Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تقدير الحساسية التركيبية للمناطق المضطربة جوهريا استجابة للإجهاد المفرط الأسموزي في الخلايا الحية باستخدام FRET

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/66275
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México
* These authors contributed equally

Summary

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية مرنة تعدل شكلها استجابة للتغيرات البيئية. يمكن ل Ensemble fluorescence resonation Transfer Energy (FRET) تقدير أبعاد البروتين في ظل ظروف مختلفة. نقدم نهج FRET لتقييم الحساسية الهيكلية IDR في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية تحت ضغط فرط التناضح.

Abstract

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مجالات بروتينية تشارك في العمليات الخلوية الحاسمة. أثناء ظروف الإجهاد ، تتغير الخصائص الفيزيائية والكيميائية للبيئة الخلوية ، مما يؤثر بشكل مباشر على المجموعة التوافقية من IDRs. IDRs حساسة بطبيعتها للاضطرابات البيئية. تعد دراسة كيفية تنظيم الخصائص الفيزيائية والكيميائية للخلية للمجموعة التوافقية من IDRs أمرا ضروريا لفهم التحكم البيئي في وظيفتها. هنا ، نصف طريقة خطوة بخطوة لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا Saccharomyces cerevisiae الحية استجابة لظروف الإجهاد المفرط الأسموزي. نقدم استخدام نقل طاقة الرنين الفلوري الجماعي (FRET) لتقدير كيفية تغير الأبعاد العالمية ل IDRs أثناء الزيادة التدريجية للإجهاد المفرط الأسموزي المفروض على الخلايا التي تحتوي على أي تناضح. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم نصا لمعالجة قياسات التألق ومقارنة الحساسية الهيكلية لمختلف IDRs. باتباع هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على رؤى قيمة حول التغيرات التوافقية التي تخضع لها IDRs في الوسط المعقد داخل الخلايا عند البيئات المتغيرة.

Introduction

المناطق المضطربة جوهريا (IDRs) هي مكونات حاسمة في العمليات الخلوية1. بالاقتران مع المجالات المهيكلة، تعد IDRs ضرورية لوظائف البروتين. تركيبة الأحماض الأمينية ل IDRs متحيزة ، ممثلة بشكل أساسي بالمخلفات المشحونة والمحبة للماء والصغيرة. بسبب هذه الخاصية ، تعتبر IDRs نطاقات منخفضة التعقيد 2,3. وقد حظيت العديد من الروابطات الإندونيسية بالاهتمام، ويرجع ذلك أساسا إلى أن هذه المناطق تلعب دورا حاسما في الحالات المرضية، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية. تتميز هذه الأمراض بالتجميع الذاتي والترسب اللاحق خارج الخلية أو داخل الخلايا من IDRs في الخلايا العصبية4. ومن الأمثلة على هذه التفاعلات التفاعلية الأميلويد-β (Aβ) في مرض الزهايمر، وهنتنغتين (HTT) في مرض هنتنغتون، وبروتين ربط الحمض النووي لتقرير التقييم الثالث 43 (TDP-43) وتنصهر في الساركوما (FUS) في التصلب الجانبي الضموري والخرف الجبهيالصدغي 4. تم تعزيز دراسة إعادة الترتيب الهيكلي ل IDRs في سياق المرض بشكل كبير من خلال الطرق الطيفية ، بما في ذلك نقل طاقة الرنين الفلوري (FRET).

إن الطبيعة المحبة للماء والموسعة ل IDRs تجعلها حساسة للغاية للتغيرات في الخواص الفيزيائية والكيميائية لبيئة المحلول5. تسمى الدرجة التي يتم بها تعديل المجموعة التوافقية ل IDRs بواسطة البيئة الحساسية الهيكلية5،6،7. يمكن استخدام تقنيات مختلفة لدراسة تشكل وديناميكيات IDRs ، بما في ذلك ثنائية اللون الدائرية (CD) وتشتت الأشعة السينية بزاوية صغيرة (SAXS) 8,9. لسوء الحظ ، تتطلب CD و SAXS كميات كبيرة من البروتينات النقية ، لذلك فهي غير مناسبة للدراسات في الخلايا. في المقابل ، FRET هي تقنية تقيس شدة التألق لجزيئين من الفلورسنت يسميان على وجه التحديد IDR واحدا ، مما يعني أنه يمكن مراقبتهما في مخاليط معقدة مثل الخلايا الحية10. يعد القياس الديناميكي للحساسية الهيكلية ل IDRs في الخلايا الحية ضروريا لفهم كيفية تنظيم البيئة لتشكل ووظيفة البروتين المضطرب.

FRET هي طريقة قوية لقياس الحساسية الهيكلية ل IDRs ، وكذلك البروتينات الكروية ومتعددة المجالات في الخلايا الحية. تتطلب الطريقة بنية تتكون من IDR ذات أهمية محصورة بين اثنين من البروتينات الفلورية (FP) ، والمعروفة باسم زوج FRET. بالنسبة لهذا البروتوكول ، نقترح استخدام mCerulean3 باعتباره FP المانح والسترين كمتلقي FP ، بسبب نطاقها الديناميكي الكبير ، مقارنة ب FPs الأخرى التي تم الإبلاغ عنها في دراسة سابقة حول حساسية IDRs6. تم استغلال FRET سابقا لقياس الحساسية الهيكلية ل IDR للنبات في سياقات خلويةمختلفة 6. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه التقنية لتوصيف أبعاد البروتين الكلية ل IDRs من قبل مجموعات بحثية مختلفة في كل من المختبر وفي الجسم الحي 5,11.

هنا ، نصف طريقة FRET الجماعية لدراسة الحساسية الهيكلية ل IDRs في خلايا الخميرة الحية (Saccharomyces cerevisiae). نعرض نتائج تمثيلية تستند إلى IDR نباتي يسمى AtLEA4-5. AtLEA4-5 مضطرب في المحلول ، لكنه يطوى إلى حلزون α عندما يحدث ازدحام جزيئي كبير في المختبر12. AtLEA4-5 هو نموذج مرجعي جيد لهذه الطريقة لأنه صغير نسبيا (158 بقايا) ، مضطرب وحساس للاضطراب البيئي كما ورد في السيليكو وفي المختبر 6,12. يمكن توسيع نطاق الطريقة المعروضة هنا لنهج الإنتاجية العالية لأن خلايا الخميرة سهلة النمو ، ويتم تطبيق العلاج بكميات صغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق تعديلات صغيرة على البروتوكول على الأنظمة الخلوية الأخرى مثل البكتيريا والخلايا النباتية6. يمكن إجراء البروتوكول في أي مختبر للبيولوجيا الجزيئية مع إمكانية الوصول إلى قارئ الصفائح الدقيقة مع وضع التألق ، وهو جهاز متوفر في معظم المؤسسات البحثية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بناء البلازميد

  1. قم بتضخيم إطار القراءة المفتوح (ORF) الذي يرمز ل IDR المطلوب عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لا تقم بتضمين كودون التوقف لأن ORF سيكون محاطا بالجينات التي تشفر البروتينات الفلورية. للتضخيم ، صمم البادئات مع مواقع تقييد SacI (5') و BglII (3').
    ملاحظة: بالنسبة لقسم النتائج التمثيلية، استخدمنا AtLEA4-5 باعتباره IDR المحدد. قمنا بتضخيم ORF ل AtLEA4-5 من بلازميد pTrc99A-AtLEA4-512.
  2. هضم منتج ORF PCR عن طريق تقييد متتالي مع إنزيمات SacI و BglII13.
  3. احصل على البلازميد التجاري pDRFLIP38-AtLEA4-5 (# 178189) من Addgene (https://www.addgene.org/178189/).
  4. قم بإجراء تقييد متتالي باستخدام إنزيمات SacI و BglII لإزالة AtLEA4-5 ORF من بلازميد pDRFLIP38-AtLEA4-5 ، تاركا بلازميدا مفتوحا يحتوي على زوج FRET13.
  5. تنقية شظايا الحمض النووي المهضومة باستخدام استعادة هلام من هلام الاغاروز الكهربائي14. اربط الشظايا المقيدة باستخدام إنزيم ربطالحمض النووي 15.
  6. تحويل تفاعل الاستنساخ إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة (DH5α أو سلالات ذات صلة) واختر في لوريا بيرتاني (LB) لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين16. تنمو بين عشية وضحاها (ON) عند 37 درجة مئوية.
  7. عزل وتنمية ما لا يقل عن خمس مستعمرات محولة في صفيحة ونمط وراثي جديد بواسطة PCR17. تنقية الحمض النووي البلازميد من مستعمرة متحولة إيجابية باستخدام طرق miniprep القياسية18.
  8. تحقق من استخراج وسلامة الحمض النووي البلازميد باستخدام هلام الأغاروز الكهربائي19. تحقق من الاستنساخ الصحيح للبناء باستخدام تسلسل سانجر20.

2. تعبير البلازميد في خلايا الخميرة

ملاحظة: استخدم تقنيات التعقيم القياسية لتنفيذ الخطوات التالية. استخدم غطاء تدفق رقائقي ثقافي أو أخف وزنا.

  1. قم بتلقيح سلسلة من سلالة S. cerevisiae BJ5465 (ATCC: 208289) في 3 مل من وسط خميرة بيبتون دكستروز (YPD) وتنمو عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: BJ5465 هو سلالة تعاني من نقص البروتياز (CH1) موصى بها للعمل مع IDRs. يمكن اختبار واستخدام سلالات S. cerevisiae الأخرى.
  2. جهاز طرد مركزي 1 مل من ثقافة الخميرة المشبعة بين عشية وضحاها (OD600 ~ 3-4) عند 14000 × جم لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الماصة.
  3. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت Tris-EDTA (TE) (درجة الحموضة 7.5) عن طريق تحريك الأنبوب برفق. أجهزة الطرد المركزي في 14000 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة بعناية طف.
  4. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول Lazy Bones (40٪ وزن / وزن PEG 3,350 ؛ 100 مللي متر من أسيتات الليثيوم ؛ 10 مللي متر Tris-HCl ؛ 1 mM EDTA ؛ درجة الحموضة 7.5) عن طريق الماصة. أضف 25 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية من السلمون المغلي (100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، متبوعا بالتبريد على الثلج لمدة 5 دقائق) إلى خلايا الخميرة المعاد تعليقها.
  5. أضف 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد إلى الخليط ودوامة الخليط لمدة 1 دقيقة لضمان خلط شامل. اسمح للخليط بالوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة.
  6. يخفق خليط الخميرة بالحرارة على حرارة 42 درجة مئوية لمدة 12 دقيقة ، ثم يبرد على الثلج لمدة 12 دقيقة أخرى. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 14 000 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة بعناية طف.
  7. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من المخزن المؤقت TE (درجة الحموضة 7.5). صفيحة 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على وسط تسرب الخميرة الاصطناعية بدون ألواح اليوراسيل (SD-ura) المكملة ب 15 جم / لتر أجار.
  8. احتضان الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام (الشكل 1). قم بخط ما لا يقل عن خمسة محولات خميرة في طبق جديد وتنمو على.

3. التحقق من صحة محولات الخميرة

  1. اختر جزءا صغيرا من كل مرشح محول عن طريق كشط وتعليق 5 ميكرولتر من 20 مللي متر هيدروكسيد الصوديوم في أنابيب PCR الفردية.
  2. سخني العينة على حرارة 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في جهاز تدوير حراري لتحليل الخلايا وإطلاق الحمض النووي في المحلول. هذه الخطوة ضرورية لإعداد قالب الحمض النووي ل PCR.
  3. نقل 1 ميكرولتر من العينة المغلية إلى مزيج تفاعل PCR منفصل يحتوي على البادئات المناسبة وكواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل للتنميط الجيني. استخدمنا الاشعال التالية: التمهيدي الأمامي: 5'-AAATATACCCCCCCCTCGATCTAGA-3'. التمهيدي العكسي: 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCG-3'.
  4. قم بإعداد تفاعل PCR والتحقق من وجود البلازميد الصحيح باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. حدد محولا واحدا لمزيد من التجارب.

4. إعداد ثقافة خلايا الخميرة لمقايسة الحنق

  1. قم بتلقيح خط من محول الخميرة المحدد إلى 3 مل من السائل 1x وسط SD-Ura.
    ملاحظة: قم بهذا الإجراء في غطاء التدفق الصفحي والمواد المعقمة.
  2. تنمو عند 30 درجة مئوية ، 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة على الأقل للوصول إلى التشبع. قياس OD600. وينبغي أن يتراوح النمو بينالتوجيه التنفيذي 600 = 1.0-2.0.
    ملاحظة: إذا كان OD600 أقل من 1.0 ، فامنح الخلايا وقتا أطول للحضانة للنمو. إذا تجاوز OD600 2.0 ، فلا تقم بالمتابعة وإعادة التشغيل من الخطوة 4.1.

5. تحضير خلايا الخميرة لمقايسة الحنق

  1. اجمع 2 مل من مزرعة الخميرة الليلية وأجهزة الطرد المركزي عند 14000 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية عن طريق الماصة.
  2. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 50 mM 2- (N-Morpholino) حمض إيثان سلفونيك (MES) عازلة (درجة الحموضة 6).
  3. أجهزة الطرد المركزي عند 14000 × غرام في درجة حرارة الغرفة. إزالة الطاف.
  4. كرر الخطوتين 5.2 و5.3. أعد تعليق خلايا الخميرة في 2 مل من المخزن المؤقت MES ، درجة الحموضة 6 وصب الحجم في خزان الكاشف.

6. إعداد قياسات التألق

ملاحظة: يعتبر المسح الحالي قد تم إجراؤه في قارئ صفيحة دقيقة مع وضع التألق.

  1. بالنسبة للإعدادات الأساسية ، اضبط الجهاز على النحو التالي: نوع القياس: طيف شدة التألق (FI) ؛ اسم الصفيحة الدقيقة: غرينر 96 F-أسفل.
  2. بالنسبة للإعدادات البصرية ، اضبط الأداة على النحو التالي: لا. عدد نقاط مسح الطول الموجي: 91 ؛ الطول الموجي للإثارة: 433 نانومتر. عرض النطاق الترددي للإثارة: 10 نانومتر ؛ الطول الموجي للانبعاث: 460 - 550 ؛ عرض الخطوة: 1 نانومتر ؛ عرض النطاق الترددي للانبعاثات: 10 نانومتر ؛ الارتفاع البؤري الذي تم الحصول عليه عن طريق ضبط تلقائي للصورة ؛ الارتفاع البؤري: 5 مم ؛ الطول الموجي المستخدم للكسب: 490 نانومتر.
  3. للإعدادات العامة ، اضبط الأداة على النحو التالي: وقت الاستقرار: 0.1 ثانية ؛ اتجاه القراءة: أحادي الاتجاه ، أفقي من اليسار إلى اليمين ، من أعلى إلى أسفل.
    ملاحظة: يجب ضبط الكسب الذي تم إدخاله يدويا لكل قياس باستخدام البئر المتوقع لعرض أعلى مستويات شدة مضان طوال مسح الطول الموجي.

7. إعداد المحاليل مفرطة التوتر وقياسات مضان

  1. تحضير المحاليل من 0 M و 0.2 M و 0.4 M و 0.6 M و 0.8 M و 1 M و 1.5 M و 2 M NaCl في صفيحة سوداء صافية القاع 96 بئرا. سيكون الحجم النهائي في كل بئر 200 ميكرولتر (150 ميكرولتر من محلول الأسموليت + 50 ميكرولتر من تعليق خلية الخميرة).
    ملاحظة: يمكن استخدام الأسموليتات الأخرى للحث على الإجهاد المفرط الأسموزي. يجب تحضير جميع المحاليل في مخزن مؤقت 50 mM MES pH 6.
  2. قم بتحميل 150 ميكرولتر من 50 mM MES buffer ، ودرجة الحموضة 6 في الآبار الثلاثة الأولى من الصف A (A1 ، A2 ، A3) وفي الآبار اللاحقة ، أضف 150 ميكرولتر من المحلول المقابل بترتيب متزايد من اليسار إلى اليمين (الشكل 2). لاختبار جميع التركيزات المقترحة ، استمر في التحميل في الصف B.
    ملاحظة: يأخذ هذا الإعداد في الاعتبار قياسات 3 مكررات تقنية لكل تركيز.
  3. استخدم ماصة دقيقة ذات 12 قناة لنقل 50 ميكرولتر من خلايا الخميرة المغسولة إلى كل بئر. تميل خلايا الخميرة إلى الترسب في قاع الخزان. تأكد من إعادة تعليق تعليق الخميرة جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل قبل نقل الخلايا.
  4. قم بتحميل الخلايا في لوحة 96 بئرا تحتوي على المحاليل المختلفة واخلطها جيدا عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 4x على الأقل.
  5. قم بقياس أطياف انبعاث شدة التألق على الفور للآبار المطلوبة في قارئ الصفائح الدقيقة مع إعدادات المواصفات الخاصة بالخطوة 6. كرر الإجراء لكل IDR ليتم اختباره في مقايسة FRET.
  6. خطوة اختيارية. إذا كان ذلك متاحا ، فقم بقياس بنية المتبرعين فقط (pDRFLIP38-mCerulean3) باتباع الخطوات الموضحة هنا.
    ملاحظة: نوصي بتنفيذ هذه الخطوة لحساب كفاءة الحنق لكل حالة. إذا لم يتمكن القارئ من تنفيذ هذه الخطوة ، فيمكن حساب FRET باستخدام طريقة نسبة FRET. يتم شرح كلتا الطريقتين لحسابات FRET في الخطوتين 8 و 9.
  7. قم بإجراء ثلاث نسخ متماثلة على الأقل في ثلاثة أيام مستقلة لكل بناء.

8. معالجة البيانات باستخدام طريقة كفاءة FRET

ملاحظة: بالنسبة للقراء الذين لديهم معرفة بلغة البرمجة R ، نقدم مجموعة من البرامج النصية R لإجراء معالجة البيانات الموضحة في هذا القسم. يمكن العثور على البرامج النصية في https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. اتبع الإرشادات الموجودة في الملف التمهيدي.

  1. تصدير البيانات كملفات .xlsx من قارئ الألواح الدقيقة.
  2. تطبيع قيم شدة التألق عند كل طول موجي للمسح إلى نقطة isosbestic لزوج FRET المستخدم.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لمقارنة أطياف جميع الحالات التي تم اختبارها. النقطة المتساوية لزوج mCerulean3 و Citrine FRET هي 515 نانومتر. على سبيل المثال ، احصل على نسبة قيم شدة التألق 460 نانومتر / 515 نانومتر ، 461 نانومتر / 515 نانومتر ، 462 نانومتر / 515 نانومتر ، وهكذا.
  3. احسب المتوسط لكل تكرار تقني بمجرد تطبيع قيم التألق. في المجموع ، يجب أن يكون هناك عمود لكل حالة من حالات الإجهاد المفرط التناضح.
  4. تصور جميع أطياف شدة التألق في نفس المخطط (الشكل 3). يجب أن يعرض كل طيف مزيجا من أطياف الانبعاث الفلوري ل mCerulean3 والسترين الفرديين. في حالات نادرة ، حيث تكون كفاءة FRET هي 0 ، سيتم ملاحظة طيف انبعاث مضان المانحين فقط ، أو عندما تكون كفاءة FRET 1 ، سيتم ملاحظة مضان المستقبل فقط. تبلغ ذروة الانبعاث الفلوري ل mCerulean3 (المانح) 475 نانومتر ، وذروة انبعاث التألق للسترين (المتقبل) هي 525 نانومتر.
  5. حدد ما إذا كان قياس التألق يعرض تغيرا نموذجيا في الحنق استجابة للإجهاد الأسموزي المفرط. إذا كان تشكيل IDR حساسا للعلاج ، فسوف ينعكس ذلك على أنه تغيير في كفاءة FRET. سيؤدي التغيير النموذجي في كفاءة FRET إلى إقران انخفاض شدة مضان المتبرع بزيادة في شدة مضان المتقبل أو العكس.
  6. تحديد كفاءة الحنق (EFRET). احصل على قيم الذروة الطبيعية للمتبرع (mCerulean3) (475 نانومتر / 515 نانومتر) لبناء IDR والبناء المتبرع فقط لكل حالة من حالات الإجهاد المفرط الأسموزي. استخدم متوسط قيم الذروة الطبيعية للتكرارات الفنية. قم بإجراء هذه العملية لكل من النسخ المتماثلة المستقلة الثلاثة. احسب EFRET بالصيغة التالية:
    Equation 1
    حيث IDA هي النسبة 475 نانومتر / 515 نانومتر من بناء IDR (بناء زوج FRET) ، و ID هي النسبة 475 نانومتر / 515 نانومتر من البناء للمانحين فقط.
  7. قارن كفاءات FRET. تطبيع قيم EFRET لكل حالة إجهاد مفرط التناضح إلى EFRET لحالة عدم الإجهاد (على سبيل المثال ، 0 M NaCl). قم بإجراء مقارنات باستخدام مخطط مربع أو مخطط منحنى سلس. قم بإجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار إحصائي Tukey بعد مخصص (قيم p: * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001).

9. معالجة البيانات باستخدام طريقة نسبة FRET

ملاحظة: إذا تعذر الحصول على قياسات المتبرعين فقط ، فقم بإجراء طريقة نسبة FRET. تقارن هذه الطريقة نسبة FRET عبر ظروف الإجهاد المفرط الأسموزية المختلفة. يجب تنفيذ الخطوات من 7.1 إلى 7.5 قبل خطوات هذا القسم للتحقق من صحة سلوك FRET نموذجي. بالنسبة للقراء الذين لديهم معرفة بلغة برمجة R ، نقدم مجموعة من البرامج النصية R لإجراء معالجة البيانات الموضحة في هذا القسم. يمكن العثور على البرامج النصية في https://github.com/Kaz-bits/cuevaslab-procotols/tree/main/FRET. اتبع الإرشادات الموجودة في الملف التمهيدي.

  1. استخراج البيانات عند 475 نانومتر و 525 نانومتر من ملف xlsx الذي تم تصديره مسبقا من قارئ الألواح الدقيقة. تتوافق هذه القيم مع ذروة الانبعاث الفلوري ل mCerulean3 (المانح ، DxDm) وذروة الانبعاث الفلوري للسترين (المستقبل ، DxAm) عندما يكون الفلوروفور المانح متحمسا (433 نانومتر).
  2. تطبيع قيم شدة التألق عند 475 نانومتر و 525 نانومتر إلى نقطة isosbestic لزوج FRET المستخدم. النقطة المتساوية لزوج mCerulean3 و Citrine FRET هي 515 نانومتر. الحصول على نسبة FRET (DxAm/DxDm).
  3. قارن نسب FRET. تطبيع قيم DxAm/DxDm لكل حالة إجهاد مفرط التناضح إلى متوسط DxAm/DxDm لحالة عدم الإجهاد (على سبيل المثال، 0 M NaCl). قم بإجراء مقارنات باستخدام مخطط صندوقي أو مخطط منحنى أملس (الشكل 4 والشكل 5). قم بإجراء اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار إحصائي Tukey بعد مخصص (قيم p: * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد تحويل خلايا الخميرة باستخدام بلازميد pDRFLIP38-AtLEA4-5 ، لوحظ مضان المحولات الإيجابية باستخدام محول الضوء الأزرق ومرشح (الشكل 1). يستغرق تحضير الحلول المختلفة للحث على الإجهاد الأسموزي المفرط وقتا طويلا ، لذلك نقترح اتباع نموذج 96 بئرا في الشكل 2. مباشرة بعد معالجة الإجهاد المفرط الأسموزي بتركيزات متفاوتة من كلوريد الصوديوم ، تم الحصول على أطياف انبعاث التألق (الشكل 3). تم الحصول على أطياف الانبعاث الفلوري لكل حالة للتحقق من صحة سلوك تغيير FRET النموذجي. مطلوب تطبيع قيم شدة مضان إلى نقطة isosbestic لتصحيح الأخطاء التجريبية. بالنسبة لهذه النتائج التمثيلية ، اختبرنا AtLEA4-5 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا ، وهو نبات IDR6 شديد الحساسية. كمرجع ، اختبرنا أيضا البروتين الكروي ABP غير الحساس قليلا (الشكل 3). يمكن ملاحظة أن كلا البنائين يعرضان مزيجا من أطياف انبعاث mCerulean3 و Citrine (قمم ل FPs المانحة والمستقبلة) ، مما يشير إلى درجة معينة من كفاءات FRET القاعدية في ظل الظروف القياسية (0 M NaCl). بالنسبة ل AtLEA4-5 ، تسبب الإجهاد المفرط الأسموزي في زيادة شدة مضان المستقبل إلى جانب انخفاض في شدة التألق للمانح ، مما يشير إلى الضغط الناجم عن الإجهاد المفرط الأسموزي ل IDR (الشكل 3 أ). لم يلاحظ هذا الاتجاه في ABP (الشكل 3 ب). لتحديد الاختلافات في الحساسية الهيكلية عبر علاجات الإجهاد المفرط التناضحي المختلفة ، قمنا برسم نسبة FRET (DxAm / DxDm) لكل حالة وأجرينا اختبارا إحصائيا أحادي الاتجاه ANOVA (الشكل 4). أخيرا ، قارنا الحساسية الهيكلية ل AtLE4-5 و ABP. لاحظنا أن AtLEA4-5 أظهر حساسية أعلى بكثير من ABP (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: انبعاث مضان لمحولات S. cerevisiae . طبق SD-ura Petri مطلي ب S. cerevisiae تم تحويله باستخدام بلازميد pDRFLIP38-AtLEA4-5. لوحظ مضان باستخدام محول الضوء الأزرق ومرشح برتقالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: قالب لوحة 96 بئرا لنظام FRET. يتم وضع ثلاث نسخ تقنية لكل حالة إجهاد مفرط التناضح في آبار متتالية. يناسب الصفان الأولان (A و B) ثمانية شروط لبناء واحد (IDR1). يمكن أن تستوعب الصفوف التالية بنيات جديدة (IDR2 ، IDR3 ، إلخ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أطياف انبعاث الفلورة الطبيعية تحت ظروف إجهاد مفرط التناضح مختلفة. تحققت Spectra من صحة سلوك FRET النموذجي استجابة لعلاج الإجهاد المفرط الأسموزي (NaCl). (أ) AtLEA4-5 ، IDR شديد الحساسية. تقترن الزيادة في شدة مضان المتقبل مع انخفاض في شدة مضان المتبرع. ب: ABP، وهو بروتين كروي غير حساس قليلا. لوحظت القمم عند 475 نانومتر و 525 نانومتر وفقا لزوج FRET mCerulean3 والسترين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: القياس الكمي للحساسية التركيبية عبر ظروف الإجهاد المفرط الأسموزية المختلفة. نسبة FRET الطبيعية (DxAm/DxDm) لخلايا الخميرة الحية المعالجة بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم. (أ) AtLEA4-5. ب: البروتين المرتبط بالعربي (ABP). ن = 9 قياسات مستقلة. اتجاه واحد ANOVA. NS: غير مهم. قيم p: * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001 ، ****p < 0.0001. تمثل المربعات النسبة المئوية 25-75 (الخط عند الوسيط). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة الحساسية الهيكلية ل AtLEA4-5 و ABP. (أ) نسبة FRET الطبيعية (DxAm/DxDm) في ظل ظروف إجهاد مفرط التناضح مختلفة ل AtLEA4-5 و ABP. n = 3 قياسات مستقلة. (B) قيمة Delta FRET (1.5 M - 0 M NaCl) ل AtLEA4-5 و ABP. تم الإبلاغ عن التغيير على أنه الحساسية الهيكلية للتركيبات المقاسة في نظام FRET عند 1.5 M NaCl. ن = 3 قياسات مستقلة. متوسط ± SD. ثنائي الاتجاه ANOVA باستخدام قيم p التالية: * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، ***p < 0.001 ، ****p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقدم الطريقة المعروضة هنا طريقة للحصول على رؤى حول كيفية استشعار الأبعاد العالمية لمجموعة IDRs للاضطرابات البيئية والاستجابة لها. تعتمد هذه الطريقة على بنية مشفرة وراثيا ولا تتطلب مكونات إضافية تتجاوز التعبير المستقر للبلازميد في خلايا الخميرة ، مما يجعلها قابلة للتكيف مع التطبيقات المحتملة في أنواع الخلايا الأخرى. علاوة على ذلك ، فهو متعدد الاستخدامات لاستكشاف الاضطرابات الفيزيائية والكيميائية الأخرى التي تواجهها الخلايا حقيقية النواة خلال دورة حياتها21. إن حل FRET ملحوظ ، حيث يحدث نقل الطاقة فقط على مقربة من أقل من 10 نانومتر بين المتبرع والمتلقي FPS. ومع ذلك ، فإن القيد الرئيسي هو عدم وجود معلومات هيكلية دقيقة لا يمكن الحصول عليها باتباع طريقة FRET الجماعية.

يشكل عدم التجانس والمرونة المتأصلان في IDRs تحديات عند دراسة مجموعتها في سياق خلوي ، مما يجعل تقنيات مثل علم البلورات بالأشعة السينية غير عملية. تم النظر في الرنين المغناطيسي النووي لدراسة البروتينات المضطربة في الخلايا ، ولكن تغيير الظروف يمكن أن يكون مشكلة بسبب تداخل الإشارة22. يوفر تنفيذ تقنية FRET لدراسة مجموعات IDR المطابقة قدرات فريدة ، مما يسمح برسم خرائط لتوزيع السكان داخل الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استكماله بطرق في المختبر مثل FRET أحادي الجزيء (smFRET) ، مما يعرض قدرته على التكيف مع مختلف الأساليب والظروف التجريبية23. يستخدم هذا البروتوكول mCerulean3 باعتباره FP المانح والسترين كمستقبل FP ، مما يوفر نظاما مباشرا وسهل التتبع. يجب أن يأخذ اختيار أزواج FRET في الاعتبار بعناية التداخل الطيفي للتخفيف من الحديث المتبادل بين الإشارات 24,25. عند الإبلاغ عن التغييرات في الحساسية الهيكلية باستخدام هذه الطريقة ، فإن اختيار مقياس FRET مناسب ، مثل كفاءة FRET (EFRET) ، أمر بالغ الأهمية لتفسير الإشارة الموثوق. بدلا من ذلك ، يمكن تحليل الحساسية الهيكلية ومقارنتها باستخدام نسبة FRET (DXAM / DXDM) ، ولكن هذا يتطلب تصحيحا دقيقا للحديث الفلوري بين المانحينوالمستقبلين 25. يمكن أن يتأثر تفسير بيانات التألق التي تم الحصول عليها من قارئات الصفائح الدقيقة بعوامل مختلفة ، بما في ذلك خصائص الفلوروفورات ، واتجاه ثنائي القطب ، وأنظمة الحنق بين الجزيئات مقابل أنظمة FRET داخل الجزيئات ، وإعداد العينات وتحليل البيانات25.

يعد الحنق بين الجزيئات قيدا رئيسيا على طريقة FRET الجماعية لأنه لا يمكن تجاهلها من التحليل الأولي للبيانات. هذا يشكل اعتبارا مهما للقارئ ، لأنه من المعروف أن بعض IDRs تجند في المكثفات الجزيئية الحيوية26,27. التركيز المحلي للجزيئات الكبيرة في المكثفات الجزيئية الحيوية مرتفع ، مما قد يؤدي إلى تفاعلات بين الجزيئات وبالتالي التأثير على قراءات FRET. بالنسبة ل AtLEA4-5 ، تبين أنه يتجمع ذاتيا في هياكل مثقوبة منفصلة عند الإجهاد المفرط الأسموزي في خلايا الخميرة6. لاستبعاد تأثير الحنق بين الجزيئات ، حضن المؤلفون الخلايا ب 1،6-هيكسانيديول (1،6-HD) ، وهو جزيء يعطل المكثفات الجزيئية الحيوية. حل العلاج 1،6-HD مكثفات AtLEA4-5 ، ولكن لم يتم تقليل مستويات FRET ، مما يشير إلى أن تكثيف البروتين لا يسبب الحنق بين الجزيئات غير المرغوب فيه. نظرا لأن هذا التأثير سيعتمد على كل IDR ، يجب على القراء إجراء مناهج إضافية مثل التبييض الضوئي للمتقبل أو التعبير المشترك عن تركيبات المتبرع فقطوالمتقبل فقط 6. ومع ذلك ، فإن المعلومات التي تم الحصول عليها من مجموعة FRET في الخلايا الحية لها أهمية كبيرة لتوصيف الحساسية الهيكلية ل IDRs.

أحد الجوانب المعقدة للبروتوكول المقدم هنا هو أنه يستخدم كائنا حيا يظهر سلوكا مستجيبا للإجهاد المفرط الأسموزي. في ظل وجود تركيزات خارجية عالية من كلوريد الصوديوم ، يترك الماء الخلية ، مما يزيد من تركيز البروتين الكلي ويخلق بيئة مزدحمة28. IDRs حساسة للتغيرات في ازدحام الجزيئات الكبيرة5،6،11،12. على وجه التحديد ، كان AtLEA4-5 ، البروتين المستخدم كنموذج في هذا البروتوكول ، حساسا لحشود الوزن الجزيئي المختلفة ، ولكن ليس لتركيزات عالية من الأملاح أو الجلسرين في المختبر6. نظرا لأن تراكم الجلسرين مهم لاستجابة وتأقلم خلايا الخميرة مع الإجهاد المفرطالأسموزي 29 ، فمن المناسب تسليط الضوء على أن المساهم الرئيسي في ضغط AtLEA4-5 هو الازدحام الجزيئي خلال الأحداث المبكرة للاستشعار الأسموزي. كيف يتم تغيير بنية AtLEA4-5 خلال المراحل اللاحقة من التأقلم ، عندما يتراكم الجلسرين ، يتطلب مزيدا من التحقيق.

يشمل استكشاف الديناميات التوافقية في البروتينات المضطربة مجموعة متنوعة من التقنيات. في هذا السياق ، FRET هي طريقة محورية. اعتمادا على استفسارات البحث المحددة والميزات قيد الدراسة ، يمكن للباحثين استخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي في الجسم الحي لتوصيفIDRs 30. بالإضافة إلى ذلك ، يعد smFRET أداة قيمة للدراسات في الجسم الحي 23. التحليل الطيفي بالرنين المغنطيسي الإلكتروني (EPR) هو تقنية أخرى تستخدم لدراسة IDRs كميا في سياق خلوي31. الطرق القائمة على قياس الطيف الكتلي هي أيضا أساليب قوية ، لأنها يمكن أن توفر معلومات هيكلية عن التشكل الخلوي للبروتينات32. تشمل هذه الطرق قياس الطيف الكتلي الأصلي (native-MS) وقياس الطيف الكتلي للحركة الأيونية (IM-MS)32,33. كل هذه الطرق تمكن الباحثين من الخوض في التوافقات المتعددة ل IDR وديناميكياته ، وإلقاء الضوء على مساهماتهم في بيولوجيا الخلية. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في هذا العمل لإجراء فحص أولي للحساسية الهيكلية بطريقة عالية الإنتاجية. يمكن أن تركز دراسات المتابعة على اختبار الحساسية الهيكلية في نوع الخلية المطلوب أو مع إمكانية الحصول على رؤية ميكانيكية من خلال طرق في المختبر مثل smFRET أو CD أو SAXS. يعد الجمع بين الأساليب ضروريا للحصول على صورة واضحة للحساسية الهيكلية ل IDR في البيئات المتغيرة للخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر كويفاس-فيلاسكيز على المراجعة النقدية للمخطوطة. وحظي هذا العمل بدعم من برنامج دعم مشاريع البحث والتجديد التقني، والمديرية العامة لخبراء الأكاديميات الشخصية، والمشروع رقم IA203422 التابع للجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك؛ المجلس الوطني للإنسان والعلوم والتكنولوجيا، المشروع رقم 252952؛ وبرنامج دعم البحث وبوسغرادو، كلية كيميكا، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك، منحة 5000-9182. تعترف CET (CVU 1083636) و CAPD (CVU 1269643) ب CONAHCYT لمنحة M.Sc. الدراسية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
  2. Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
  3. Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
  4. Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
  5. Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
  6. Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
  7. Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
  8. Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
  9. Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
  10. Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
  11. Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
  12. Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
  13. JoVE Science Education Database. Restriction enzyme digests. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  14. JoVE Science Education Database. Gel purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  15. JoVE Science Education Database. DNA ligation reactions. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  16. JoVE Science Education Database. Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  17. JoVE Science Education Database. PCR: Principle, instrumentation, and applications. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  18. JoVE Science Education Database. Plasmid purification. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  19. JoVE Science Education Database. DNA gel electrophoresis. , JoVE. Cambridge, MA, USA. (2023).
  20. JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides - Concept. , Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023).
  21. Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
  22. Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
  23. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
  24. Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
  25. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  26. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  27. Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
  28. Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
  29. Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetics. 192 (2), 289-318 (2012).
  30. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  31. Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
  32. Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
  33. Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 203 ،
تقدير الحساسية التركيبية للمناطق المضطربة جوهريا استجابة للإجهاد المفرط الأسموزي في الخلايا الحية باستخدام FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. … More

Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter