测量布氏活锥虫的动态糖体 pH 值变化
Summary
我们描述了一种研究pH值如何响应非洲锥虫血液形式糖体中环境线索的方法。该方法涉及将pH敏感的可遗传蛋白传感器与流式细胞术相结合，以测量pH动态，既可以作为时程测定，也可以作为高通量筛选形式。
Abstract
葡萄糖代谢对非洲锥虫 布氏锥虫至关重要，它是寄生虫发育的重要代谢过程和调节剂。关于环境葡萄糖水平变化时产生的细胞反应知之甚少。在血流和前环形式（昆虫阶段）寄生虫中，糖体容纳了大部分糖酵解。这些细胞器在葡萄糖剥夺的作用下迅速酸化，这可能导致糖酵解酶（如己糖激酶）的变构调节。在以前的工作中，用于进行pH测量的化学探针的定位具有挑战性，限制了其在其他应用中的实用性。
本文描述了表达糖体定位pHluorin2（一种可遗传的蛋白质pH生物传感器）的寄生虫的开发和使用。pHluorin2 是一种比率 pHluorin 变体，在 395 nm 处显示 pH（酸）依赖性激发降低，同时在 475 nm 处产生激发增加。通过将 pHluorin2 开放阅读框克隆到锥虫表达载体 pLEW100v5 中来产生转基因寄生虫，从而在任一生命周期阶段实现诱导蛋白表达。免疫荧光用于确认 pHluorin2 生物传感器的糖体定位，将生物传感器的定位与糖体驻留蛋白醛缩酶进行比较。通过在一系列pH值范围为4至8的缓冲液中孵育细胞，在不同的pH值水平下校准传感器的响应性，我们以前曾使用这种方法来校准基于荧光素的pH传感器。然后，我们使用流式细胞术测量 405 nm 和 488 nm 处的 pHluorin2 荧光，以确定糖体 pH 值。我们验证了表达pHluorin2的活转基因寄生虫的性能，监测pH值随时间的变化以响应葡萄糖剥夺，这是PF寄生虫中糖体酸化的已知触发因素。该工具具有一系列潜在应用，包括可能用于高通量药物筛选。除了糖体pH值之外，该传感器还可以适用于其他细胞器或用于其他锥虫，以了解活细胞环境中的pH动态。
Introduction
与大多数生物体一样，寄生动质体依赖于葡萄糖作为中枢碳代谢的基本成分。该组包括具有重要医学意义的生物，例如非洲锥虫， 布氏锥虫; 美国锥虫， 克氏锥虫; 和 利什曼原虫 属的寄生虫。葡萄糖代谢对寄生虫在致病生命周期阶段的生长至关重要。例如，当被剥夺葡萄糖时，非洲锥虫的血流形式（BSF）会迅速死亡。值得注意的是，糖酵解是感染这一阶段ATP 的唯一来源 1。利什曼原虫寄生虫同样依赖于人类宿主中的葡萄糖，宿主巨噬细胞中的无鞭毛体生命周期阶段依赖于这种碳源的生长2。
虽然这些寄生虫具有不同的生活方式，涉及不同的昆虫媒介，但它们在如何反应和消耗葡萄糖方面有许多共同点。例如，这些寄生虫将大多数糖酵解酶定位到称为糖体的修饰过氧化物酶体中。这种动质体特异性细胞器与哺乳动物过氧化物酶体有关，基于保守的生物合成机制和形态 3,4,5,6。
大多数糖酵解途径酶的区室化为糖体提供了寄生虫特异性的途径调节手段。使用化学 pH 探针，我们确定营养剥夺触发原环形式 （PF） 寄生虫糖体的快速酸化，通过暴露关键糖酵解酶己糖激酶 7,8 上的变构调节剂结合位点导致糖酵解酶活性改变。在我们之前的工作中，化学探针需要不断输送才能使用，这限制了其在其他应用中的实用性。此外，维持 BSF 中糖体中探针分布的挑战限制了该方法在该生命阶段研究糖体 pH 值的效用。
在这项研究中，我们使用荧光蛋白生物传感器 pHluorin2 来监测 BSF 布氏锥虫 的糖体 pH 值变化，以响应包括葡萄糖饥饿在内的环境线索9 （图 1）。这项工作的结果表明，BSF T. brucei 以可逆的方式快速酸化糖体以响应饥饿，类似于我们在 PF 寄生虫中观察到的反应。我们预计这种生物传感器将提高我们对 布氏锥虫 和相关寄生虫糖酵解调节的理解。
Protocol
Representative Results
Discussion
对非洲锥虫的环境感知和反应机制知之甚少。众所周知，营养可用性的变化会引发寄生虫的各种反应，包括糖体的酸化。在这里，我们描述了一种使用可遗传蛋白质传感器、pHluorin2 和流式细胞术研究活细胞中糖体 pH 值对环境扰动的反应的方法。
传感器的使用有几个关键步骤。首先，表达转基因的转染寄生虫的表征很重要，因为表达可能存在细胞间差异。一些转基因的表达水…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pHluorin2-PTS1 由 Twist Bioscience 克隆到 pLEW100v5 中，Twist Bioscience 在高拷贝克隆载体中提供了该构建体;pLEW100v5 是 George Cross 博士的礼物。针对 布氏锥虫 醛缩酶的抗血清可应要求从克莱姆森大学的 Meredith T. Morris 博士处获得。JCM和KAC实验室的工作得到了美国国立卫生研究院（R01AI156382）的部分支持。SSP 由 NIH 3R01AI156382 支持。
Materials
| 50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile) | VWR | 10861-572 | |
| 75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile) | Corning | 431464U | |
| 80 µL flat-bottom 384-well plate | BrandTech | 781620 | |
| Amaxa Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A24858 | FlowJo software |
| BRANDplates 96-Well, flat bottom plate | Millipore Sigma | BR781662 | |
| Coloc 2 plugin of ImageJ | https://imagej.net/plugins/coloc-2 | ||
| CytKick Max Auto Sampler | invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A42973 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman-Coulter | ||
| Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| GraphPad Prism | statistical software | ||
| Nigericin (sodium salt) | Cayman Chemical | 11437 | |
| Nucleofector 2b | Lonza | Discontinued Product | |
| OP2 Liquid Handler | opentrons | OP2 | |
| poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O | Sigma Life Science | CAS:25988-63-0 | Pipetting robot for HTS assay |
| Thiazole Red (TO-PRO-3) | biotium | #40087 | We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler |
| valinomycin | Cayman Chemical | 10009152 | Pipetting robot for HTS assay |
| For pH calibration | |||
| For pH calibration |
References
- Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
- Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine. F1000Res. 4, 938 (2015).
- Parsons, M. Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose. Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).
- Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes. Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).
- Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).
- Allmann, S., Bringaud, F. Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).
- Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change. The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).
- Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei. Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).
- Mahon, M. J. Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- . Restriction digest v.2 Available from: https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2 (2018)
- . Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3 (2021)
- Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).
- Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome. mSphere. 5 (1), e00744 (2020).
- Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis. Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).
- Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).
- Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. 14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange. TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).
- Jankowski, A., et al. In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin. The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).
- Jankowski, A., Grinstein, S. A. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Lin, S., et al. Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei. The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).
- Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).
- Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania. Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).
