Estimación de la sensibilidad estructural de regiones intrínsecamente desordenadas en respuesta al estrés hiperosmótico en células vivas mediante FRET
Summary
Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son dominios proteicos flexibles que modifican su conformación en respuesta a los cambios ambientales. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de conjunto (FRET) puede estimar las dimensiones de las proteínas en diferentes condiciones. Presentamos un enfoque FRET para evaluar la sensibilidad estructural de IDR en células vivas de Saccharomyces cerevisiae bajo estrés hiperosmótico.
Abstract
Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR, por sus siglas en inglés) son dominios proteicos que participan en procesos celulares cruciales. Durante las condiciones de estrés, las propiedades fisicoquímicas del entorno celular cambian, lo que afecta directamente al conjunto conformacional de las IDR. Los exámenes exhaustivos son inherentemente sensibles a las perturbaciones ambientales. El estudio de cómo las propiedades fisicoquímicas de la célula regulan el conjunto conformacional de las IDR es esencial para comprender el control ambiental de su función. Aquí, describimos un método paso a paso para medir la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas de Saccharomyces cerevisiae en respuesta a condiciones de estrés hiperosmótico. Presentamos el uso de la transferencia de energía por resonancia fluorescente de conjunto (FRET) para estimar cómo cambian las dimensiones globales de las IDR durante un aumento progresivo del estrés hiperosmótico impuesto a las células con cualquier osmolito. Además, proporcionamos un script para procesar las mediciones de fluorescencia y comparar la sensibilidad estructural para diferentes IDR. Siguiendo este método, los investigadores pueden obtener información valiosa sobre los cambios conformacionales que experimentan las IDR en el complejo entorno intracelular al cambiar de entorno.
Introduction
Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son componentes críticos en los procesos celulares1. En combinación con los dominios estructurados, los IDR son esenciales para las funciones de las proteínas. La composición de aminoácidos de los IDR está sesgada, representada principalmente por residuos cargados, hidrófilos y pequeños. Debido a esta propiedad, los IDR se consideran dominios de baja complejidad 2,3. Numerosas IDR han atraído la atención, principalmente porque estas regiones juegan un papel crucial en las condiciones patológicas, particularmente las enfermedades neurodegenerativas. Estas enfermedades se caracterizan por el autoensamblaje y el posterior depósito extracelular o intracelular de IDR en las neuronas4. Ejemplos de tales IDR incluyen amiloide-β (Aβ) en la enfermedad de Alzheimer, huntingtina (HTT) en la enfermedad de Huntington y proteína de unión al ADN-43 de TAR (TDP-43) y fusionada en el sarcoma (FUS) en la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia frontotemporal4. El estudio de los reordenamientos estructurales de las IDR en el contexto de la enfermedad se ha mejorado significativamente mediante métodos espectroscópicos, incluida la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).
La naturaleza hidrofílica y extendida de los IDR los hace extremadamente sensibles a los cambios en las propiedades fisicoquímicas del entorno de la solución5. El grado en que el conjunto conformacional de IDR es modificado por el medio ambiente se denomina sensibilidad estructural 5,6,7. Se pueden utilizar diferentes técnicas para estudiar la conformación y la dinámica de las IDR, incluyendo el dicroísmo circular (CD) y la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)8,9. Desafortunadamente, la CD y el SAXS requieren grandes cantidades de proteínas purificadas, por lo que no son apropiados para estudios en células. Por el contrario, FRET es una técnica que mide la intensidad de fluorescencia de dos moléculas fluorescentes que marcan específicamente una IDR, lo que significa que pueden ser monitoreadas en mezclas complejas como las células vivas10. La medición dinámica de la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas es necesaria para comprender cómo el entorno regula la conformación y la función del proteoma desordenado.
FRET es un método potente para cuantificar la sensibilidad estructural de las IDR, así como de las proteínas globulares y multidominio en células vivas. El método requiere una construcción que consiste en un IDR de interés intercalado entre dos proteínas fluorescentes (FP), conocido como par FRET. Para este protocolo, sugerimos el uso de mCerulean3 como FP donante y Citrino como FP aceptor, debido a su amplio rango dinámico, en comparación con otros MF reportados en un estudio previo sobre la sensibilidad de lasIDRs 6. La FRET se ha explotado previamente para medir la sensibilidad estructural de una IDR de una planta en diferentes contextos celulares6. Además, esta técnica ha sido utilizada para caracterizar las dimensiones proteicas globales de las IDR por diferentes grupos de investigación tanto in vitro como in vivo 5,11.
Aquí, describimos el método FRET de conjunto para estudiar la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas de levadura (Saccharomyces cerevisiae). Mostramos resultados representativos que se basan en una IDR de planta llamada AtLEA4-5. AtLEA4-5 está desordenada en solución, pero se pliega en α-hélice cuando se induce el hacinamiento macromolecular in vitro12. AtLEA4-5 es un buen modelo de referencia para este método porque es relativamente pequeño (158 residuos), desordenado y sensible a la perturbación ambiental como se ha reportado in silico e in vitro 6,12. El método presentado aquí se puede escalar para enfoques de alto rendimiento porque las células de levadura son fáciles de cultivar y el tratamiento se aplica en pequeños volúmenes. Además, pequeñas modificaciones del protocolo pueden aplicarse a otros sistemas celulares como bacterias y células vegetales6. El protocolo se puede realizar en cualquier laboratorio de biología molecular con acceso a un lector de microplacas con modo fluorescencia, un equipo disponible en la mayoría de las instituciones de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método que aquí se presenta ofrece una forma de obtener información sobre cómo las dimensiones globales del conjunto de exámenes exhaustivos detectan y responden a las perturbaciones ambientales. Este método se basa en una construcción codificada genéticamente y no requiere componentes adicionales más allá de una expresión estable de plásmido en células de levadura, lo que lo hace adaptable para aplicaciones potenciales en otros tipos de células. Además, es versátil para explorar otras perturbaciones f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Cuevas-Velázquez por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) proyecto número IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), proyecto número 252952; y Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Subvención 5000-9182. CET (CVU 1083636) y CAPD (CVU 1269643) reconocen a CONAHCYT por su M.Sc. Beca.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
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