, sono state scoperte limitazioni significative nell’uso. In primo luogo, l’uso di cellule vive dimostra il miglior uso di mBCl; tuttavia, dopo la lisi cellulare, il segnale è risultato spento ed è generalmente diminuito in un formato multipozzetto rispetto all’OPA³⁵. Un altro problema è la misurazione del GSSG tramite mBCl, la letteratura è scarsa al riguardo e, attraverso l’ottimizzazione/esplorazione del protocollo, non è stato raggiunto un rilevamento accurato del GSSG attraverso mBCl.

Abbiamo dimostrato che il test OPA presenta intervalli di calibrazione significativamente affidabili, con una media R² di 0,9932 ± 0,007 (N=12) in un intervallo di concentrazione di GSH compreso tra 0,234 e 30 μM. Questo intervallo è stato scelto a causa di precedenti intervalli di riferimento trovati in letteratura³⁵. È teoricamente possibile rilevare il glutatione al di fuori di questi intervalli, ma richiederà modifiche alla concentrazione dei reagenti, al tempo di incubazione e potenzialmente all’attrezzatura utilizzata per la rilevazione. Va notato che ogni lastra richiede un proprio intervallo standard per la quantificazione; La minima variazione di tempo tra lastre eseguite in giorni diversi può avere un effetto significativo sui valori ottenuti durante la misurazione.

L’ottenimento di dati accurati e affidabili da questo protocollo dipende dal rigoroso rispetto di diversi passaggi cruciali. Quando si costruiscono i vari tamponi richiesti nel protocollo, è fondamentale che il pH sia accurato. Pertanto, i tamponi che richiedono un pH di 9 non dovrebbero avere deviazioni superiori a ± 0,1 di questo valore. Ciò è dovuto alla possibilità che i componenti tampone precipitino fuori dalla soluzione con un pH sbagliato; Seguendo esattamente questo protocollo si eviterà questo problema.

Anche la rimozione completa del trattamento e il lavaggio accurato prima della lisi sono fondamentali per evitare artefatti e un’acquisizione imprecisa dei dati durante la fase di lettura della piastra. Una volta che le cellule sono state lisate (fase 4.8), la rimozione del trattamento non è possibile e la piastra non sarà recuperabile. A causa dei volumi di tamponi/reagenti aggiunti in tutto il protocollo che variano tra campioni e standard, è fondamentale che l’utente sia consapevole dei vari volumi, nei passaggi 4.12 e 4.13. L’operatore del saggio viene inoltre informato di questi volumi variabili e istruito a garantire che tutti i volumi siano gli stessi per consentire una misurazione accurata. Poiché i volumi tra i campioni e gli standard non sono visibilmente significativi, può essere un errore facile da commettere per quanto riguarda la presenza di una soluzione in eccesso nel pozzetto del campione.

Ci sono limitazioni a questo protocollo che si basano su passaggi cruciali, che sono fondamentali per acquisire dati accurati e affidabili. Gli utenti che eseguono questo test devono possedere un livello ragionevole di competenze di laboratorio per prevenire problemi indesiderati, come la formazione di bolle. La formazione di bolle ha un impatto drastico sia sulla capacità di reazioni all’interno della micropiastra che sulla misurazione della fluorescenza. L’agente lisante utilizzato in questo protocollo contiene un detergente, che presenta difficoltà a un ricercatore alle prime armi che potrebbe avere difficoltà a prevenire la formazione di bolle. La centrifugazione immediata può salvare questo errore. Il protocollo è anche potenzialmente limitato per quanto riguarda il tipo di cellula; Le linee cellulari A549, J774 e HepG2 sono state utilizzate sia per ottimizzare che per produrre dati per questo protocollo. Altre linee cellulari possono richiedere densità di semina diverse e l’ottimizzazione del protocollo per ottenere dati accurati.

Questo protocollo offre numerosi vantaggi rispetto a diversi saggi esistenti. Sebbene la rilevazione dei tioli utilizzando la ftalaldeide non sia un concetto nuovo, l’utilizzo in un formato di saggio combinato come questo, in una micropiastra, con materiali e attrezzature limitati richiesti, offre un grande potenziale per tutti i laboratori per accedere a questo protocollo. La maggior parte dei kit di tiolo/GSH dei fornitori commerciali non rivela la composizione dei loro reagenti. Pertanto, può essere difficile prevedere il potenziale di incompatibilità/interferenze. Qui, presentiamo ogni componente di tutti i reagenti utilizzati per limitare tale potenziale.

Anche questo protocollo viene eseguito piuttosto rapidamente al termine del periodo di trattamento iniziale. Tenendo conto dell’elaborazione da parte dell’utente tra le fasi di incubazione, l’aspetto della quantificazione dei tioli di questo protocollo può essere eseguito in meno di 1 ora. I campioni vengono contemporaneamente lisati e legati per prevenire l’auto-ossidazione dei campioni, che è ottimale per queste specie di reazione. Sebbene non sia specificato nel protocollo, i campioni possono tecnicamente essere lisati in una piastra e sigillati, consentendo loro di essere congelati per analisi future. Tuttavia, questa modifica al protocollo non è stata esplorata.

Materials

0.22µm filter (optional-For lysis buffer)	Fisher scientific	12561259
100mL volumetric flask	Fisher scientific	15290866
1L Volumetric flask	Fisher scientific	15230876
250mL beaker (optional-For lysis buffer)	Fisher scientific	15409083
8-Channel micropipette (20-200µL)	SLS	FA10011D2
8-Channel micropipette (2-20µL)	SLS	B2B06492
96 well plates – black with clear bottom, TC treated	Fisher scientific	10000631	Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable
96 well plates – clear (TC treated and untreated)	Fisher scientific	10141161	If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear
96 well plates – white, Not TC treated	Fisher scientific	11457009
A549 (lung carcinoma) cell line	ATCC	CCL-185
Absolute ethanol	Merck (Sigma-Aldrich)	1.08543
Aluminium foil	Fisher scientific	11779408	For protecting plates from light
BCA Assay Kit	Thermo	23225
Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor)	Eppendorf	5804
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Merck (Sigma-Aldrich)	E9884
Glutathione (GSH)	Merck (Sigma-Aldrich)	G6013
Glutathione disulfide (GSSG)	Merck (Sigma-Aldrich)	G4501
Glycerol	Merck (Sigma-Aldrich)	G5516
HCl, 37%	Merck (Sigma-Aldrich)	258148	Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also
HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line	ATCC	HB-8065
IGEPAL CA-630	Merck (Sigma-Aldrich)	18896	Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both
IP lysis buffer	Fisher scientific	11825135
J774 (monocyte, macrophage) cell line	ATCC	TIB-67
KCl	Merck (Sigma-Aldrich)	P3911
KH2PO4	Merck (Sigma-Aldrich)	P0662
Micropipette (20-200µL)	SLS	B2B06482
Micropipette (2-20µL)	SLS	B2B06478
Microplate shaker	VWR	444-0041
Na2HPO4	Merck (Sigma-Aldrich)	S9763
NaCl	Merck (Sigma-Aldrich)	S9888
NaOH, 10M	Merck (Sigma-Aldrich)	72068	For pH adjustment only
N-Ethylmaleimide (NEM)	Merck (Sigma-Aldrich)	E3876
NP-40	Merck (Sigma-Aldrich)	492016	Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested
Ortho -Phthaldialdehyde (OPA)	Merck (Sigma-Aldrich)	P1378
PBS 0.1M	Merck (Sigma-Aldrich)	P2272	PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes
Plate reader (with fluoresence capacity)	Tecan	SPARK
Stir bar (optional-For lysis buffer)	Fisher scientific	16265731
Toxilight bioassay kit (AK assay)	Lonza	LT17-217
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M  in H2O	Alfa Aesar	H51864	Can also be purchased crystalised and suspended
TRIS-HCl	Merck (Sigma-Aldrich)	93363
X100 phosphatase and protease cocktail	Fisher scientific	10025743