Summary
מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.
Abstract
ריפוי גנטי הוא טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לספק גנים חדשים לחולה לטיפול במחלה, בין אם זה להחדיר גן פונקציונלי, להשבית גן רעיל, או לספק גן שהתוצר שלו יכול לווסת את הביולוגיה של המחלה. שיטת המסירה של הווקטור הטיפולי יכולה ללבוש צורות רבות, החל מעירוי תוך ורידי למסירה מערכתית ועד הזרקה ישירה לרקמת המטרה. עבור הפרעות נוירודגנרטיביות, לעתים קרובות רצוי להטות את הטרנסדוקציה לכיוון המוח ו / או חוט השדרה. הגישה הכי פחות פולשנית למיקוד מערכת העצבים המרכזית כולה כוללת הזרקה לנוזל השדרה (CSF), מה שמאפשר לטיפול להגיע לחלק גדול ממערכת העצבים המרכזית. הגישה הבטוחה ביותר להעברת וקטור לתוך CSF היא הזרקה intrathecal מותני, שבו מחט מוחדרת לתוך בור מותני של חוט השדרה. טכניקה זו, הידועה גם בשם ניקור מותני, נמצאת בשימוש נרחב במכרסמים יילודים ובוגרים ובמודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שהטכניקה דומה בין מינים ושלבי התפתחות, הבדלים עדינים בגודל, במבנה ובגמישות של רקמות המקיפות את החלל התוך-תאי דורשים התאמות בגישה. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ניקור מותני בחולדות צעירות כדי לספק וקטור סרוטיפ 9 הקשור לאדנו. כאן, 25-35 μL של וקטור הוזרקו לתוך הבור המותני, וכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש כדי להעריך את פרופיל ההתמרה כתוצאה מכל זריקה. היתרונות והאתגרים של גישה זו נדונים.
Introduction
ההבטחה של טיפולים גנטיים בתיווך ויראלי סוף סוף התגשמה בשנים האחרונות עם אישור ה- FDA לטיפולים לאטרופיה של שרירי עמוד השדרה, ניוון רשתית, המופיליה פקטור IX, סרטן ועוד 1,2,3,4. אינספור טיפולים אחרים נמצאים כעת בפיתוח. ריפוי גנטי נועד להעביר גן טיפולי לתאי המטופל. תוצרי הגן החדש יכולים להחליף את הפעילות החסרה בגן אנדוגני לקוי, לעכב גן רעיל, להרוג תאים סרטניים או לספק תפקוד מועיל אחר.
עבור מחלות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS), העברת וקטור הטיפול הגנטי ישירות לרקמת המטרה היא לעתים קרובות רצויה. גישות לא מערכתיות מספקות שני יתרונות: הן ממזערות תופעות לוואי מחוץ למטרה שעלולות להיגרם על ידי התמרה היקפית, והן מפחיתות מאוד את כמות הווקטור הדרושה להשגת רמות נאותות של התמרה ברקמת המטרה5.
ישנן מגוון גישות להעברת וקטורים של ריפוי גנטי למערכת העצבים המרכזית. הזרקה Intraparenchymal, הזרקה של וקטור ישירות לתוך חוט השדרה או רקמת המוח, יכול לשמש למסירה לאזור מוגדר. עם זאת, עבור מחלות רבות, transduction רחב של CNS רצוי. ניתן להשיג זאת על ידי העברת וקטור לנוזל השדרה (CSF)5, הנוזל שזורם בתוך ומסביב למוח ולחוט השדרה. ישנן שלוש דרכים עיקריות להעביר וקטורים ל- CSF. הגישה הפולשנית ביותר היא העברה תוך-מוחית, הכוללת קידוח חור בור דרך הגולגולת והתקדמות מחט דרך המוח לתוך החדרים הרוחביים. זה מניב התמרה בכל המוח. עם זאת, ההליך עלול לגרום לדימום תוך גולגולתי, והגישה בדרך כלל מייצרת רק התמרה מוגבלת של חוט השדרה6. הזרקה לתוך cisterna magna בבסיס הגולגולת היא פחות פולשנית, אבל נושאת את הסיכון של נזק לגזע המוח. בעוד שלעתים קרובות נעשה שימוש במחקר בבעלי חיים5, הזרקה לתוך cisterna magna כבר לא בשימוש שגרתי במרפאה7. ניקור מותני הוא הגישה הכי פחות פולשנית לגישה ל- CSF. זה כרוך בהחדרת מחט בין שתי חוליות מותניות לתוך בור המותני.
ניקור מותני למסירה וקטורית מבוצע באופן שגרתי בחולדות ועכברים בוגרים ובעכברים ילודים 8,9. מחברי מחקר זה ביצעו לאחרונה ניקורים מותניים בחולדות צעירות (גיל 28-30 יום) כדי לספק וקטורים של סרוטיפ 9 הקשור לנגיף אדנו (AAV9). בחולדות בוגרות, מחט ניקוב מותני בילוד הונחה במאונך בין חוליות L3 ו-L49. מיקום נכון גורם לתנועת זנב ו-CSF לזרום למעלה לתוך מאגר המחטים. בחולדות צעירות, לעומת זאת, לא ניתן היה להשיג אף אחת מהקריאות הללו. לאחר מכן ניסו החוקרים להתאים הליך עכברי בוגר באמצעות מזרק אינסולין 27 גרם שהוחדר בזווית בין L5 ל-L610. בעכברים בוגרים, שהם בדרך כלל קטנים יותר מחולדות P28, זה לא מייצר תנועת זנב, אבל מיקום מחט שגוי ניכר על ידי זרימה חוזרת של ההזרקה. בחולדות צעירות, לעומת זאת, גישה זו הובילה באופן אחיד להעברת ההזרקה באופן אפידורלי, ככל הנראה כתוצאה מגמישות שונה בין עכברים בוגרים לחולדות צעירות של שכבות הרקמה המקיפות את חוט השדרה. גישות הצנתר נבדקו בהמשך. באופן ספציפי, קטטר הוכנס דרך חתך בדורה של בור המים המותני ועד חוט השדרה באמצע בית החזה; עם זאת, גישה זו הובילה לרפלוקס משמעותי של ההזרקה חזרה ממקום החתך במהלך הלידה. גם ניסיונות להחדיר את הצנתר לחלל התוך-תאי באופן מלעורי באמצעות מחט מנחה לא צלחו. בשל הצרה של הרוחב הבין-למינרי, סביר להניח שהקטטר יפגע בלמינה הרוסטרלית ולא יתקדם.
כאן, מתוארת שיטה להשגת אספקת פתרון מוצלחת וניתנת לשחזור באמצעות ניקור מותני בחולדה הצעירה. גישה זו יכולה לשמש עבור וקטורים נגיפיים, וככל הנראה גם עבור תאים, תרופות וטיפולים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אמורי (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי (גיל 28-30 יום, מסה בטווח של כ-90-135 גרם, זכרים ונקבות).
1. הכנת הווקטור
- הפשירו את וקטור AAV9 (ראו טבלת חומרים) על קרח בתחילת ההליך.
- צנטריפוגה צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל את הווקטור לזמן קצר בצנטריפוגה שולחנית כדי להבטיח שכל הנוזל נמצא בתחתית הצינור.
- סובב בעדינות את צינור המיקרוצנטריפוגה כדי לוודא שהתמיסה מעורבבת היטב.
2. הכנת כלוב ההתאוששות
- הניחו כלוב נקי על שמיכה חשמלית (ראו טבלת חומרים) כך שרק מחצית הכלוב יהיה במגע עם השמיכה.
- הגדר את טמפרטורת השמיכה ל ~ 37 ° C.
3. הכנת הפלטפורמה הכירורגית
- יש לחמם פד איזותרמי (ראו טבלת חומרים) ל-39°C במיקרוגל או באמבט מים, כך שהתכולה תהפוך לנוזלית.
- הניחו את הפד האיזותרמי על משטח הניתוח וכסו אותו בכרית ספסל סופגת ונקייה.
4. הכנת בעלי חיים
- מרדימים את החולדות באיזופלורן בקופסה שקופה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). התחל את השראת ההרדמה באמצעות 5% isoflurane, ולרדת 1% לדקה עד להגיע 2%. החזיקו את בעל החיים ב-2% למשך 3 דקות נוספות.
- הזיזו את הקופסה המחזיקה את החיה למכסה אדים ופתחו את הקופסה.
הערה: זה מגביל את החשיפה של המנתח להרדמה. - הסר את השיער מגבו של בעל החיים באמצעות קוצצי שיער חשמליים.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בקרם פיגול או קרם גילוח וגילוח ידני. - הניחו את בעל החיים על משטח הניתוח עם חוטמו בחרוט האף של ההרדמה.
הערה: בעל החיים עשוי להתחיל לחזור להכרה בזמן שהפרווה מוסרת מאתר הניתוח. אם זה קורה, להרדים אותו שוב כמתואר לעיל. - יש למרוח משחת עיניים מסככת על כל עין כדי למנוע התייבשות של הקרניות במהלך ההליך.
- לחטא את אזור הניתוח באמצעות שלושה יישומים לסירוגין של פובידון-יוד ומגבוני איזופרופנול.
- להזריק את משככי הכאבים תת עורית.
הערה: Buprenorphine משמש בדרך כלל במינון של 0.01-0.05 מ"ג / ק"ג, נתון כל 12 שעות. לחלופין, צורה שחרור איטי של תרופה זו יכולה להינתן פעם אחת ב 1 מ"ג / ק"ג כדי לספק שליטה נאותה בכאב במשך 72 שעות. התייעצו עם IACUC של המוסד לגבי ההנחיות שלהם לגבי טיפול בכאב. - יש להזריק 100 μL של לידוקאין 1% תת עורית מעל התהליכים בעמוד השדרה L2 עד L6 כדי לספק הרדמה מקומית.
- מניחים גליל של מגבת נייר או צינור בקוטר 1.5 ס"מ מתחת לחיה, רק רוסטרל לירכיים. זה עוזר להגמיש את עמוד השדרה, מה שמקל על החדרת המחט בין שתי הלמינה.
- הניחו וילון עם פנסטרציה (ראו טבלת חומרים) על החיה, ומרכזו את הפנסטרציה מעל עמוד השדרה המותני.
5. חשיפת עמוד השדרה המותני
- אשרו את עומק ההרדמה על ידי צביטת כל אחת מכפותיו של בעל החיים וחפשו היעדר תגובת נסיגה.
- באמצעות להב אזמל #11, ליצור חתך באורך של כ 3 ס"מ בעור במורד קו האמצע מ L2 עד L6.
- שחררו את העור מהשריר על ידי החדרת זוג מספריים כירורגיים מעוקלים סטריליים בין השריר לעור ולאחר מכן פתיחת הקצוות.
- הסר את הפאשיה המכסה את תהליכי עמוד השדרה L2-L5.
6. טעינת המזרק
- פיפטה 25-35 μL של הווקטור (כדי להשיג את המינון הרצוי) לתוך המכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
- משכו את כל הנפח לתוך מזרק האינסולין.
הערה: יש להקפיד לא לשאוב אוויר במהלך תהליך זה.
7. ביצוע ההזרקה
- זהה את תהליכי עמוד השדרה L5 ו- L4.
הערה: L6 יושב ישירות בין שני הפסגות האיליאק, והתהליך הספינסי שלו צריך להיות קל לזיהוי על ידי חיטוט עם מכשיר קהה. לאחר מכן ניתן להריץ את המכשיר בעדינות במעלה החלק האחורי כדי למצוא את גבולות תהליכי L5 ו- L4. - הניחו יד אחת כך שהאגודל יונח בעדינות על זנב החיה ורגל אחת. השתמש באצבע כדי לייצב את המזרק.
- מקם את המחט של המזרק כך שהוא משמאל לתהליך עמוד השדרה L5 ומסודר עם קצהו הקאודלי. מקמו את המזרק כך שהוא יהיה במרחק של כ-30° מקו האמצע וכ-30° למעלה ממישור השולחן.
הערה: ייתכן שיהיה מועיל להשתמש במיקרוסקופ כירורגי כדי לזהות טוב יותר ציוני דרך ולמקם את קצה המחט. - מקדמים את מחט המזרק קדימה כ-8 מ"מ, מעל החלק העליון של למינה L5 ולאחר מכן מתחת ללמינה L4 לתוך בור המים המותני עד לפגיעה בעצם. מיקום נכון יגרום לעווית של הרגל ו/או הזנב שניתן לראות או להרגיש על ידי האגודל המונח על הרגל/זנב. אם אין עווית, הסר את המחט ונסה את ההליך מצד שמאל. אם עדיין אין עווית, חזור על ההליך בין L4/L3 ו-L3/L2 לפי הצורך.
- לחץ על הבוכנה באיטיות במשך כ 5 שניות.
הערה: ייתכן שיש עווית ברגל או בזנב במהלך ההזרקה. - החזיקו את המזרק במקומו למשך כ-30 שניות לאחר לחיצה מלאה על הבוכנה כדי לאפשר ללחץ להתאזן ולמזער את הריפלוקס של ההזרקה כאשר המחט נסוגה.
- הסר לאט את המחט.
8. סגירת החתך
- קירוב לקצוות החתך.
- החל מקצה אחד של הפצע, השתמש בתפר 4-0 (ראה טבלת חומרים) או סיכות כירורגיות כדי לסגור את החתך.
9. התאוששות וניטור
- הכניסו את בעל החיים לכלוב שחומם מראש.
- בדוק את בעל החיים לפחות כל 15 דקות עד שהוא אמבולטורי לחלוטין.
הערה: פעולה זו אמורה להימשך בין 15 דקות ל-45 דקות. - במשך שלושת הימים הבאים, בצעו בדיקות בריאות לפחות מדי יום. לספק משככי כאבים במשך היומיים הראשונים לאחר הניתוח או לפי דרישת IACUC.
- שבוע לאחר הניתוח, יש להסיר את התפרים או הסיכות.
10. הליך מעקב
הערה: כדי לקבוע את הדיוק של טכניקת ההזרקה, הזריקו צבע כחול טריפאן כמתואר לעיל ולאחר מכן הרדימו מיד את בעל החיים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסדות) ובצעו כריתת למינקטומיה כדי לדמיין את התוצאה.
- בעוד בעל החיים נשאר תחת הרדמה, להרדים אותו על ידי מתן מנה קטלנית של pentobarbital באמצעות הזרקה intraperitoneal במינון של 150 מ"ג / ק"ג.
- לאחר הפסקת הנשימה ופעילות הלב, יש לפתוח את חלל החזה כדי להבטיח מוות. האריכו את החתך הניתוחי במעלה הגב לצוואר.
- בצע חתך באורך 4 ס"מ לתוך השריר במקביל לעמוד השדרה משני צידי התהליכים בעמוד השדרה, תוך שמירה קרובה ככל האפשר לתהליכים.
- בעזרת מלקחיים עדינים או מספריים, הסר את השריר בין התהליכים בעמוד השדרה.
- הסר את התהליכים בעמוד השדרה מ- L6 עד לעמוד השדרה התחתון של בית החזה באמצעות רונגר (ראה טבלת חומרים). הימנעו מתנועות פיתול, מכיוון שהדבר עלול לפגוע ברונג'ורים.
- הכנס את הקצה התחתון של הרונגר מתחת ללמינה L5 והסר את העצם מעל חוט השדרה על ידי לקיחת מספר "עקיצות" ממנו.
הערה: משיכה לאחור של תהליך עמוד השדרה L6 יכולה להקל על הכנסת קצה הרונגר. יש להקפיד על מניעת נזק לחוט השדרה. - המשך להרחיב את laminectomy לפחות ארבע laminae rostrally. בדוק את פני השטח הפנימי של laminae עבור סימנים של צבע, אשר יכול להצביע על הזרקה נכשלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע את הדיוק של טכניקת ההזרקה, צבע, טריפאן כחול, שימש כפונדקאית לטיפול. צבע זה נקשר בקלות לחלבונים, כך שהוא בדרך כלל נשאר בתוך המבנה שלתוכו הוא הוזרק. משמעות הדבר היא שהצבע עשוי שלא לחזות במדויק את התפלגות הטיפול לאחר ההזרקה; הוא משמש פשוט כדי לחשוף את הדיוק של ההזרקה. כאשר הוא מוכנס בהצלחה לבור המים המותני, כחול טריפאן נקשר לדורה מאטר, ומכתים את היקף חוט השדרה בכחול. עם זאת, כאשר המחט אינה מצליחה לחדור את הדורה מאטר, הצבע מגיע בסופו של דבר לחלל האפידורלי. הן הדורה מאטר והן הרקמות הסובבות אותו (פני השטח של העצם והרצועות והשרירים המחברים את הלמינה) יהיו מוכתמים בכחול. דפוסים אלה נראים בקלות לעין בלתי.
קשה להעריך את ההבדל בין זריקה נכונה לזו הניתנת באופן שגוי אם פשוט מבצעים חתך רוחבי דרך חוט השדרה ועמוד השדרה. במקום זאת, מומלץ לבצע למינקטומיה באמצעות זוג רונג'ורים המתחילים בלמינה L5 ונעים באופן רוסטרלי. יש להקפיד שלא לפגוע בדורה מאטר בתהליך. השימוש במיקרוסקופ המנתח מקל על תהליך זה. איור 1 מספק דוגמאות השוואתיות של זריקות מוצלחות וזריקות מוצלחות רק באופן חלקי. עם הזרקה מוצלחת, מעט מאוד ריפלוקס לאורך מסלול המחט הוא ציין כאשר המחט נסוגה. לאחר הזרקה מוצלחת, הסרת הלמינה כדי לחשוף את חוט השדרה חושפת כחול טריפאן בתוך חוט השדרה אך לא על פני השטח של העצם (איור 1A). הצבע נראה גם על גזע המוח והמוח הקטן לאחר הזרקה מוצלחת (איור 1B). לעומת זאת, הזרקה מוצלחת חלקית מתבטאת בריפלוקס משמעותי של צבע המגבה את מערכת המחט במהלך תהליך ההזרקה ו/או עדות נראית לעין של צבע על העצם (איור 1C).
באמצעות ההליך הנ"ל, 28 μL של וקטור AAV9 המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (GFP) הוזרק בריכוז של 3 x10 13 גנומים וקטוריים / מ"ל, למינון כולל של 8.4 x 1011 גנומים וקטוריים / חיה. ארבעה שבועות לאחר מכן, החיות הומתו ומחוררות עם 4% פרפורמלדהיד10. המוח וחוט השדרה נקצרו והוכנו לחתך קפוא. חלקים בעובי 40 מיקרומטר התקבלו ומוכתמים עבור GFP. איור 2 מספק דוגמאות לתבנית הטרנסדוקציה המתקבלת עם הווקטור הזה. ההתמרה הייתה בדרך כלל הגבוהה ביותר בחוט השדרה, במיוחד באזור המותני (איור 2A-C), ככל הנראה בשל קרבתו לאתר ההזרקה. התמרה של המוח הושגה (איור 2D-F), אבל, כצפוי, היא נטתה להיות מוגבלת יותר ממה שנראה בחוט השדרה.
כדי להמחיש את יכולת השחזור של תוצאות שהושגו על-ידי מנתח יחיד ומנוסה שהשתמש בכמות אחת של וירוסים, חלקים מוכתמים במוח הקטן ובקליפת המוח מכל אחת מ-15 החולדות שהוזרקו למחקר הזה מוצגים באיור 3 ובאיור 4, בהתאמה. החלקים המוכתמים של חוט השדרה הצווארי מוצגים גם עבור 7 מתוך 15 החולדות האלה (איור 5). כמובן, כמות ההתמרה המוחית עשויה להראות שונות גדולה עוד יותר עם מינונים שונים, הרבה וקטורים ומנתחים10.
איור 1: חשיפה של חוט השדרה לאחר הזרקת צבע. למינקטומיה בוצעו לאחר הזרקת טריפאן כחול. (A) חוט השדרה מוכתם בכחול בזריקה הניתנת כהלכה, ולא נראה צבע על העצם שהוסרה במהלך כריתת הלמינקטומיה (חיצים). (B) ניתן לראות את הצבע גם סביב גזע המוח. (C) בזריקה שבה היה ריפלוקס משמעותי במהלך ההזרקה, יש פחות צבע בתוך החבל, והצבע נמצא על פני העצם (חיצים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמאות לדפוסי התמרה שהושגו בעקבות העברה תוך-תאית של AAV9-GFP. חלקים בעובי 40 מיקרומטר של (A) צוואר הרחם, (B) בית החזה ו-(C) חוט השדרה המותני הוכתמו באופן אימונוהיסטוכימי עבור GFP (כתם שחור). רמות גבוהות של התמרה של חומר אפור נצפו בכל הרמות. (D) לעומת זאת, המוח מציג התמרה כללית דלילה יותר. התיבות השמאלית והימנית מוגדלות ב- (E) וב- (F), בהתאמה. (E) רוב הצביעה נצפית במוח הקטן, בעיקר בנוירונים של Purkinje (חיצים). (F) תאי עצב (חצים) ואסטרוציטים (ראשי חץ) מומרים בתוך קליפת המוח. פסי קנה מידה: (A-C) 325 מיקרומטר; (ד) 5 מ"מ; ו-(E,F) 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שכפול של התמרה במוח הקטן. שחזור של התמרה במוח הקטן של 15 חולדות שהוזרקו על ידי אותו מנתח באמצעות אותו מינון והרבה של הנגיף. סרגל קנה מידה: 1 מ"מ. המספרים בתמונות מציינים את מספרי תעודת הזהות של החולדה ('פסולת'. יחיד"). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שכפול של התמרה בקליפת המוח. שחזור של התמרה בקליפת המוח של 15 חולדות שהוזרקו על ידי אותו מנתח באמצעות אותו מינון והרבה וירוס. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. המספרים בתמונות מציינים את מספרי תעודת הזהות של החולדה ('פסולת'. יחיד"). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: שחזור של התמרה בחוט השדרה הצווארי. שחזור של התמרה בחוט השדרה הצווארי של 7 חולדות שהוזרקו על ידי אותו מנתח באמצעות אותו מינון והרבה וירוס. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. המספרים בתמונות מציינים את מספרי תעודת הזהות של החולדה ('פסולת'. יחיד"). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מגוון רחב של מחלות משפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מתן עותק פונקציונלי של הגן הרלוונטי באמצעות וקטור נגיפי היא אסטרטגיית טיפול אטרקטיבית עבור אלה שהם רצסיביים ומונוגניים בטבע, כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה. עם זאת, מחסום הדם-מוח (BBB) אינו כולל את רוב וקטורי הריפוי הגנטי הניתנים תוך ורידי11. אלה שיכולים לחצות את BBB, כגון AAV9, חייבים להינתן במינונים גבוהים כדי להתגבר על אובדן וקטור עקב התמרה היקפית12. גם הגיל מהווה מחסום. החשיפה הסביבתית לסרוטיפים השונים של AAV עולה עם גיל13 ולעיתים קרובות מובילה לייצור נוגדנים שיכולים לנטרל וקטורים טיפוליים14. לכן, מתן תוך ורידי של וקטורים של ריפוי גנטי עבור הפרעות CNS מוגבל בדרך כלל לתינוקות ואינו משמש בחולים שאובחנו מאוחר יותר בחיים.
עבור חולים מבוגרים, הזרקה וקטורית ישירה לתוך CSF יכולה להניב התמרה רחבה במערכת העצבים המרכזית, תוך עקיפת BBB ונוגדנים קיימים נגד AAV15. מכיוון שגישה זו ממוקדת, ניתן להשתמש גם במינונים וקטוריים נמוכים יותר. ישנן שתי גישות עיקריות במסגרת הקלינית: (1) ניקור מותני ו-(2) הזרקה לחדרים הצדיים. האחרון נושא סיכון רב יותר, אך בדרך כלל מספק התמרה מוחית גדולה יותר. ניקור מותני בטוח יותר, אך התמרה מוטה לכיוון חוט השדרה. התמרה מוחית עשויה להיות משופרת על ידי הצבת המטופל במצב Trendelenburg, אבל הנתונים על זה מעורבים16,17. השימוש בצנתר כדי להגיע לעצם העצם באמצעות ניקור מותני עשוי לספק אפשרות טובה יותר במרפאה, אך הוא נמצא בשלב מוקדם של שימוש5. ייתכנו אתגרים אחרים בתרגום גישות שעובדו במודלים של בעלי חיים לקליניקה, כגון אובדן וקטור עקב דליפת CSF18 ורעילות בגרעיני השורש הגבי19.
רוב המחקרים על טיפולים מכווני CNS המבוצעים במכרסמים משתמשים בילודים או בבעלי חיים בוגרים (גיל >60 יום). ליילודים יש יתרון של גודל גוף קטן, המאפשר מינונים יעילים גבוהים יותר, ומערכת חיסונית לא בוגרת, המונעת את הסיבוכים של תגובה חיסונית נגד הטיפול. עם זאת, במונחים של התפתחות המוח, עכבר או חולדה שזה עתה נולדו מייצגים טוב יותר שלב עוברי בבני אדם. עבור טיפולים המיועדים לילדים בטווח הגילאים 5-10 שנים, חולדה צעירה (25-35 ימים) היא מודל טוב יותר במונחים של התפתחות נוירולוגית20. מכיוון שלא תוארה בעבר שיטה להזרקה תוך-תאית עבור חולדות צעירות, ושיטות שנקבעו עבור עכברים וחולדות בוגרים הוכחו כלא יעילות בחולדות בגיל זה, פותחה הגישה שתוארה לעיל. למען הסר ספק, חולדות צעירות הן לא רק קטנות יותר מבוגרות, אלא עשויות גם להיות שונות בגמישות של הדורה המגינה על חוט השדרה, מה שהופך הליך שפועל לנקב שכבה זו בחולדה בוגרת ללא יעיל בחולדה צעירה.
כאשר לומדים כיצד לבצע הזרקה תוך-תאית בחולדות צעירות, יש צורך להשתמש בצבע (כגון כחול טריפאן) כתחליף לטיפול, והמשתמש צריך להיות בטוח מאוד ביכולתו לבצע בהצלחה ובשחזור את ההליך לפני תחילת מחקר עם טיפול. להיות בקיא בטכניקה ידרוש תרגול כדי לקבל ניסיון עם איך המזרק מרגיש כאשר המסלול הוא על המטרה לעומת מחוץ למטרה. קיימות שתי שגיאות נפוצות. אם זווית הגישה רדודה מדי, המחט תפגע בחלק העליון של אחת הלמינה או בחלק האחורי של הלמינה הרוסטרלית. לא תהיה עווית, והמרחק שהמחט מתקדמת יהיה כמה מילימטרים פחות מ -8 מ"מ. אם זווית הגישה גדולה מדי, קיים סיכון שהמחט תעבור בין שתי הלמינה ותחדר לחלל הבטן. כאשר זה קורה, המחט תתקדם הרבה יותר מ 8 מ"מ. במקרה כזה, הסר את המחט, מקם מחדש ונסה שוב. במקרים המעטים שזה קרה, כניסה זמנית לחלל הבטן בכמה מילימטרים לפני נסיגה ומיקום מחדש לא גרמה נזק מתמשך נראה לעין לבעלי החיים.
נמצא כי התבוננות בתגובה פיזית למיקום המחט היא קריטית להשגת יכולת שחזור עם אחוזי הצלחה גבוהים בהליך זה. כאשר לא הייתה תגובה, אחוזי ההצלחה של הזריקה היו נמוכים. עם זאת, במקרים מסוימים, בעל חיים דרש ניסיונות במספר אתרים כדי להשיג תגובה, וכמויות זעירות של צבע נצפו באחד או יותר ממסלולי המחט הקודמים. לא נצפה צבע בחלל האפידורלי, מה שמרמז על כך שחלק ממקלות המחט הקודמים חדרו לדורה מבלי לייצר עווית בזנב או ברגל. מכיוון שהריפלוקס היה מינימלי (בדומה למה שנצפה במסלול המחט מההזרקה), ההערכה היא כי ההשפעה של מקלות מחט קודמים על יעילות המסירה במקרים אלה הייתה זניחה.
ברגע שמגיעים למיומנות בטכניקת הלידה, ניתן להיתקל באתגר שני, לא ניתוחי. באופן ספציפי, בחולדות בוגרות (~ גיל 70 יום), העוצמה של וקטורי AAV9 להעברה תוך-תאית לחוט השדרה ולמוח יכולה להשתנות באופן משמעותי מהרבה למגרש, אפילו כאשר הם נוצרים על ידי אותה ליבה וקטורית. חלק מהאצוות יפעלו כמצופה, ויניבו התמרה בחומר האפור של חוט השדרה לאורכו. אחרים, לעומת זאת, לא יצליחו לחדור את החומר האפור, בעיקר בגרעיני שורש גבי10. הסיבה לשונות זו אינה ברורה, שכן הווקטורים חזקים במבחנה וכאשר מוזרקים ישירות לחוט השדרה. מומלץ לבצע מחקר פיילוט של 3-4 בעלי חיים עם כל אצווה חדשה של וירוס כדי לוודא שהמנה החדשה מתפקדת כצפוי לפני תחילת מחקר גדול. ניתן להעריך את העוצמה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית או אימונופלואורסצנטית של תוצר טרנסגן החלבון, או לכמת את כמות הטרנסגן mRNA או גנום וקטורי באמצעות PCR כמותי או ddPCR21. בנוסף למשתנים הלא ידועים המבדילים בין כמות נגיפית, הבדלים קטנים בגיל בעלי החיים, נפח ההזרקה, מהירות המסירה וריכוז הווקטורים עשויים לגרום לשונות בתוצאות. לפני תחילת מחקר גדול, ייתכן שיהיה צורך להתאים אותם עבור כל וירוס או סוכן טיפולי מועמד אחר.
לאחר ההכשרה, מנתח מנוסה יכול להשלים את הליך ההזרקה התוך-תאית של חולדה צעירה תוך כ-30 דקות, מהשראת ההרדמה ועד תחילת תקופת ההחלמה. זה מאפשר לקבוצות גדולות להיות מטופלות בתוך פרק זמן קצר. גם ההחלמה מהניתוח מהירה. רוב בעלי החיים מתאמבים בדרך כלל תוך 20-30 דקות. לאחר ביצוע יותר מ -200 ניתוחים אלה, לא נתקלו תופעות לוואי של הליך זה.
לבסוף, מזעור מצוקת בעלי החיים והבטחת רווחת בעלי החיים במהלך הליכים כירורגיים הם שיקולים בעלי חשיבות עליונה. לפיכך, נדרש שימוש נכון בחומרי הרדמה ומשככי כאבים, ויש לשמור על טמפרטורת הגוף במהלך ההליך ועד שבעל החיים יתאושש לחלוטין מההרדמה. לגופי הרגולציה הרלוונטיים ולצוות הווטרינרי במוסדות השונים עשויות להיות דרישות והמלצות שונות בנושאים אלה. השימוש בחומרי הרדמה ומשככי כאבים המתוארים בהליך זה פותח בהתייעצות עם וטרינרי אוניברסיטת אמורי וצוות IACUC. החוקרים צריכים לעבוד בשיתוף פעולה הדוק עם הווטרינרים המקומיים שלהם ועם IACUC כדי לעמוד ביעדים הדרושים.
ישנן מגבלות מסוימות להליך זה. השיטה המתוארת כאן פותחה לשימוש בחולדות צעירות, והבדלים מבניים ואחרים רבים בין בני אדם לחולדות עשויים להגביל את התרגום של הליכים אלה לבני אדם. המטרה של לאפשר הזרקה תוך-תטית מותנית של טיפול בחולדות צעירות היא להקל על השימוש במודל החולדות הצעירות לבדיקת יעילות הטיפול המועמד - גם אם יהיה צורך לשנות את אופן המסירה המדויק ליישום בחולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ד"ר דונסנטה הוא ממציא פטנט תלוי ועומד בנוגע לניהול CSF של וקטורי AAV9.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לסטיבן גריי, מתיו ריו, ננדה רגמי ולייסי סטרמן מ-UT Southwestern על דיון פורה באתגר שמציבות חולדות צעירות להזרקה תוך-תאית. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מימון של יגואר תרפיה גנטית (ל JLFK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 µL filtered pipette tips | MidSci | PR-200RK-FL | Pipetting virus |
| AAV9-GFP | Vector Builder | P200624-1005ynr | AAV9 vector expressing GFP |
| Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided | McKesson | J422H | Suture |
| Bench pad | VWR | 56616-031 | Surgery |
| Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' | Fisher Scientific | 50-195-4664 | Maintains body temperature |
| Buprenorphine | McKesson | 1013922 | Analgesic |
| Buprenorphine-ER (1 mg/mL) | Zoopharma | Extended-release analgesic | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific | 19-365-409 | Blood removal |
| Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration | Steris | 1212CPSTF | Surgical drape |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Forceps |
| Electric Blanket | CVS Health | CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad | |
| Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL | Eppendorf | 3123000055 | Pipetting virus |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | Curved surgical scissors |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | Laminectomy |
| Halsey Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | Needle driver |
| Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc | BD | 328431 | Syringe |
| Isoflurane | McKesson | 803250 | Anesthetic |
| Isopropanol wipes | Fisher Scientific | 22-031-350 | Skin disinfection |
| Lidocaine, 1% | McKesson | 239935 | Local anesthesia |
| Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-137 | Loading the syringe |
| Povidone-iodine | Fisher Scientific | 50-118-0481 | Skin disinfection |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Scalpel blade holder |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific | EZ-17 | Anesthesia box |
| Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped | McKesson | 4-111 | #11 Scalpel blade |
| SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment | Alcon | Eye ointment | |
| Trypan Blue | VWR | 97063-702 | Injection |
References
- Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
- Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharmaceutics. 15 (2), 685 (2023).
- Larkin, H. First FDA-approved gene therapy for hemophilia. JAMA. 329 (1), 14 (2023).
- Lee, A.
- Taghian, T., et al. A safe and reliable technique for CNS delivery of AAV vectors in the cisterna magna. Mol Ther. 28 (2), 411-421 (2020).
- Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
- Pellot, J. E., Jesus, O. D. Suboccipital puncture. [Updated 2022 Jul 25]. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2022).
- Elliger, S. S., Elliger, C. A., Aguilar, C. P., Raju, N. R., Watson, G. L. Elimination of lysosomal storage in brains of MPS vii mice treated by intrathecal administration of an adeno-associated virus vector. Gene Ther. 6 (6), 1175-1178 (1999).
- De La Calle, J. L., Paino, C. L. A procedure for direct lumbar puncture in rats. Brain Res Bull. 59 (3), 245-250 (2002).
- O'connor, D. M., Lutomski, C., Jarrold, M. F., Boulis, N. M., Donsante, A. Lot-to-lot variation in adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) preparations. Hum Gene Ther Methods. 30 (6), 214-225 (2019).
- Manfredsson, F. P., Rising, A. C., Mandel, R. J. AAV9: A potential blood-brain barrier buster. Mol Ther. 17 (3), 403-405 (2009).
- Hudry, E., Vandenberghe, L. H. Therapeutic AAV gene transfer to the nervous system: A clinical reality. Neuron. 101 (5), 839-862 (2019).
- Georg-Fries, B., Biederlack, S., Wolf, J., Zur Hausen, H. Analysis of proteins, helper dependence, and seroepidemiology of a new human parvovirus. Virology. 134 (1), 64-71 (1984).
- Schulz, M., et al. Binding and neutralizing anti-aav antibodies: Detection and implications for rAAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 31 (3), 616-630 (2023).
- Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., Mccown, T. J., Samulski, J. R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-aav-neutralizing antibodies by intrathecal aav administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for sma: A dose-response study in mice and non-human primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Hinderer, C., et al. Evaluation of intrathecal routes of administration for adeno-associated viral vectors in large animals. Hum Gene Ther. 29 (1), 15-24 (2018).
- Wang, Y. F., et al. Cerebrospinal fluid leakage and headache after lumbar puncture: A prospective non-invasive imaging study. Brain. 138, 1492-1498 (2015).
- Hordeaux, J., et al. Adeno-associated virus-induced dorsal root ganglion pathology). Hum Gene Ther. 31 (15-16), 808-818 (2020).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106-107, 1-16 (2013).
- Fang, H., et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods. 23 (4), 234-241 (2012).
