Modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique

Summary

Ce protocole présente les outils disponibles pour la modélisation de ligands de petites molécules dans les cartes cryoEM des macromolécules.

Abstract

Déchiffrer les interactions protéine-ligand dans un complexe macromoléculaire est crucial pour comprendre le mécanisme moléculaire, les processus biologiques sous-jacents et le développement de médicaments. Ces dernières années, la microscopie électronique cryogénique d’échantillon (cryoEM) est apparue comme une technique puissante pour déterminer les structures des macromolécules et pour étudier le mode de liaison des ligands à une résolution proche de l’atome. L’identification et la modélisation de molécules non protéiques dans les cartes cryoEM sont souvent difficiles en raison de la résolution anisotrope de la molécule d’intérêt et du bruit inhérent aux données. Dans cet article, les lecteurs sont initiés à divers logiciels et méthodes actuellement utilisés pour l’identification des ligands, la construction de modèles et l’affinement des coordonnées atomiques à l’aide de macromolécules sélectionnées. L’une des façons les plus simples d’identifier la présence d’un ligand, comme illustré avec l’enzyme énolase, est de soustraire les deux cartes obtenues avec et sans le ligand. La densité supplémentaire du ligand est susceptible de se démarquer dans la carte des différences, même à un seuil plus élevé. Il y a des cas, comme le montre le cas du récepteur métabotropique du glutamate mGlu₅, où de telles cartes de différences simples ne peuvent pas être générées. La méthode récemment introduite pour dériver la carte d’omission Fo-Fc peut servir d’outil pour valider et démontrer la présence du ligand. Enfin, en utilisant l’exemple bien étudié de la β-galactosidase, l’effet de la résolution sur la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans les cartes cryoEM est analysé, et une perspective sur la façon dont la cryoEM peut être utilisée dans la découverte de médicaments est présentée.

Introduction

Les cellules accomplissent leurs fonctions en effectuant d’innombrables réactions chimiques simultanément et indépendamment, chacune méticuleusement régulée pour assurer leur survie et leur adaptabilité en réponse aux signaux environnementaux. Ceci est réalisé par la reconnaissance moléculaire, qui permet aux biomolécules, en particulier aux protéines, de former des complexes transitoires ou stables avec d’autres macromolécules ainsi qu’avec de petites molécules ou des ligands¹. Ainsi, les interactions protéine-ligand sont fondamentales pour tous les processus de la biologie, qui comprennent la régulation de l’expression et de l’activité des protéines, la reconnaissance des substrats et des cofacteurs par les enzymes, ainsi que la façon dont les cellules perçoivent et relaient les signaux ^1,2. Une meilleure compréhension des propriétés cinétiques, thermodynamiques et structurelles du complexe protéine-ligand révèle la base moléculaire de l’interaction des ligands et facilite également la conception rationnelle de médicaments en optimisant l’interaction et la spécificité des médicaments. Une approche économique et plus rapide pour étudier l’interaction protéine-ligand consiste à utiliser l’amarrage moléculaire, qui est une méthode computationnelle qui crible virtuellement une gamme variée de petites molécules et prédit le mode de liaison et l’affinité de ces ligands pour cibler les protéines³. Cependant, les preuves expérimentales provenant de structures à haute résolution déterminées par diffraction des rayons X (DRX), résonance magnétique nucléaire (RMN) ou cryomicroscopie électronique (cryoEM) fournissent la preuve essentielle de ces prédictions et aident au développement d’activateurs ou d’inhibiteurs plus récents et plus efficaces pour une cible donnée. Cet article utilise l’abréviation « cryoEM » comme on l’appelle communément. Cependant, il y a un débat en cours sur le choix de la bonne nomenclature, et récemment, le terme cryogénique-échantillon Electron Microscopie (cryoEM) a été proposé pour indiquer que l’échantillon est à température cryogénique et imagé avec des électrons⁴. De même, les cartes dérivées de la cryoEM ont été appelées potentiel électron, potentiel électrostatique ou potentiel de Coulomb, et pour simplifier, nous utilisons ici les cartes cryoEM 5,6,7,8,9,10.

Bien que la XRD ait été la technique de référence dans la détermination de la structure à haute résolution des complexes protéine-ligand, la cryoEM post-révolution^{de résolution 11} a pris de l’ampleur, comme l’indique l’augmentation des cartes de potentiel de Coulomb ou des cartes cryoEM déposées dans la base de données de microscopie électronique (EMDB)^12,13 au cours des dernières années¹⁴. En raison des progrès réalisés dans les méthodes de préparation des échantillons, d’imagerie et de traitement des données, le nombre de dépôts de la banque de données sur les protéines (PDB)¹⁴ utilisant la cryoEM est passé de 0,7 % à 17 % entre 2010 et 2020, avec environ 50 % des structures signalées en 2020 déterminées à une résolution de 3,5 Å ou mieux^15,16. La cryoEM a été rapidement adoptée par la communauté de la biologie structurale, y compris l’industrie pharmaceutique, car elle permet l’étude de macromolécules biologiques flexibles et non cristallines, en particulier les protéines membranaires et les complexes multiprotéiques, à une résolution quasi atomique, surmontant le processus de cristallisation et obtenant des cristaux bien diffractant nécessaires à la détermination de la structure à haute résolution par DRX.

La modélisation précise du ligand dans la carte cryoEM est primordiale, car elle sert de modèle du complexe protéine-ligand au niveau moléculaire. Il existe plusieurs outils automatisés de construction de ligands utilisés en cristallographie aux rayons X qui dépendent de la forme et de la topologie de la densité du ligand afin d’ajuster ou de construire le ligand dans la densité électronique 17,18,19,20. Néanmoins, si la résolution est inférieure à 3 Å, ces approches ont tendance à produire des résultats moins souhaitables car les caractéristiques topologiques dont elles dépendent pour la reconnaissance et la construction deviennent moins définies. Dans de nombreux cas, ces méthodes se sont avérées inefficaces pour modéliser avec précision les ligands dans des cartes cryoEM, car ces cartes ont été déterminées dans la gamme de résolution faible à moyenne, généralement entre 3,5 Å-5 Ź⁷.

La première étape de la détermination de la structure 3D d’un complexe protéine-ligand par cryoEM consiste soit à co-purifier le ligand avec la protéine (lorsque le ligand a une affinité de liaison élevée avec la protéine), soit à incuber la solution protéique avec le ligand pendant une durée spécifique avant la préparation de la grille. Ensuite, un petit volume d’échantillon est placé sur une grille TEM perforée nettoyée au plasma, suivie d’une congélation instantanée dans de l’éthane liquide et enfin d’une imagerie avec un cryo-TEM. La moyenne des images de projection 2D de centaines de milliers à des millions de particules individuelles est calculée pour reconstruire une carte de potentiel de Coulomb en 3D (3D) de la macromolécule. L’identification et la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans ces cartes posent des défis importants dans de nombreux cas en raison de la résolution anisotrope sur l’ensemble de la carte (c’est-à-dire que la résolution n’est pas uniforme sur l’ensemble de la macromolécule), de la flexibilité dans la région où le ligand est lié et du bruit dans les données. De nombreux outils de modélisation, d’affinement et de visualisation qui ont été développés pour la DRX sont maintenant adaptés pour être utilisés dans la cryoEM aux mêmes fins 18,19,20,21. Dans cet article, nous présentons un aperçu des différentes méthodes et logiciels actuellement utilisés pour identifier les ligands, construire des modèles et affiner les coordonnées dérivées de la cryoEM. Un protocole étape par étape a été fourni pour illustrer les processus impliqués dans la modélisation de ligands à l’aide de complexes protéine-ligand spécifiques avec une résolution et une complexité variables.

La première étape de la modélisation des ligands dans les cartes cryoEM comprend l’identification de la densité du ligand (non-protéine) dans la carte. Si la liaison du ligand n’induit aucun changement de conformation dans la protéine, le calcul d’une simple carte de différence entre le complexe protéine-ligand et l’apo-protéine met essentiellement en évidence les régions de densité supplémentaire, suggérant la présence du ligand. De telles différences peuvent être observées immédiatement, car il suffit de deux cartes, et même des cartes intermédiaires pendant le processus de raffinement 3D peuvent être utilisées pour vérifier si le ligand est présent. De plus, si la résolution est suffisamment élevée (<3,0 Å), la carte des différences peut également fournir des informations sur l’emplacement des molécules d’eau ainsi que des ions interagissant avec le ligand et les résidus protéiques.

En l’absence de la carte apo-protéine, il est maintenant possible d’utiliser Servalcat²², qui est disponible en tant qu’outil autonome et a également été intégré dans la suite logicielle CCP-EM ^23,24 dans le cadre du raffinement de Refmac et dans CCP4 8.0 version^25,26. Servalcat permet le calcul d’une carte de différence pondérée FSC (Fo-Fc) en utilisant les demi-cartes non nettes et le modèle d’apoprotéine comme entrée. La carte omise Fo-Fc représente la disparité entre la carte expérimentale (Fo) et la carte dérivée du modèle (Fc). En l’absence d’un ligand dans le modèle, une densité positive dans une carte Fo-Fc qui chevauche la carte EM expérimentale suggère généralement la présence du ligand. L’hypothèse ici est que la chaîne protéique est bien ajustée sur la carte, et que la densité positive restante indique l’emplacement du ligand. Cependant, il est important d’examiner méticuleusement si la densité positive provient d’inexactitudes de modélisation, telles que le mauvais rotamère d’une chaîne latérale de protéines.

La deuxième étape consiste à obtenir ou à créer un fichier de coordonnées cartésiennes du ligand avec une géométrie bien définie à partir des informations chimiques disponibles. Les ligands standard (par exemple, ATP et NADP⁺) qui sont déjà disponibles dans la bibliothèque de monomères CCP4 peuvent être utilisés pour le raffinement en récupérant les fichiers de coordonnées et de géométrie via leur code d’accession de monomère. Cependant, pour les ligands inconnus ou non standard, divers outils sont disponibles pour créer les fichiers de géométrie. Parmi les exemples, citons l’eLBOW²⁷ - (constructeur de ligands électroniques et atelier d’optimisation) dans Phenix²⁸, Lidia - un outil intégré dans Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^32-un module de Glide au sein de la suite Schrödinger. Le fichier de coordonnées du ligand est ensuite ajusté dans la densité, guidé à la fois par la carte expérimentale cryoEM et la carte de différence dans Coot. Vient ensuite le raffinement dans l’espace réel dans Phenix²⁸ ou le raffinement réciproque dans Refmac³³. Un poste de travail Linux ou un ordinateur portable équipé d’une bonne carte graphique et des logiciels mentionnés ci-dessus est nécessaire. La plupart de ces programmes sont inclus dans diverses suites. CCP-EM²⁴ et Phenix²⁸ sont disponibles gratuitement pour les utilisateurs universitaires et incluent une variété d’outils qui sont utilisés dans cet article, notamment Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. De même, Chimera³⁷ et ChimeraX³⁸ fournissent des licences gratuites aux utilisateurs universitaires.

Protocol

1. Modélisation du phosphoénolpyruvate (PEP) dans l’énolase de Mycobacterium tuberculosis

1. Identification de la densité des ligands dans la carte cryoEM du complexe PEP-énolase
   1. Téléchargez les demi-cartes non affûtées (emd_30988_additional_1.map et emd_30988_additional_2.map) de l’apo-énolase à partir des données supplémentaires dans EMDB (voir Tableau des matériaux).
   2. Ouvrez ChimeraX (voir la Table des matériaux). Ouvrez les demi-cartes d’apo-enolase en cliquant sur Ouvrir dans la barre d’outils et en sélectionnant les noms de fichiers. Tapez vop add #1 #2 dans la ligne de commande pour combiner les deux demi-cartes afin d’obtenir la carte non aiguisée apo-énolase.
      REMARQUE : #1 et #2 désignent les deux demi-cartes de l’enzyme apo-énolase, comme mentionné à l’étape 1.1.1.
   3. Renommez la carte combinée (ID de carte ChimeraX : #3) en tapant rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Colorez la carte en gris à partir du panneau du modèle. L’application indique que l’énolase est octamérique dans la solution avec une symétrie D4.
   4. Répétez les étapes 1.1.1-1.1.3 en utilisant les demi-cartes suivantes emd_30989_additional_1.map (ID de la carte : 4) et emd_30989_additional_2.map (ID de la carte : 5) pour obtenir la carte PEP-enolase-unsharpened-map (ID de la carte : #6).
   5. Afin de calculer une carte de différence, ajustez d’abord les deux cartes (cartes non nettes PEP-énolase et apo-énolase des étapes 1.1.3 et 1.1.4) l’une sur l’autre en cliquant sur Ajuster (carte dans la carte) dans le panneau Carte (barre d’outils) de ChimeraX.
      REMARQUE : La normalisation n’est pas effectuée entre les deux cartes. Dans certains cas, une normalisation peut être nécessaire pour amener les cartes à la même échelle.
   6. Soustrayez la carte PEP-énolase de la carte apo-énolase en tapant vop subtract #6 #3 dans la ligne de commande.
      REMARQUE : #6 = Carte non affûtée PEP-énolase, #3 = Carte non affûtée Apo-énolase.
   7. Coloriez la carte soustraite (ID de la carte :7) en vert, indiquant une densité positive (selon la convention en cristallographie aux rayons X)³⁹.
   8. Téléchargez les coordonnées de l’énolase octamérique de M. tuberculosis (PDB : 7e4x) à partir de la Banque de données protéiques (PDB), cliquez sur ouvrir dans la barre d’outils et sélectionnez le nom du fichier.
   9. Renommez le modèle 7e4x.pdb en tapant rename #8 Apo_enolase.pdb dans la ligne de commande. #8 désigne le Apo_enolase.pdb dans ChimeraX.
   10. Sélectionnez le modèle dans le panneau du modèle. Cliquez sur le bouton droit de la souris dans la barre d’outils. Cliquez sur Déplacer la molécule pour positionner le modèle à proximité de la carte PEP-énolase (#6) et aligner le modèle par rapport à la carte. Insérez ce modèle dans la carte PEP-enolase-unsharpened-en tapant fit #8 dans #6 dans la ligne de commande. Ici, la carte est numérotée 6 et le modèle est numéroté 8.
       REMARQUE : Dans certains cas, l’ajustement local dans ChimeraX peut ne pas être suffisant pour aligner le modèle. Dans ces cas, une étape supplémentaire d’ajustement global (DockinMap, voir Table des matériaux) peut être réalisée dans Phenix.
   11. Enregistrez le modèle ajusté en tapant save Apo-enolase.pdb #8 dans la ligne de commande.
2. Modélisation et affinement de la PEP dans la carte cryoEM aiguisée du facteur B du complexe PEP-énolase
   1. Ouvrez « coot » (voir Table des matériaux) depuis le terminal en tapant ./Coot &.
   2. Affichez « Apo-enolase.pdb » en cliquant sur Fichier > Ouvrir les coordonnées Apo-enolase.pdb. Le fichier de coordonnées est affiché par des liaisons (couleur par atome).
   3. Téléchargez la carte affûtée Enolase liée au PEP, c’est-à-dire emd_30989.map depuis EMDB. Affichez la même chose en cliquant sur Fichier > Ouvrir la carte > emd_30989.map . Réglez le seuil sur 7,00 σ en faisant défiler le bouton central de la souris.
   4. Recherchez des objets blob non modélisés en cliquant sur Valider > Objets blob non modélisés > Rechercher des objets blob.
   5. Localisez la densité de ligand non modélisée près des résidus du site actif, Ser 42, Lys-386 et Arg-364 du modèle énolase.
   6. Obtenez le fichier du modèle de monomère PEP à partir de la bibliothèque de monomères Coot en cliquant sur Fichier > Obtenir le monomère et en entrant PEP comme code à 3 lettres.
   7. Déplacez la molécule PEP jusqu’à la densité à l’aide de l’option Rotation/Translation - Zone/Chaîne/Molécule dans le menu latéral. Utilisez le raffinement de l’espace réel dans Coot pour ajuster la molécule PEP dans la densité en cliquant sur Zone d’amélioration de l’espace réel dans le menu latéral. Fusionnez le ligand ajusté avec le fichier Apo-enolase.pdb en utilisant l’option de fusion de la molécule dans l’onglet d’édition . Enregistrez le modèle sous le nom PEP-Enolase.pdb.
      REMARQUE : On peut également utiliser ligand> l’option Jiggle-Fit Ligand pour s’adapter également au ligand.
   8. Pour ajouter des ligands au reste des monomères dans le fichier de coordonnées, cliquez sur Calculer > outils NCS > ligands NCS. Une fenêtre distincte nommée Trouver les ligands liés au NCS apparaîtra. Pour l’option Protéine avec NCS, sélectionnez le fichier de coordonnées Apo-enolase.pdb et l’ID de chaîne A comme Chaîne maîtresse NCS.
      1. Pour la molécule contenant le ligand, sélectionnez Apo-enolase.pdb comme fichier de coordonnées et l’ID de chaîne, J et le numéro de résidu 1 à 1. Cliquez sur Trouver des postes candidats. Une fenêtre nommée Ligands ajustés apparaîtra avec une liste de postes candidats. Évaluez l’ajustement en cliquant sur les ligands candidats individuels et analysez l’ajustement visuellement.
         NOTE : Dans Servalcat/Refmac, seul un modèle monomère peut être fourni, et la symétrie utilisée dans la reconstruction peut être donnée pour obtenir un modèle étendu.
   9. Une densité supplémentaire pour les molécules de solvant a également été observée près du ligand. Les structures cristallines à haute résolution de l’énolase provenant de divers homologues suggèrent la présence de deux ions Mg^{2+ 40,41}, ce qui stabilise probablement la charge négative de l’intermédiaire de la réaction. Modélisez deux ions Mg²⁺ dans la densité du site actif en cliquant sur placer l’atome au pointeur et en sélectionnant MG dans la liste du type d’atome du pointeur.
      REMARQUE : La géométrie et la distance de liaison peuvent être utilisées comme guide pour sélectionner l’ion métallique. Dans le cas du Mg²⁺ lié aux atomes d’oxygène dans les résidus protéiques, la distance de liaison varie entre 2,1 Å -2,4 Å, avec une géométrie octaédrique. Cependant, dans le cas de cartes à faible résolution, la sphère de coordination est souvent incomplète, et la distance peut également varier en raison des limitations de la résolution.
   10. Répétez l’étape 1.2.8 afin d’ajouter les ions Mg²⁺ dans les monomères liés à la symétrie.
   11. Enregistrez le modèle en cliquant sur Fichier > Enregistrer les coordonnées > Sélectionner le nom de fichier > et en tapant Enolase+PEP+Mg.pdb.
   12. Ouvrez l’interface graphique de Phenix (voir la table des matériaux). Exécutez un véritable travail d’affinement de l’espace avec Enolase+PEP+Mg.pdb et le emd_30989.map comme modèle d’entrée et comme carte, respectivement, à l’aide des paramètres par défaut. Cette étape est effectuée de manière itérative avec Coot pour obtenir un bon ajustement et une bonne géométrie du modèle de carte.
       REMARQUE : La carte de différence non accentuée est utilisée pour démontrer la présence d’un ligand, par exemple dans une figure. À des fins de modélisation, la carte affinée du facteur B a été utilisée et est recommandée. La carte affinée du facteur B peut également être utilisée pour calculer la carte de différence à des fins de démonstration, par opposition à la carte non nette. Cependant, si la résolution est plus faible dans la région où le ligand est lié, le facteur B unique utilisé pour affiner l’ensemble de la carte peut ne pas révéler clairement la densité du ligand.
3. Visualisation et génération de figures du ligand modélisé
   1. Ouvrez le modèle raffiné Enolase+PEP+Mg à partir de la dernière tâche de raffinement de Phenix dans PyMOL⁴² (voir la table des matériaux) en cliquant sur Fichier > Ouvrir et en sélectionnant le nom du fichier.
   2. Chargez le fichier emd-30989.map (carte accentuée liée à PEP) en cliquant sur Fichier > Ouvrir et en sélectionnant le nom du fichier.
   3. Renommez la carte en fonction de la fonction PEP en cliquant sur les actions > renommer en fonction de l’objet emd_30989 et en tapant PEP-sharpened.
      REMARQUE : Dans la plupart des cas, par exemple enolase, les cartes lorsqu’elles sont ouvertes dans pymol sont normalisées car l’option normaliser la carte est cochée par défaut dans pymol. Comme les cartes cryoEM sont centrées sur une boîte plus grande, la normalisation inclura tout ce qui se trouve dans la boîte. Ainsi, la normalisation peut être désactivée avant l’ouverture dans pymol.
   4. Sélectionnez les ligands en cliquant sur afficher > séquence.
   5. Tapez isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée.
   6. Coloriez le mesh_ligand en bleu en cliquant sur la dernière case, C, à côté de l’objet mesh_ligand.
   7. Affichez les résidus du site actif, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 et Lys-386 interagissant avec le PEP et le Mg²⁺ dans la représentation en bâtonnet et en sphère, respectivement, et l’enzyme énolase dans la représentation de dessin animé.
   8. Lancez les rayons en tapant ray 3600, 3600 pour générer des images de qualité publication et enregistrez-les en tant que fichier png en cliquant sur Fichier > enregistrer et en choisissant PEP.png comme nom de fichier.

2. Modélisation des ligands dans le récepteur métabotropique du glutamate mGlu₅

1. Identification et modélisation de la densité des ligands dans la carte cryoEM de mGlu lié à l’agoniste et à l’antagoniste₅
   1. Téléchargez les deux demi-cartes ainsi que leurs fichiers de coordonnées correspondants pour chacun des complexes mGlu₅ liés à l’agoniste (EMD-31536, 7fd8.pdb) et à l’antagoniste (EMD-31537,7fd9.pdb).
   2. Ouvrez ChimeraX
      1. Ouvrez le fichier de coordonnées 7fd8.pdb en cliquant sur Ouvrir et en sélectionnant 7fd8.pdb.
      2. Tapez delete ligand dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée.
      3. De même, utilisez la commande delete/B pour supprimer la chaîne B.
         REMARQUE : Les ligands et les chaînes peuvent être supprimés à l’aide du menu déroulant en haut à l’aide de select et actions > atomes/liaisons > supprimer.
      4. Enregistrez la pdb non ligandée en tapant ce qui suit dans la ligne de commande : save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 désigne l’ID du modèle.
      5. Répétez les étapes 2.1.2.1-2.1.2.4 pour 7fd9.pdb.
   3. Ouvrez CCP-EM. Créez un nouveau projet nommé mGlu₅ et spécifiez le répertoire et le nom d’utilisateur du projet.
      1. Ouvrez Relion à partir des options du panneau de gauche.
         1. Allez dans l’onglet Création de masques .
         2. Fournissez l’une des demi-cartes pour EMD-31536 en entrée.
            REMARQUE : Relion accepte les cartes avec .mrc comme suffixe, et les cartes EMD ont le suffixe .map. Les fichiers de carte peuvent être ouverts dans ChimeraX pour examen et enregistrés au format .mrc.
         3. Dans l’onglet masque , indiquez la taille de pixel 0,89 Å et le seuil de binarisation initial 0,007.
         4. Exécutez le travail avec l’alias 31536 (ou tout autre nom facile à suivre).
         5. De même, créez un masque pour la demi-carte EMD - 31537.
      2. Ouvrez le programme Refmac Servalcat à partir des options du panneau de gauche de CCPEM.
         1. Indiquez le nom mGlu₅_agonist.
         2. Importez le fichier .pdb 7fd8_noligand_chainA comme décrit dans la section 2.1.2.4 du modèle. Indiquez l’emplacement des deux demi-cartes et du masque correspondant créé dans Relion.
         3. Spécifiez la résolution de 3,8 Å.
         4. Allez dans les paramètres de raffinement > Symétrie stricte et mentionnez C2 comme symétrie du groupe de points Relion.
         5. Démarrez le programme en appuyant sur le bouton de démarrage en haut.
   4. Une fois le travail terminé, ouvrez le résultat dans Coot (option disponible en haut dans la section des résultats). Cela affichera un diffmap.mtz dans Coot par défaut, où les couleurs rouge et vert indiquent respectivement les densités négatives et positives.
      1. Allez dans le gestionnaire d’affichage > propriétés de la carte de différence étiquetée DELFWT PHDELWT et modifiez le niveau de contour à 4.0 (valeur absolue).
         REMARQUE : Le choix du seuil dépend de la carte et de la résolution.
      2. Masquez la carte étiquetée FWT PHWT et la molécule étiquetée refined.pdb.
      3. Déplacez la carte à l’aide de la souris pour visualiser la densité positive (colorée en vert) et amenez la plus grosse goutte au centre.
      4. Allez dans Fichier > Obtenir le monomère, tapez QUS et appuyez sur Entrée.
      5. Allez à Calculer > modélisation > molécule Rigid Body Fit et double-cliquez sur le monomère QUS pour ajuster la molécule afin qu’elle s’adapte à la densité Fo-FC.
      6. Utilisez l’option de fusion de la molécule dans l’onglet Modifier pour ajouter la molécule QUS au fichier de coordonnées, refined.pdb.
      7. Répétez les étapes 2.1.4.3-2.1.4.6 pour ajuster le ligand avec le code monomère NAG et CHS dans la plus petite goutte dans le domaine extracellulaire et au sommet du domaine transmembranaire, respectivement.
      8. Enregistrez les coordonnées sous le nom refined_ligands.pdb.
         REMARQUE : La résolution du domaine transmembranaire (TM) est plus faible, et donc, elle n’est pas abordée ici.
2. Raffinement de la structure ligandée mGlu₅
   1. Ouvrez CCPEM et clonez la tâche d’affinement précédente (étape 2.1.3.2) et exécutez-la avec le fichier refined_ligands.pdb et la carte affinée (emd. 31536.mrc) en entrée, en utilisant les paramètres par défaut et la symétrie C2.
      REMARQUE : Si le programme ne reconnaît pas le ligand, les fichiers CIF doivent être fournis. Ces fichiers CIF peuvent être téléchargés à partir de la base de données pluggable ou générés à l’aide de divers programmes (voir l’étape 3.1.1 pour plus de détails).
3. Visualisation et génération de figures dans PyMOL
   1. Ouvrez le modèle refined_expanded.pdb à partir de la dernière tâche d’affinement Refmac dans PyMOL.
   2. Allez dans Fichier > Ouvrir et naviguez jusqu’au répertoire des tâches Refmac pour charger le fichier diffmap_normalised_fofc.mrc (carte des différences par rapport à la tâche Servalcat à l’étape 2.1.3.2).
      REMARQUE : Si les fichiers d’extension .mrc ne sont pas visibles lors de la navigation, changez le type de fichier en Tous les fichiers et parcourez.
   3. Sélectionnez les ligands à l’aide de l’affichage > séquence.
   4. Allez dans le bouton Actions et renommez la sélection en ligands.
   5. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée : isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      REMARQUE : La largeur du maillage peut être ajustée. Ici, une largeur de maille de 0,2 est utilisée, et elle est définie à l’aide de la commande suivante : set mesh_width=0.2.
   6. Faites un clic droit sur l’un des monomères et allez enchaîner > couleur pour spécifier la couleur de chaque monomère. Colorez le ligand et le maillage à l’aide de la dernière case étiquetée c dans les objets ligand et mesh_ligands. Le dimère du récepteur mGlu₅ est représenté dans une représentation de dessin animé, et les monomères sont colorés en sarcelle et en blé. Les ligands sont représentés en bâton et le maillage qui contourne les ligands est de couleur verte.
   7. Utilisez les actions > l’option orienter/centrer/zoom contre les objets et ajustez manuellement pour visualiser le maillage et clairement. Sélectionnez les résidus à proximité qui pourraient interagir avec le ligand, par exemple, Tyr64, Trp100 pour QUS, et si nécessaire, affichez leur chaîne latérale ou leur chaîne principale ou les deux sous forme de représentation bâton.
   8. Ray trace pour générer des images haute résolution et les enregistrer sous forme de fichier png.
      REMARQUE : Les étapes ci-dessus sont répétées pour la carte liée à l’antagoniste EMD-31537 et le fichier de coordonnées correspondant PDB-7fd9.

3. Modélisation de l’inhibiteur, de la désoxygalacto-nojirimycine (DGN) et des molécules de solvant dans une carte affinée à haute résolution de la β-galactosidase

1. Identification du ligand, DGN, à l’aide des demi-cartes de cryoEM
   1. Préparation d’un dictionnaire de ligands inconnus pour la modélisation [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      REMARQUE : Le fichier du dictionnaire Deoxygalacto-nojirimycin est inclus dans la bibliothèque de monomères CCP4 en tant que DGJ (ID de ligand à 3 lettres). Néanmoins, il est considéré ici comme un ligand nouveau et inconnu pour illustrer le processus de génération de fichiers de dictionnaire pour des ligands inconnus, DGN est utilisé comme code à 3 lettres.
      1. Ouvrez le résumé du composé désoxygalacto-nojirimycine (DGN) sur la page Web de PubChem et copiez la chaîne de sourires pour le composé désoxygalacto-nojirimycine.
      2. Ouvrez Phenix > ligands > eLBOW.
      3. Spécifiez la chaîne smiles en entrée.
      4. Spécifiez la méthode d’optimisation de la construction de ligands appropriée. Ici, une optimisation simple est utilisée.
      5. Collez la chaîne de sourires chimiques dans la section de définition du ligand.
      6. Fournissez un titre de poste, un préfixe de fichier de sortie et un ID de ligand de manière appropriée, puis appuyez sur exécuter.
         REMARQUE : La sortie du travail contient un fichier de coordonnées, DGN.pdb, et un fichier de dictionnaire, le fichier DGN.cif. Jligand²⁹ peut également être utilisé pour créer le fichier cif.
   2. Téléchargez le fichier de coordonnées de la β-galactosidase (6tsh.pdb) à partir de la PDB et supprimez les coordonnées des chaînes protéiques (B, C, D), du ligand, du DGN et d’autres molécules de solvant à l’aide d’un éditeur de texte ou de l’option de suppression de chaîne/zone dans Coot. Enregistrez le fichier de coordonnées sous le nom apo-betaGal_chainA.pdb.
      REMARQUE : ChimeraX ou Pymol peuvent également être utilisés pour éliminer la molécule de ligand/solvant.
   3. Téléchargez les demi-cartes (emd_10563_half_map_1.map et emd_10563_half_map_2.map) à partir des données supplémentaires de l’entrée EMD-10563 de l’EMDB.
   4. Ouvrez CCPEM et utilisez Relion pour créer le masque de la carte à un seuil de 0,01 (comme décrit aux étapes 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
   5. Exécutez Servalcat (dans la suite CCPEM comme décrit à l’étape 2) avec les demi-cartes obtenues à l’étape 3.1.3 et l’apo-model à l’étape 3.1.2 et la symétrie D2.
      REMARQUE : Le modèle doit être aligné sur l’une des demi-cartes ou des cartes complètes pour localiser la densité de ligand. Cela peut être fait en ajustant le modèle dans la carte à l’aide de ChimeraX, puis en enregistrant les coordonnées par rapport à la demi-carte. Dans cet exemple, les demi-cartes et la carte principale dans EMDB ont des tailles de boîte/grilles différentes, et le modèle doit être placé dans la demi-carte.
   6. Ouvrez Coot.
      1. Ouvrez le fichier DGN.cif pour le dictionnaire de ligands généré à l’étape 3.1.1 avec Phenix eLBOW. Pour ce faire, il suffit d’aller dans Fichier > Importer le dictionnaire CIF et de parcourir le répertoire des tâches eLBOW.
      2. Ouvrez les fichiers de coordonnées de protéine et de ligand, apo-betaGal_chainA.pdb à partir de l’étape 3.1.2 et DGN.pdb à partir de l’étape 3.1.6 respectivement.
      3. Ouvrez automatiquement le fichier diffmap.mtz à partir de la tâche Servalcat (étape 3.1.5) et visualisez la carte étiquetée DELFWT PHDELWT dans Coot. Contournez la carte à un seuil de ~ 4 valeur absolue.
         REMARQUE : Il est important de vérifier les statistiques de la carte en tapant l’en-tête map.mrc ou en utilisant les outils de Chimera. Toutes les informations nécessaires sur la taille des pixels, la taille de la boîte, la densité minimale, moyenne et maximale et l’écart efficace par rapport à la densité moyenne peuvent être obtenues. Il est crucial de vérifier la taille des pixels et la taille de la boîte des cartes cryoEM. La carte 3D représente le volume de la carte protéine-ligand dans une grille de voxels 3D. Dans chaque voxel, la valeur du potentiel électronique ou la probabilité de trouver l’électron à cet endroit est stockée. Lorsqu’un certain seuil est choisi, les voxels, qui ont une densité inférieure à la valeur spécifiée, sont mis à zéro. Cela permet de minimiser le bruit expérimental sur la carte et de mieux visualiser les caractéristiques de la carte⁴³. Ainsi, la carte doit être profilée à un seuil où les caractéristiques de la carte sont facilement visibles et où le bruit sur la carte est minimal.
      4. Allez dans Ligand > trouver des ligands. Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, sélectionnez ligand, la carte des différences et le modèle apo-betaGal_chainA.pdb. Laissez les autres options à leurs paramètres par défaut et cliquez sur Trouver des ligands pour lancer la recherche.
      5. Une liste des meilleurs résultats indiquant la densité potentielle des ligands est affichée avec une copie placée dans chacune des densités. Vérifiez manuellement tous les coups où le ligand a été placé. Gardez les résultats les plus probables et supprimez les ambigus.
         REMARQUE : La différence de densité de la carte à un seuil élevé suggère clairement la présence du ligand dans le site actif.
2. Modélisation du ligand DGN et des molécules de solvant
   1. Effectuez un raffinement réel de l’espace dans Coot pour ajuster le ligand (DGN.pdb) dans la carte de densité différentielle, puis fusionnez les coordonnées du ligand avec le fichier apo-betaGal_chainA.pdb et enregistrez-le sous le nom betaGal_chainA+ligand.pdb.
      REMARQUE : Les ligands qui ont été placés dans des régions d’autres chaînes peuvent être supprimés et ne sont pas fusionnés lors de l’enregistrement du fichier de coordonnées fusionné. Les ligands d’autres chaînes peuvent être générés par des ligands NCS comme le montre l’exemple 1, étape 1.2.8, ou dans Refmac/Servalcat en utilisant l’expansion de symétrie.
   2. Exécutez un autre job Servalcat comme ci-dessus (étape 3.1.5) avec betaGal_chainA+ligand.pdb comme modèle d’entrée et les demi-cartes (à partir de l’étape 3.1.3) avec une symétrie D2.
   3. La différence de densité (d’après le travail Servalcat à l’étape 3.2.2) entourant le ligand modélisé suggère la présence des molécules de solvant se coordonnant avec la molécule de ligand. La densité centrale proche du ligand semble être trop grande pour les molécules d’eau.
   4. Sur la base de données biochimiques et structurales antérieures indiquant la présence de Mg²⁺ à cette position, l’ion Mg²⁺ est modélisé ici en cliquant sur l’option placer l’atome et en spécifiant l’atome comme MG.
   5. Modélisez les molécules d’eau dans la différence de densité dans le site actif qui indiquent la présence d’une molécule de solvant en cliquant sur l’atome placé au pointeur et en sélectionnant l’eau.
      REMARQUE : Coot a également la possibilité de prélever automatiquement les molécules d’eau. Ici, comme l’accent est mis uniquement sur le site actif, les molécules d’eau sont ajoutées manuellement.
   6. Fusionnez les coordonnées de Mg²⁺ et de water avec le fichier betaGal+ligand.pdb et enregistrez-le sous le nom betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
   7. Avec le fichier betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb, effectuez le raffinement Refmac dans Servalcat avec une symétrie D2.
      REMARQUE : La carte de différence de sortie de ce travail peut servir de moyen de valider si le ligand a été modélisé avec précision, car la carte de différence doit montrer une densité résiduelle positive ou négative minimale.
3. Visualisation et génération de figures avec PyMOL
   REMARQUE : Les étapes décrites ci-dessous fournissent quelques exemples de fabrication de figures à l’aide de modèles et de cartes qui peuvent être utilisés pour illustrer la présence de ligands et de solvants.
   1. Ouvrez le fichier refined_expanded.pdb de la dernière tâche Servalcat (étape 3.2.6) avec le ligand et le solvant modélisés.
   2. Sélectionnez différentes chaînes séparément pour les colorer en magenta, jaune, vert et sarcelle, comme décrit dans l’exemple 2.
   3. Allez dans Afficher > séquence, effectuez des sélections distinctes pour les molécules d’eau, le magnésium et le DGN, et renommez les objets en eau, MG et DGN, respectivement.
   4. Affichez les molécules de MG et d’eau sous forme de sphères en sélectionnant les objets, en cliquant avec le bouton droit de la souris et en affichant > sphère. De même, affichez le ligand en forme de bâton et coloriez les ligands et les solvants de manière appropriée. Dans ce cas, le ligand a été coloré en jaune par un hétéroatome, l’ion magnésium est coloré en violet et les molécules d’eau sont colorées en rouge.
   5. Sélectionnez DGN, MG et molécules d’eau. Faites un clic droit et sélectionnez les actions > copier pour l’objet et le nommer en tant que ligands.
   6. Ouvrez le fichier diffmap_normalised_fo.mrc à partir de la tâche Servalcat à l’étape 3.2.6 et renommez-le ligand_fo.mrc. Tapez la commande suivante : isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      REMARQUE : L’option de sculpture de 2 Å est appliquée autour des atomes, et en fonction de la résolution et de la qualité des cartes, des valeurs de 3 à 5 peuvent être utilisées. De plus, lors de l’ouverture des cartes cryoEM dans PyMOL, il est conseillé de normalize_ccp4_maps désactiver .
   7. Utilisez les actions > options d’orientation/zoom et ajustez manuellement pour visualiser les ligands et les résidus en interaction à proximité (le cas échéant), comme indiqué à l’étape 2.3.7.
   8. Tracez ces scènes pour enregistrer des images haute résolution à l’aide de la commande ray 3600, 3600.
   9. Enregistrez la scène en tant que fichier .png.
      REMARQUE : Les étapes suivantes sont facultatives et décrivent le processus de visualisation (1) de la différence de densité (Fo-Fc) pour le ligand non modélisé, DGN, (2) de la masse volumique (Fo) du ligand modélisé, DGN ainsi que de la différence de densité (Fo-Fc) pour les solvants non modélisés et enfin pour (3) la masse volumique (Fo) du ligand modélisé, DGN et des molécules de solvant dans le site actif.
   10. Pour démontrer la présence du ligand, du DGN et des molécules de solvant environnantes à l’aide de la carte de différences, ouvrez diffmap_normalised_fofc.mrc à partir de la tâche Servalcat à l’étape 3.1.5. Renommez le fichier de mappage unliganded_fofc.mrc en cliquant sur actions > renommer en regard de l’objet de mappage. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande : isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
   11. Pour démontrer la densité du ligand modélisé, DGN, et la densité de solvant non modélisée environnante, ouvrez le fichier diffmap_normalised_fo.mrc ainsi que le fichier diffmap_normalised_fofc.mrc à partir de la tâche servalcat à l’étape 3.2.2. Renommez le diffmap_normalised_fo.mrc en DGN_fo et le diffmap_normalised_fofc.mrc en DGN_unmodelled_solvents_fofc.
   12. Sélectionnez MG et eau dans Affichage > séquence, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez les actions > copier sur l’objet et nommez-les comme solvants.
   13. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande : isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2 ; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvants, level=6, carve=2.
       REMARQUE : Le mesh_DGN_fo indiquera la densité du ligand et le mesh_solvent_fofc montrera la densité omise pour le MG et l’eau.
   14. Enfin, pour visualiser les ligands modélisés ainsi que les molécules de solvant environnantes dans le site actif, ouvrez le fichier diffmap_normalised_fo.mrc à partir du job Servalcat à l’étape 3.2.6 et renommez-le en ligand_fo.mrc.
   15. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande : isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
       REMARQUE : Ici, nous avons utilisé diffmap_normalised_fo.mrc, mais la carte finale affinée peut être utilisée pour montrer la densité des ligands et des résidus environnants. Il est recommandé de mentionner le type de carte utilisé, les valeurs de netteté du facteur B dans la légende de la figure.
   16. La largeur du maillage et la taille de la sphère peuvent être définies en tapant les commandes suivantes : set mesh_width=0.2 et set sphere_scale=0.25 pour réduire la taille de la sphère.
   17. Colorez le maillage fo en bleu et le maillage fofc en vert.
   18. Utilisez les actions > options d’orientation/zoom et ajustez manuellement pour visualiser les ligands et les résidus en interaction à proximité (le cas échéant), comme indiqué à l’étape 2.3.7.
   19. Tracez ces scènes pour enregistrer des images haute résolution à l’aide de la commande ray 3600, 3600.
   20. Enregistrez les scènes individuelles sous forme de fichiers .png.

4. Effet de la résolution sur la modélisation des ligands dans la β-galactosidase

1. Ouvrez Terminal et allez dans le répertoire contenant les deux demi-cartes.
2. Ouvrez les deux demi-cartes (étape 3.1.3) au format .map dans ChimeraX, visualisez-les et enregistrez-les sous emd10563_half1_1_unfil.mrc et emd10563_half2_1_unfil.mrc.
3. Le masque créé à l’étape 3.1.4 peut être utilisé comme entrée.
4. Exécutez une tâche de post-traitement dans Relion à l’aide des demi-cartes et des masques des étapes 4.2 et 4.3, avec les paramètres par défaut.
5. Répétez l’étape 4.4, maintenant avec un Skip FSC-weighing activé et en spécifiant un filtre passe-bas ad-hoc de 3 Å.
6. Répétez l’étape 4.4 avec un filtre passe-bas ad-hoc de 3,5 Å.
7. Ouvrez les cartes (postprocess.mrc) des étapes 4.4 à 4.6, filtrez à différentes résolutions et le fichier de coordonnées du modèle, 6tsh.pdb (aligné sur les demi-cartes de ChimeraX) de l’étape 3.1.2 dans PyMOL. Renommez les différentes cartes 3.0, 3.5 et 2.3 en fonction de leurs résolutions.
   REMARQUE : On peut confirmer le filtrage passe-bas des cartes en les visualisant dans ChimeraX ou Coot.
8. Visualisez l’effet de la résolution sur la densité des molécules de ligand et de solvant en créant un maillage de 2 Å autour des molécules de ligand et de solvant à un seuil de 6σ comme décrit à l’étape 3.3.6 avec des cartes filtrées à différentes résolutions.

Representative Results

Exemple 1
L’enzyme énolase de M. tuberculosis catalyse l’avant-dernière étape de la glycolyse et convertit le 2-phosphoglycérate en phosphoénolpyruvate (PEP), qui est un intermédiaire essentiel pour plusieurs voies métaboliques^44,45. Les données CryoEM pour les échantillons d’apo-énolase et d’énolase liée à la PEP ont été collectées à la même taille de pixel de 1,07 Å, et le traitement d’image a été effectué avec Relion 3.1^46,47. Les structures apo-énolase et PEP-énolase ont été déterminées à 3,1 Å et 3,2 Å, respectivement⁴⁸. Les cartes et les modèles ont été déposés dans EMDB et PDB^49,50 (EMD-30988, EMD-30989, PDB-7e4x et PDB-7e51). La carte cryoEM de l’enzyme montre qu’il s’agit d’un octamère dans la solution (Figure 1A). Afin d’identifier la densité du ligand dans la carte PEP-énolase, les cartes non aiguisées de l’apoenzyme et de l’enzyme liée à la PEP ont été sélectionnées, et une carte de différence a été calculée dans ChimeraX, en soustrayant la carte PEP-énolase de la carte apoenzyme. Une densité distincte (verte) à un seuil élevé a été observée, ce qui suggère la présence du ligand (Figure 1B). La modélisation de la chaîne protéique dans la carte non affinée a clairement indiqué que la densité supplémentaire est présente dans le site actif de la protéine (Figure 1C). Le ligand, PEP, a ensuite été modélisé dans la carte affinée du facteur B à l’aide de Coot, et le modèle protéine+ligand a été affiné dans l’espace réel avec Phenix. Deux ions Mg²⁺ ont été modélisés dans la densité observée au voisinage du ligand (Figure 1D). Le ligand, PEP, adopte une orientation similaire à celle observée dans d’autres homologues de l’énolase, et plusieurs résidus de site actif, tels que Lys-386, Arg-364, forment des interactions de liaison hydrogène avec le ligand PEP. Les ions Mg²⁺ forment des liaisons de coordination métallique avec l’Asp-241, le Glu-283, l’Asp-310 et le phosphate de PEP (Figure 1D).

Exemple 2
En l’absence d’une structure apo-protéique disponible ou si la protéine subit un changement conformationnel important, il n’est pas possible de calculer les cartes de différences comme décrit ci-dessus. En 2021, le groupe de Garib Murshudov au Laboratoire de biologie moléculaire de Cambridge a présenté Servalcat²², qui met en œuvre un flux de travail de raffinement à l’aide de Refmac et calcule également une carte de différence Fo-Fc après affinage. Une différence de densité Fo-Fc positive suggère la présence de molécules/ligands qui n’ont pas été inclus dans le modèle lors du raffinage, essentiellement une carte omise. Cependant, il est recommandé d’évaluer d’abord l’ajustement du modèle à la carte en général, puis d’évaluer la carte de densité de différence.

Pour illustrer l’utilisation de Servalcat/Refmac, mGlu₅, un récepteur couplé à la protéine G dimérique qui se lie au neurotransmetteur L-Glutamate, a été choisi. Lors de la liaison de l’agoniste, le L-quisqualate, le domaine extracellulaire se réoriente, ce qui déclenche la rotation des 7TM, les rapprochant pour stabiliser l’état activé. Ainsi, il y a un grand changement de conformation observé entre l’apo/antagoniste vs. états liés aux agonistes⁵¹ (Figure 2A et Figure 2E). Les deux demi-cartes pour les complexes liés à l’agoniste (EMD-31536) et à l’antagoniste (EMD-31537) ont été obtenues à partir d’EMDB, et les cartes cryoEM montrent une résolution variée sur la molécule et un domaine extracellulaire mieux résolu. Par la suite, ceux-ci ont été utilisés comme intrants dans Servalcat avec l’apo-protéine comme modèle pour calculer la différence ou la carte Fo-Fc pour chaque ensemble de données. Cette carte a montré distinctement la présence de diverses molécules de ligand (non-protéines). La résolution estimée par FSC (corrélation de la coquille de Fourier) pour les complexes liés à l’agoniste et à l’antagoniste était de 3,8 Å et 4,0 Å, respectivement. Dans le cas de l’agoniste mGlu₅, la carte de différence Fo-Fc de Servalcat a montré la présence de l’agoniste (L-quisqualate) (Figure 2B) et de la N-acétylglucosamine (NAG) (Figure 2C) dans l’ECD du récepteur (en raison de la résolution plus faible de l’ATM, ici nous nous concentrons uniquement sur l’ECD et le haut de l’ATM). Les résidus protéiques, y compris Tyr-64, Trp-100, Ser-151 et Thr-175, interagissent avec l’agoniste. La densité près du résidu Asn-210 suggère la présence de N-acétyl glucosamine (figure 2C). Une densité compatible avec l’hémisuccinate de cholestryle, qui a été ajouté lors de la purification de mGlu_5, a été observée près du sommet de l’hélice transmembranaire 1 (figure 2D). Comme la résolution est modérée et que le ligand, le L-quisqualate, peut être placé dans différentes orientations, la structure préalable du domaine extracellulaire avec le ligand (PDB-6N50) a été utilisée comme guide pour modéliser le ligand. La liaison de l’antagoniste stabilise l’état ouvert ou au repos du récepteur (Figure 2E). Une densité compatible avec l’antagoniste LY341495 a été observée à la charnière du lobe I et du lobe II du domaine du piège à mouches de Vénus dans l’ECD. L’antagoniste interagit avec des résidus similaires à ceux de l’agoniste. L’interaction d’empilement entre le Tyr-223 dans le lobe II et l’antagoniste stabilise le récepteur dans un état ouvert (Figure 2F). Semblable à la structure de l’agoniste, la glycosylation ou la présence d’un groupement N-acétylglucosamine a été observée près de l’Asn-210 (figure 2G).

Exemple 3
Le troisième exemple élucide le protocole permettant de modéliser des ligands et des molécules de solvant de la taille d’un fragment ou d’une petite taille dans des cartes CryoEM à haute résolution. La découverte de médicaments basée sur les fragments (FBDD) s’est imposée comme une méthode puissante et innovante dans le développement de nouvelles thérapies ciblées dans divers domaines pathologiques, ce qui en fait une voie prometteuse dans la R&D pharmaceutique^52,53. La FBDD commence par le criblage et la sélection minutieuse de petits fragments de molécules hautement solubles et de faible poids moléculaire qui se lient à des protéines cibles spécifiques ou à des biomolécules d’intérêt. La détermination des structures de ces complexes protéine-fragment révèle le mode de liaison de ces fragments, qui sert de guide pour la conception de molécules médicamenteuses plus grandes et plus complexes avec une affinité et une spécificité croissantes envers la protéine cible⁵⁴. Cependant, cette méthode exige une densité de ligand à haute résolution pour déterminer avec précision la pose et placer correctement les groupes fonctionnels du ligand¹⁵.

La β-galactosidase, l’une des premières structures à haute résolution à être déterminée à partir des progrès de la technologie cryoEM, est une enzyme homotétramère de 450 kDa bien étudiée qui catalyse l’hydrolyse du lactose en glucose et en galactose⁵⁵. Pour mettre en évidence l’utilisation de la cryoEM dans le FBDD, Astex, au Royaume-Uni, a déterminé la structure de la β-galactosidase avec un inhibiteur de la taille d’un fragment, la désoxygalacto-nojirimycine (DGN) liée au site actif (EMDB-10563, PDB :6tsh)⁵⁶. Cet ensemble de données est utilisé pour illustrer le protocole permettant de modéliser les ligands et les solvants sans ambiguïté dans des cartes à haute résolution. Pour mettre en évidence l’effet de la résolution sur la modélisation et la visualisation des ligands, les cartes ont été filtrées à 3,0 Å et 3,5 Å lors de l’étape de post-traitement dans Relion. Cela met en évidence la qualité de la densité de la carte à différentes résolutions et souligne la nécessité d’une résolution plus élevée pour la modélisation des ligands et des solvants.

L’enzyme est un tétramère avec une symétrie D2 en solution (Figure 3A). La carte des différences (entre la carte et le modèle), telle que calculée par Servalcat, suggère la présence de DGN et de plusieurs molécules de solvant dans le site actif de l’enzyme (Figure 3B). À une résolution estimée de 2,3 Å, la densité a montré des caractéristiques à haute résolution, ce qui a aidé à la modélisation précise de l’inhibiteur dans le site actif de la protéine. Des interactions entre DGN et Tyr-503 et His-540 ont été observées (Figure 3C). La différence de densité suggère également la présence de molécules de solvant qui interagissent avec le DGN ainsi que les résidus protéiques. Mg²⁺ et plusieurs molécules d’eau ont été modélisés dans la masse volumique (Figure 3D). Des liaisons de coordination métallique entre le Mg²⁺ et le Glu-416, le Glu-461 et plusieurs molécules d’eau sont observées (Figure 3D). On a observé que le Mg²⁺ interagissait avec le DGN par l’intermédiaire d’une molécule d’eau.

À une résolution inférieure de 3,5 Å et 3,0 Å, la densité du ligand ressemble à une goutte et ne dispose pas des caractéristiques à haute résolution cruciales pour une modélisation précise du ligand (Figure 4A,B). La densité des molécules d’eau était presque inexistante à ces résolutions. En résumé, avec une résolution croissante, notamment supérieure à 3,0 Å, la densité a permis de modéliser un plus grand nombre de molécules d’eau (Figure 4C,D). Le positionnement correct du centre chiral du ligand est devenu réalisable à ~2,3 Å (Figure 4C,D) en raison de la présence de caractéristiques distinctes dans la carte qui ont guidé le placement ainsi que la modélisation des molécules d’eau et de Mg²⁺. En comparaison, la densité du Mg²⁺ est demeurée perceptible dans toute la gamme de résolution (figure 4A-C).

Figure 1 : Modélisation du ligand phosphoénolpyruvate dans l’énolase de M. tuberculosis (A) montre la carte aiguisée du facteur B de l’enzyme énolase liée à la PEP. La carte suggère que l’énolase est octamère en solution, et chaque monomère de la carte est coloré différemment. (B) affiche une carte cryoEM non affûtée de l’enzyme apo-Enolase en gris avec la carte de différence (entre les cartes liées à la PEP et les cartes non accentuées à l’apo-énolase) superposée en vert, suggérant la présence du ligand, PEP. Il s’agit d’une carte de démonstration pour montrer la présence de ligands. (C) affiche l’ajustement du modèle énolase dans la carte cryoEM non affûtée, mettant en évidence la position de la différence de densité par rapport à la protéine. Le modèle de protéine est montré dans une représentation de dessin animé et coloré dans Chainbow. Cette figure montre que la densité supplémentaire (en vert) est présente dans le site actif de chaque monomère. (D) montre le ligand, PEP, enfermé dans la carte aiguisée du facteur B, colorée en bleu. De plus, la densité de deux ions Mg²⁺ a également été observée, ce qui forme des liaisons de coordination métallique avec plusieurs résidus de sites actifs, notamment Ser-42, Asp 241, Glu-283, Asp-310 et des atomes de ligand. Le ligand effectue des interactions de liaisons hydrogène avec Lys-386, Lys-335 et Arg-364. Les résidus protéiques sont représentés en bâtonnet, et les ions Mg²⁺ sont représentés par des sphères violettes. Les figures en panneaux (A-D) ont été générées avec Pymol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Identification, modélisation et visualisation de divers ligands dans le récepteur mGlu₅. Les cartes Fo-Fc omettent ont été obtenues à l’aide de Servalcat. (A) montre la structure dimère du récepteur mGlu₅ (PDB-7fd8) dans la représentation de dessin animé, chaque monomère étant coloré en sarcelle et en blé, respectivement, et lié à l’agoniste L-quisqualate. Tous les ligands qui ont été identifiés dans le domaine extracellulaire et au sommet du domaine transmembranaire du récepteur sont enfermés dans la carte d’omission Fo-Fc, colorée en vert et profilée à 6σ. (B) met en évidence l’ajustement de l’agoniste, le L-quisqualate, enfermé dans la carte des différences. Le L-quisqualate interagit avec plusieurs résidus de mGlu₅, notamment Tyr-64, Trp-100, Ser-151, Thr-175 et Gly-280. Les interactions de liaison H sont représentées par des tirets rouges. En (C), une densité supplémentaire est évidente près de l’Asn-210, qui est présent dans le domaine extracellulaire du récepteur, et la molécule de N-acétylglucosamine (NAG) a été modélisée dans cette densité. Pour plus de clarté, le NAG n’est pas lié à l’Asn dans le chiffre actuel. (D) montre la différence de densité de l’hémisuccinate de cholestérol (SHC) en vert près de la surface exposée aux lipides du récepteur. La molécule CHS, représentée dans les bâtonnets, a été modélisée dans cette densité. (E) montre la structure du récepteur mGlu₅ (PDB-7fd9) liée à l’antagoniste LY341495 dans la représentation de dessins animés. Dans (F), une densité supplémentaire dans la carte de différence Fo-Fc située à la charnière entre le lobe I et le lobe II du domaine extracellulaire indique la présence de l’antagoniste. Les résidus clés (Tyr-64, Trp-100, Ser-152, Ser-173, Thr-175 et Tyr-223) autour de l’antagoniste sont représentés en bâtonnets, et les interactions potentielles des liaisons hydrogène avec l’antagoniste sont indiquées en tirets rouges. (G) montre la différence de densité suggérant la présence d’une molécule de NAG près de l’Asn-210 dans la structure liée à l’antagoniste (notez que le NAG n’est pas lié à l’Asn pour plus de clarté). Les chiffres ont été générés avec Pymol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Identification, modélisation et raffinement d’une petite molécule inhibitrice et solvant dans la carte haute résolution de la β-galactosidase (EMD-10563). (A) montre le modèle de β-galactosidase résolu à 2,3 Å (PDB : 6tsh) dans une représentation de dessin animé, où chaque monomère est coloré distinctement. La boîte grise met en évidence le site de liaison du ligand. (B) affiche la différence de densité Fo-Fc (de Servalcat) en maille verte dans le site actif de l’enzyme. La différence de densité suggère la présence de l’inhibiteur (DGN) et de plusieurs molécules de solvant dans le site actif. (C) démontre que guidé par la carte Fo-Fc, l’inhibiteur désoxygalacto-nojirimycine (DGN) est modélisé dans le site actif. Ce ligand modélisé est représenté sous forme de bâton et enfermé dans la densité Fo (par Servalcat), qui est colorée en blue_mesh. Des interactions de liaisons hydrogène entre DGN et plusieurs résidus protéiques, dont Tyr-503 et His-540, sont observées. La différence supplémentaire de densité Fo-Fc autour du ligand (vert) est indicative des molécules de solvant. (D) La carte montre que plusieurs molécules de solvant, y compris l’eau et le Mg²⁺, représentées par des sphères rouges et violettes, respectivement, sont modélisées dans le site actif après s’être assurées que chaque molécule de solvant est liée à des résidus de protéines (Glu-416, His-418 et Glu-461) ou de ligands. Les molécules d’eau et le Mg²⁺ sont enfermés dans la densité Fo (maille bleue). On voit que le Mg²⁺ interagit avec le ligand, DGN, via une molécule d’eau. La carte Fo-Fc (maille verte) en panneaux (B,C) est profilée à 6σ, tandis que la densité Fo - maille bleue en C et D (issue du raffinement Servalcat après modélisation) est profilée à 3σ. Les figures en panneaux (A-D) ont été générées avec Pymol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effet de la résolution sur la modélisation des ligands dans la β-galactosidase. Les demi-cartes de l’EMD-10563 ont été utilisées comme entrée dans l’étape de post-traitement de Relion, et les cartes de post-traitement combinées ont été filtrées à des résolutions de 2,3 Å, 3,0 Å et 3,5 Å avec différents facteurs B. La carte affichée dans tous les panneaux est profilée à 6σ. Pour plus de clarté, seul le squelette protéique est représenté sans chaînes latérales, ligand ou molécules de solvant dans les panneaux A, B et C. (A) La carte est filtrée à 3,5 Å et le site actif de la β-galactosidase est indiqué. Une goutte ressemblant au ligand, DGN, est observée à cette résolution, accompagnée de quelques petites taches à proximité. La modélisation du ligand dans la bonne orientation s’avère difficile en raison de l’absence de caractéristiques distinctes sur la carte. (B) La carte filtrée à une résolution de 3,0 Å est affichée. Ici, le blob de ligand devient légèrement plus défini mais manque encore de caractéristiques en général. Quelques autres petites taches suggérant des molécules de solvant sont également observées. (C) La carte filtrée à une résolution de 2,3 Å révèle la densité du ligand avec des caractéristiques distinctes, révélant notamment la conformation en chaise de l’iminosucre. Un nombre important de petites taches correspondant à des molécules d’eau sont observées à cette résolution. L’estimation/l’affûtage automatique du facteur B dans le post-traitement Relion donne une valeur de -18 Ų pour les cartes filtrées à 3 Å et 3,5 Å, tandis que la valeur est de -52 Ų pour la carte filtrée à 2,3 Å. Différentes nettetés du facteur B des cartes EM peuvent également être effectuées avec Coot et utiles dans la construction de modèles. (D) Le panneau illustre que le ligand DGN (représentation en bâton), Mg²⁺ et les molécules d’eau (sous forme de sphères) sont modélisés dans le site actif et la carte aiguisée à 2,3 Å, représentée par un maillage bleu entourant ces atomes. Les figures en panneaux (A-D) ont été générées avec Pymol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les améliorations apportées au matériel et aux logiciels des microscopes ont entraîné une augmentation du nombre de structures cryoEM au cours des dernières années. Bien que la résolution la plus élevée atteinte à l’heure actuelle dans la cryoEM à particule unique soit de 1,2 Å 57,58,59, la majorité des structures sont déterminées autour de la résolution de 3-4 Å. La modélisation de ligands dans des cartes à moyenne et basse résolution peut être délicate et souvent pleine d’ambiguïté. Compte tenu de l’utilisation généralisée de la cryoEM dans le monde universitaire et l’industrie pharmaceutique pour la recherche translationnelle et la découverte de médicaments, il est essentiel de s’assurer que les ligands sont modélisés correctement et sans ambiguïté. Ainsi, il est prudent de quantifier la résolvabilité des atomes de ligand en calculant les Q-scores⁶⁰, qui sont maintenant disponibles dans l’EMDB en tant que métrique pour évaluer la qualité des cartes et l’ajustement du modèle ainsi que dans Chimera.

Dans le premier exemple, ChimeraX a été utilisé pour calculer la carte de différence dans l’espace réel entre l’apo et les cartes liées au ligand dans l’enzyme énolase de M. tuberculosis. La densité supplémentaire à un seuil élevé suggère la présence du ligand, le phosphoénolpyruvate, dans le site actif et du Mg²⁺ lié au ligand. Il est important de noter que, dans ce cas, la carte est de résolution moyenne (3,2 Å) et que les molécules d’eau ne peuvent pas être modélisées avec certitude (Figure 1). La limitation associée à cette méthode est qu’elle ne peut être appliquée que lorsque la liaison du ligand n’induit pas de changements conformationnels significatifs dans la protéine. La normalisation de la carte n’a pas été effectuée dans ce cas, car les ensembles de données apo et liés au ligand ont été acquis à la même taille de pixel et traités avec des paramètres identiques dans Relion. Cependant, il convient de noter que lorsque l’on compare des cartes générées par différents programmes de reconstruction, tels que Relion^46,47 et CryoSparc⁶¹, ou avec une qualité différente, la normalisation des cartes devient essentielle avant que des comparaisons significatives puissent être effectuées.

L’exemple suivant est mGlu₅, qui subit une grande réorganisation moléculaire lors de la liaison de l’agoniste, comme en témoignent les structures cryoEM^51,62 (Figure 2). Dans ce scénario, il n’est pas possible de calculer une simple carte de différence entre les récepteurs non liés (apo) et liés au ligand en raison de différences substantielles entre les cartes. Ici, Servalcat, qui utilise des demi-cartes non nettes et non pondérées comme données d’entrée pour l’affinement dans l’espace réciproque et calcule ensuite une carte de différence entre l’application expérimentale et la carte dérivée du modèle, a été utilisé. À un seuil élevé, on peut visualiser les différences et servir de guide pour la correction et l’amélioration du modèle. Plusieurs taches non modélisées dans le domaine extracellulaire et près du domaine transmembranaire de mGlu₅ ont été observées et utilisées comme guide pour modéliser les ligands (Figure 2).

Le troisième exemple montre comment la résolution (2,3 Å) joue un rôle crucial dans l’interprétation cartographique et la modélisation d’un inhibiteur de la taille d’un fragment dans la β-galactosidase. Ici, le défi était d’identifier un très petit ligand (<200 Da) dans la carte des différences de Servalcat au milieu du bruit inhérent aux données et de le modéliser avec précision. En plus de la haute résolution globale déterminée à l’aide de la corrélation de la coquille de Fourier (FSC), la résolution locale spécifique au ligand était également suffisamment élevée pour assurer un placement précis des centres chiraux des ligands (Figure 3). La densité des molécules de solvant a été observée dans la carte des différences tout au long de l’enzyme et en particulier autour du ligand. L’effet de la résolution sur la modélisation des ligands et des atomes de solvant a également été démontré (Figure 4). Il est important de faire preuve de prudence lors de la modélisation de molécules d’eau ou de solvant, car, à l’occasion, le bruit à un seuil bas peut ressembler à celui de l’eau ou des molécules de solvant, ce qui peut entraîner des erreurs d’interprétation.

Une autre considération importante est que les cartes cryoEM seules peuvent ne pas être suffisantes pour identifier avec précision un ion métallique à elles seules. Des méthodes biophysiques supplémentaires telles que la structure fine d’absorption étendue des rayons X (EXAFS) ou la spectroscopie à rayons X à dispersion d’énergie (EDX) sont souvent nécessaires pour confirmer la présence et l’identité de l’ion métallique. Dans les enzymes énolase et β-galactosidase, le Mg²⁺ a été modélisé en raison de la richesse des informations déjà disponibles sur ces protéines, confirmant l’identité de l’ion métallique. De plus, la coordination des ions métalliques dans ces cas, illustrée par la géométrie octaédrique classique et les distances de coordination presque idéales de Mg²⁺, a fourni une preuve substantielle de leur identité.

En général, quelques considérations importantes doivent être prises en compte lors de la modélisation des ligands dans les cartes cryoEM. Pour commencer, il est important de choisir la bonne carte pour l’identification et la modélisation des ligands. Dans tous les cas, il est conseillé d’utiliser une carte ou une demi-carte non accentuée et non pondérée sur une carte accentuée et pondérée pour visualiser la densité des ligands, car l’accentuation et la pondération pourraient entraîner des régions sous-accentuées ou sur-accentuées (bruit dû à la terminaison de série) dans la carte. Cela peut entraîner une densité de ligand sous-optimale, et l’utilisation de différents facteurs B peut être utilisée pour évaluer la densité lors de la construction du modèle en foulque. Bien qu’il y ait un risque à utiliser la carte affinée pour identifier les ligands dans une carte cryoEM, la carte non affinée peut ne pas montrer tous les détails de la densité des ligands, mais peut être utilisée à des fins de démonstration, comme le montrent les figures 1B et C.

La pose du ligand modélisé doit être validée, en particulier dans les cas où les données sont faibles. Comme le montre ici pour mGlu₅, la résolution locale varie sur la carte cryoEM, et la modélisation impartiale du ligand peut être difficile. Servalcat peut être utilisé comme un outil précieux pour détecter les inexactitudes potentielles dans la modélisation des protéines et des ligands²².

L’hétérogénéité de composition peut être présente dans un complexe protéine-ligand où seule une population spécifique peut avoir le ligand présent (si le ligand est de faible poids moléculaire, l’étape de classification peut ne pas supprimer l’hétérogénéité). Néanmoins, il est important d’effectuer la classification 3D⁶³ étapes de manière itérative pendant le traitement de l’image avant la modélisation du ligand et de vérifier si la densité du ligand s’améliore. Si plusieurs copies de la protéine sont présentes, il faut faire preuve de prudence lors de l’application de la symétrie sur la carte lors de la génération et de l’affinement initiaux du modèle, car cela peut permettre de calculer la densité des ligands dans toutes les molécules liées à la symétrie. La symétrie ne doit être imposée qu’après que la carte a été minutieusement inspectée pour confirmer la présence de densité de ligands dans toutes les chaînes protéiques.

Selon l’état (cristal ou solution) et l’emplacement (enterré ou surface), les atomes peuvent être dynamiques, et dans le raffinement du modèle, on parle de paramètre de déplacement atomique (ADP). En plus de la carte des différences, qui fournit des indices visuels sur d’éventuelles inexactitudes dans le modèle, les valeurs ADP peuvent être utilisées pour évaluer la précision des ligands après raffinement 64,65,66,67. En règle générale, le ligand doit avoir des valeurs ADP similaires à celles des résidus environnants, c’est-à-dire s’ils sont liés de manière stable et modélisés avec précision. Cependant, les ligands à la périphérie ou les atomes d’un ligand (comme les lipides) qui sont éloignés des macromolécules peuvent avoir des valeurs ADP plus élevées. En plus d’affiner les coordonnées, Refmac^33,34 et Phenix permettent tous deux d’affiner les valeurs ADP ^28,68. Dans Refmac, l’approximation de Mott-Bethe est utilisée pour calculer le facteur de diffusion des électrons des atomes individuels lors du calcul de la carte. Dans la version récente de Phenix, le raffinement individuel du facteur B, similaire à la cristallographie, a été introduit pour tenir compte du désordre atomique. Très souvent, dans les modèles affinés dérivés de cryoEM, une large gamme de valeurs ADP est observée (parfois des valeurs proches de zéro), et même le Q-score utilisé dans EMDB pour évaluer l’ajustement du modèle avec la carte dépend de la carte primaire déposée et de la nature de l’affûtage du facteur B⁶⁰. Dans la construction de modèles cryoEM, plusieurs cartes sont souvent utilisées, et donc, les cartes utilisées dans la modélisation et le raffinement doivent clairement être mentionnées dans les méthodes, car en raison de la résolution anisotrope dans de nombreuses macromolécules, une seule carte peut ne pas être suffisante pour expliquer tous les détails. 

Dans la modélisation des ligands dans les macromolécules, l’une des principales limites des cartes cryoEM (comme en cristallographie) est que si le site de liaison du ligand est de faible résolution ou si le ligand lié est dynamique, il peut s’avérer difficile de déterminer la conformation correcte. De plus, la plupart des structures cryoEM ont des résolutions inférieures à 3 Å, et la représentation des molécules d’eau dans les cartes est limitée, ce qui rend difficile l’évaluation du rôle de l’hydratation dans la liaison d’un ligand ou d’un médicament (comme le montrent ici les exemples de l’énolase et du mGluR). Des méthodes de calcul peuvent être utilisées en combinaison avec des données cryoEM pour remédier à ces limites⁶⁹. Contrairement à la cristallographie, seul le modèle est affiné, pas la carte. À l’heure actuelle, la seule méthode pour indiquer la présence d’un ligand ou assurer une modélisation précise consiste à générer des cartes omises (à l’aide d’outils comme Servalcat). Ainsi, il existe un certain nombre d’outils pour aider les chercheurs à construire et à évaluer le modèle, mais il existe plusieurs domaines dans l’affinement du modèle où l’on peut s’attendre à de nouvelles approches ou à des modifications des approches actuelles dans un avenir proche.

Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur les approches actuelles de modélisation des ligands, qui comprennent l’inspection manuelle de la densité du ligand, la génération du fichier de géométrie du ligand, suivie de la modélisation du ligand dans la carte cryoEM. Il s’agit d’une période passionnante en biologie structurale et dans la découverte de médicaments, car des détecteurs d’électrons directs avec des fréquences d’images plus rapides et l’utilisation d’une acquisition de données plus rapide⁷⁰ ont permis d’obtenir des cartes à haute résolution (<2,8 Å) de plusieurs macromolécules souvent liées à des ligands de petites molécules dans un temps relativement court. L’introduction récente d’outils automatisés de modélisation de ligands tels que GEMspot⁶⁹ dans la suite Schrödinger et EMERALD¹⁷ dans la suite Rosetta, qui tentent de trouver la position liée la plus probable du ligand tout en tenant compte des données expérimentales de cryoEM, promet de rationaliser et d’automatiser ce processus. À l’instar de la cristallographie aux rayons X, il est envisagé que l’identification des modes de liaison des ligands de petites molécules par cryoEM, peut-être deux ou plus en une seule journée, deviendra une possibilité réaliste.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more