Summary

Оценка структурной чувствительности внутренне неупорядоченных участков в ответ на гиперосмотический стресс в живых клетках с помощью FRET

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Внутренне неупорядоченные области (IDR) представляют собой гибкие белковые домены, которые изменяют свою конформацию в ответ на изменения окружающей среды. Ансамблевый флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) позволяет оценивать размеры белка в различных условиях. Мы представляем подход FRET для оценки структурной чувствительности РДЭ в живых клетках Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперосмотического стресса.

Abstract

Внутренне неупорядоченные области (IDR) — это белковые домены, которые участвуют в важнейших клеточных процессах. В стрессовых условиях изменяются физико-химические свойства клеточной среды, что напрямую влияет на конформационный ансамбль РДЭ. РДЭ по своей природе чувствительны к возмущениям окружающей среды. Изучение того, как физико-химические свойства клетки регулируют конформационный ансамбль РДЭ, имеет важное значение для понимания экологического контроля их функции. В данной статье мы опишем пошаговый метод измерения структурной чувствительности РДЭ в живых клетках Saccharomyces cerevisiae в ответ на гиперосмотические стрессовые условия. Мы представляем использование ансамбля флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для оценки того, как изменяются глобальные размеры РДЭ при прогрессирующем увеличении гиперосмотического стресса, наложенного на клетки с любым осмолитом. Кроме того, мы предоставляем скрипт для обработки флуоресцентных измерений и сравнения структурной чувствительности для разных РДЭ. Следуя этому методу, исследователи могут получить ценную информацию о конформационных изменениях, которые претерпевают IDR в сложной внутриклеточной среде при изменении окружающей среды.

Introduction

Внутренне неупорядоченные области (РДЭ) являются важнейшими компонентами клеточных процессов1. В сочетании со структурированными доменами IDR имеют важное значение для белковых функций. Аминокислотный состав РДЭ смещен, представлен в основном заряженными, гидрофильными и мелкими остатками. Из-за этого свойства IDR считаются доменами низкой сложности 2,3. Многочисленные РДЭ привлекли к себе внимание, в первую очередь потому, что эти регионы играют решающую роль в патологических состояниях, особенно нейродегенеративных заболеваниях. Такие заболевания характеризуются самосборкой и последующим внеклеточным или внутриклеточным отложением РДЭ в нейронах4. Примерами таких РДЭ являются амилоид-β (Aβ) при болезни Альцгеймера, гентингтин (HTT) при болезни Хантингтона, а также TAR-ДНК-связывающий белок-43 (TDP-43) и слитый при саркоме (FUS) при боковом амиотрофическом склерозе и лобно-височной деменции4. Изучение структурных перестроек РДЭ в контексте заболевания было значительно расширено спектроскопическими методами, в том числе флуоресцентно-резонансным переносом энергии (FRET).

Гидрофильная и расширенная природа РДЭ делает их чрезвычайно чувствительными к изменениям физико-химических свойств растворной среды5. Степень, в которой конформационный ансамбль РДЭ модифицируется окружающей средой, называется структурной чувствительностью 5,6,7. Для изучения конформации и динамики РДЭ можно использовать различные методы, включая круговой дихроизм (КД) и малоугловое рассеяние рентгеновского излучения (SAXS)8,9. К сожалению, CD и SAXS требуют большого количества очищенных белков, поэтому они не подходят для исследований в клетках. В отличие от этого, FRET представляет собой метод, который измеряет интенсивность флуоресценции двух флуоресцентных молекул, которые специфически маркируют одну IDR, что означает, что их можно контролировать в сложных смесях, таких как живые клетки10. Динамическое измерение структурной чувствительности РДЭ в живых клетках необходимо для понимания того, как окружающая среда регулирует конформацию и функцию неупорядоченного протеома.

FRET является мощным методом количественной оценки структурной чувствительности IDR, а также глобулярных и мультидоменных белков в живых клетках. Для этого метода требуется конструкция, состоящая из интересующего IDR, зажатого между двумя флуоресцентными белками (FP), известных как пара FRET. Для этого протокола мы предлагаем использовать mCerulean3 в качестве донорного FP и Citrine в качестве акцепторного FP из-за их большого динамического диапазона по сравнению с другими FP, о которых сообщалось в предыдущем исследовании чувствительности IDR6. Ранее FRET использовался для измерения структурной чувствительности РДК растений в различных клеточных контекстах6. Кроме того, этот метод был использован для характеристики общих размеров белка IDR различными исследовательскими группами как in vitro, так и in vivo 5,11.

В данной работе мы описываем метод ансамбля FRET для изучения структурной чувствительности РДЭ в клетках живых дрожжей (Saccharomyces cerevisiae). Мы показываем репрезентативные результаты, основанные на РДЭ растений под названием AtLEA4-5. AtLEA4-5 неупорядочен в растворе, но сворачивается в α-спираль, когда макромолекулярная скученность индуцируется in vitro12. AtLEA4-5 является хорошей эталонной моделью для этого метода, поскольку он относительно мал (158 остатков), неупорядочен и чувствителен к возмущениям окружающей среды, о чем сообщалось in silico и in vitro 6,12. Представленный здесь метод может быть масштабирован для высокопроизводительных подходов, поскольку дрожжевые клетки легко выращивать, а обработка применяется в небольших объемах. Кроме того, небольшие модификации протокола могут быть применены к другим клеточным системам, таким как бактерии и растительные клетки6. Протокол может быть выполнен в любой молекулярно-биологической лаборатории, имеющей доступ к микропланшетному ридеру с режимом флуоресценции, оборудованию, имеющемуся в большинстве научно-исследовательских учреждений.

Protocol

1. Плазмидная конструкция С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) усилите открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует желаемый IDR. Не включайте стоп-кодон, так как ORF будет окружен генами, кодирующими флуоресцентные белки. Для усиления разработайте праймеры с сайта?…

Representative Results

После трансформации дрожжевых клеток плазмидой pDRFLIP38-AtLEA4-5 наблюдалась флуоресценция положительных трансформантов с помощью трансиллюминатора синего света и фильтра (рис. 1). Приготовление различных растворов для индуцирования гиперосмотического стресса занимает мно…

Discussion

Представленный здесь метод позволяет получить представление о том, как глобальные измерения ансамбля РДЭ воспринимают и реагируют на возмущения окружающей среды. Этот метод основан на генетически закодированной конструкции и не требует никаких дополнительных компонентов, кроме ста?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим сотрудников лаборатории Куэваса-Веласкеса за критическое рецензирование рукописи. Эта работа была поддержана Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT), проект No IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), проект номер 252952; и Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) и CAPD (CVU 1269643) благодарят CONAHCYT за стипендию M.Sc.

Materials

96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

References

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
  14. JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
  15. JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
  16. JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
  17. JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
  18. JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
  19. JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Play Video

Cite This Article
Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

View Video