내분비 및 외분비 췌장 생리학을 연구하기 위해 인간 췌장 조직 절편 생성

Summary

이 프로토콜은 거의 생리학적 조건에서 세포 기능을 연구하기 위해 사망한 장기 기증자로부터 인간 췌장 절편을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 혁신적인 접근법은 정상 및 구조적으로 손상된 섬과 내분비 구획 간의 복잡한 상호 작용을 조사할 수 있게 합니다.

Abstract

제1형 당뇨병(T1D) 및 제2형 당뇨병(T2D)과 관련된 병태생리학적 메커니즘뿐만 아니라 췌장의 내분비 및 외분비 생리학 및 상호 작용을 이해하기 위해 인간의 췌장을 연구하는 것이 중요합니다. 고립된 췌장 섬에 대한 연구에서 많은 것을 배웠지만, 이것은 전체 조직의 맥락에서 췌장섬의 기능과 상호 작용을 조사하는 것을 방해합니다. 췌장 절편은 원래 환경 내에서 정상, 염증 및 구조적으로 손상된 섬의 생리학을 탐구할 수 있는 독특한 기회를 제공하며, 이를 통해 내분비 구획과 외분비 구획 간의 상호 작용 연구를 통해 췌장 조직의 복잡한 역학을 더 잘 조사할 수 있습니다. 따라서 살아있는 췌장 절편 플랫폼의 채택은 이 분야에서 상당한 발전을 나타냅니다. 이 프로토콜은 아가로스 및 진동 슬라이싱에 조직을 매끼워 사망한 장기 기증자로부터 살아있는 조직 절편을 생성하는 방법과 동적 분비 및 라이브 세포 이미징과 같은 기능적 판독을 평가하는 데 활용하는 방법을 설명합니다.

Introduction

섬 생리학에 대한 연구는 당뇨병의 발병 기전을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 지금까지의 연구는 고립된 섬에 의존해 왔는데, 이는 섬을 기계적 및 효소적 스트레스에 노출시켜 세포 생리학에 변화를 일으킬 가능성이 있습니다. 더욱이, 자연 조직 환경의 맥락에서 섬 기능을 평가하는 것은 불가능하며, 이는 무엇보다도 외분비 및 혈관 세포의 영향을 받을 수 있습니다¹. T1D로 기증자의 췌장을 연구할 때, 췌장의 섬은 분리하기 어렵고 격리 중에 단편화될 수 있으며, 이는 in vivo²에서 개체군을 대표하지 않을 수 있는 섬에 선택 효과를 생성할 수 있다는 문제가 있습니다. 더욱이, 섬은 복잡한 환경 및 세포 연결, 특히 염증이 있는 섬에서 발견되고 섬 주변에서 더 풍부하게 발견되는 침투 면역 세포로부터 분리될 것입니다. 따라서 고립된 섬은 당뇨병 연구의 초석 도구이지만 한계가 있습니다. 이에 대응하여 우리는 살아있는 췌장 절편을 생성하기 위한 획기적인 프로토콜을 도입하여 이러한 문제에 대한 솔루션을 제공합니다.

최근 췌장 조직 절단 기술의 개발 및 채택은 췌장의 복잡한 생물학과 기능을 탐구하는 우리의 능력에 대한 돌파구로 간주됩니다. 이 혁신은 자연적인 해부학적 맥락 내에서 내분비, 외분비, 신경, 혈관 및 면역 세포 간의 상호 작용과 섬 생리학의 역동적인 연구를 위한 새로운 길을 열었습니다. 기존의 접근법과 달리, 이 in vitro setting은 장기의 세포 구조를 상당 부분 보존하여 원래 생물학에 더 가까운 근사치를 가능하게 합니다. 2003년 Speier와 Rupnik에 의해 생쥐에서 처음 개발된 이 방법은 세포 내 및 세포 간 신호 전달 ^4,5,6,7,8,9에 대한 칼슘 이미징, 전기 생리학 및 호르몬 분비를 평가하는 유용성을 입증했습니다. 그런 다음 췌장 절편 플랫폼을 외과 생검 4,10,11,12를 통해 얻은 인간 췌장 조직 연구에 적용했습니다. 우리 그룹은 당뇨병이 있는 췌장 장기 기증자를 위한 네트워크(Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes, nPOD)¹³의 활동을 통해 사체 장기 기증자로부터 췌장 절편을 얻고 활용할 수 있는 가능성을 입증했습니다. nPOD는 인간 제1형 당뇨병에 대한 연구를 수행하는 승인된 연구자에게 췌장 조직을 제공하며, 췌장 절편 플랫폼을 채택한 이후 nPOD는 정기적으로 살아있는 췌장 절편을 생성하고 배포합니다 14,15,16,17. 2020년 췌장 절편 플랫폼을 구현한 이후 nPOD는 43명의 기증자(T1D 기증자 12명 포함)의 조직 절편을 수많은 연구자에게 성공적으로 배포했습니다. 이 절편을 사용하여 연구자들은 섬 기능의 중요한 측면에 대한 획기적인 연구를 수행하고 T1D 13,18,19,20,21,22,23,24의 맥락에서 섬과 혈관, 신경계 및 면역 세포 간의 상호 작용을 탐구했습니다 . 수많은 연구에서 전통적인 접근법의 한계를 강조하고 췌장 내의 역동적인 상호작용을 포착할 수 있는 기술의 중요성을 강조했습니다 25,26,27. 쥐에서 인간의 췌장에 이르는 슬라이싱 기술의 적응력과 당뇨병이 있는 췌장 장기 기증자 네트워크(nPOD)와 같은 프로그램으로의 통합은 제1형 당뇨병과 같은 질병에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있는 이 방법의 잠재력에 대한 인식이 커지고 있음을 보여줍니다.

Protocol

남녀 조직 기증자의 인간 췌장 절편은 플로리다 대학의 당뇨병 췌장 장기 기증자 네트워크(nPOD) 조직 은행을 통해 획득했습니다. 신원이 확인되지 않은 사망한 개인의 장기 조직은 장기 기증 법률 및 규정에 따라 비인간 피험자 연구로 결정되었으며, 플로리다 대학교 기관 검토 위원회(IRB; IRB no. 392-2008), 동의의 필요성을 포기합니다. 이 프로젝트에 특별히 사용된 nPOD 조직은 플로리다 대학교 IRB(IRB20140093)에 의해 비인간 것으로 승인되었습니다. 참고: 융합 주위 이미징 및 칼슘 이미징과 같은 슬라이스 기술과 그 응용 분야에 완전히 새로운 독자의 경우, 인간 샘플로 작업하기 전에 마우스 또는 랫 슬라이스 3,28을 사용하여 실제 경험을 쌓고 기본 기술을 개발하는 것이 좋습니다. 1. 준비 참고: 이러한 제제는 조직이 도착하기 전에 수행해야 합니다. 125mM NaCl, 5.9mM KCl, 2.56mM CaCl2, 1mM MgCl2, 25mM HEPES, 0.1% BSA, 2mM L-알라닌, L-아르기닌 및 L-글루타민을 혼합하여 HEPES 완충액을 제조합니다. pH를 7.4로 조정하고 필터 살균합니다. 포도당 및/또는 기타 자극을 완충액에 추가하여 융합 주위 실험을 위한 용액을 준비합니다. 기준선 완충액의 경우 5.5mM 포도당을 추가합니다. 이 완충액은 슬라이싱 절차, 절편 수집 및 융합 주위 준비에 사용됩니다. 베이스라인 버퍼에 아프로티닌(10μg/mL)을 추가하여 슬라이스 수집을 위한 최소 두 개의 접시를 준비합니다. BSA 및 아미노산(125mM NaCl, 5.9mM KCl, 2.56mM CaCl2, 1mM MgCl2, 25mM HEPES)이 없는 HEPES 완충액에 3.8% 저융점 아가로스 용액을 준비하고 37°C에서 유지합니다. 홀더에 새 칼날을 놓아 비브라톰을 조립합니다. 해당되는 경우 블레이드 각도를 15°로 설정합니다(Leica VT1200S를 사용하는 경우). 해당되는 경우 진동을 보정합니다. 주융 기계를 켜고 챔버 수와 프로그램 프로토콜을 선택합니다. 필요한 모든 용액을 주융 기계에 넣고 시스템을 프라이밍하고 용액을 가열 상태로 유지합니다. 기계는 프로토콜에 사용되는 각 솔루션의 필요한 볼륨을 계산합니다. 2. 조직 가공 참고: 슬라이스는 수령 직후 생성되어야 합니다. 지연되면 절차에 어려움이 생기고 조직이 저하될 수 있습니다. 실체 현미경 아래의 기준선 완충액이 있는 접시에 췌장 조직을 놓습니다(그림 1A). 겸자와 가위를 사용하여 결합 조직, 섬유 조직 및 지방 조직을 부드럽게 제거합니다. 가위나 메스를 사용하여 조직을 약 0.5cm3(그림 1B)의 여러 작은 조각으로 자릅니다. 마른 췌장 조각을 티슈 페이퍼에 닦아냅니다. 4개 조각을 35mm 페트리 접시에 옮기고 모든 조각이 완전히 잠길 때까지 접시에 아가로스 용액을 채웁니다. 아가로스가 완전히 응고되도록 합니다. 아가로스에서 조심스럽게 조각을 잘라냅니다. 접시 가장자리를 따라 메스를 움직여 아가로스를 제거하고 조직 블록을 조심스럽게 분리합니다. 조각이 얇은 아가로스 층으로 둘러싸여 있는지 확인하십시오. 3. 슬라이싱 비브라톰의 금속판에 조직 조각을 거꾸로 놓아 붙입니다. 플레이트를 트레이에 장착하고 트레이에 기준선 완충액(5.5mM 기준선 포도당을 포함하는 HEPES)을 채웁니다. 비브라톰을 120μm에서 자동 슬라이싱으로 설정하고 시작 및 종료 위치를 조정합니다. 칼날을 조직 바로 위로 이동하고 느린 속도(0.1mm/s)와 0.8mm의 진폭으로 슬라이싱을 시작합니다. 조직이 허용하는 경우 속도를 높일 수 있습니다(그림 1C). 구부러진 집게나 작은 브러시를 사용하여 조각을 수집합니다. 아프로티닌을 함유한 기준선 완충액에 절편을 축적합니다(그림 1D). 슬라이스를 아프로티닌이 있는 기준선 완충액에서 최소 1시간 동안 휴지시키십시오. 절단 과정에서 방출되는 효소를 씻어낼 수 있도록 느린 궤도 셰이커에 조각을 놓습니다. 4. 라이브/데드 분석 참고: 이것은 시술 후 조직 절편의 생존 가능성을 보여주는 선택적 분석법입니다. 그러나 한 번 더러워진 조각은 재사용할 수 없습니다. 기준선 버퍼로 채워진 웰에 단일 슬라이스를 옮깁니다. 플루오레세인 다이아세테이트(FDA, 50μg/mL)를 넣고 실온에서 1분 동안 배양한 후 빛으로부터 보호하십시오. 프로피듐 요오드화물(PI,50 μg/mL)을 넣고 실온에서 1분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 슬라이스를 PBS로 채워진 다른 웰로 옮겨 1분 동안 세척합니다. 슬라이스를 페트리 접시에 옮기거나 이미징을 위한 커버 슬립이 있는 유리 슬라이드에 장착합니다(그림 2A,B). 5. 페리퓨전 참고: 이 프로토콜은 조직 절편에 대해 동적 주관류를 수행하는 방법을 설명하지만 고립된 섬에도 적합합니다. Islet 챔버는 기계의 사용 설명서에 설명된 대로 Islet을 적재하기 전에 여과지와 비드 용액으로 준비해야 합니다. 그러나 islet 및 slice chamber는 동일한 실험에서 함께 사용할 수 있습니다. 3 개의 조각을 선택하고 브러시와 메스를 사용하여 실체 현미경으로 아가로스를 최소한으로 자릅니다. 슬라이스 챔버의 그리드에 베이스라인 버퍼(5.5mM 베이스라인 포도당을 포함하는 HEPES) 한 방울을 추가하고 그리드에 슬라이스 하나를 부드럽게 놓습니다. 3개의 슬라이스 각각에 대해 반복합니다(그림 3A). 슬라이스가 매우 작은 경우 섬 수를 늘리기 위해 3개 이상의 챔버를 쌓습니다. 챔버당 두 개 이상의 슬라이스를 배치하지 마십시오.참고: 조각당 섬의 수는 기증자마다 크게 다르며 조각 크기(10-100개의 섬/조각)에 따라 다릅니다. 총 3개의 절편이 인슐린과 글루카곤 분비를 모두 측정하기에 충분한 것으로 입증되었습니다. 고립된 섬의 경우 인슐린 분비를 위해 컬럼당 최소 30개의 섬을 사용합니다. 글루카곤 검출을 위해 100개의 섬을 사용하는 것이 좋습니다. 개별 슬라이스 챔버 부품을 위에서 아래로 조립합니다. 슬라이스 챔버를 기계의 유입 및 유출 튜브에 연결하고 프로토콜을 시작합니다(그림 3C). 프로토콜 중에는 챔버 가열 및 트레이 냉각 펌프를 사용하십시오. 프로토콜 중에 수집 플레이트를 교체하고 당일 정량화가 수행되는 경우 4°C에서 보관하거나 그때까지 -80°C에서 보관하십시오. 프로토콜이 완료되면 챔버를 제거하고 분해하여 용해(절대 에탄올의 경우 3% HCl) 또는 고정(4% 파라포름알데히드)을 위한 슬라이스를 수집합니다. 물, 10% 표백제, 물 및 공기로 기계를 세척하여 청소하십시오. 시중에서 판매되는 검출 키트를 사용하여 호르몬 분비를 정량화합니다.참고: 그림 4 는 농도 범위를 추정하기 위해 3개 절편의 인슐린 및 글루카곤 분비의 절대 수준을 보여줍니다. 6. 칼슘 이미징 제조업체 지침에 따라 칼슘 염료(예: Fluo4-AM, Calbryte) 용액을 준비합니다. 베이스라인 HEPES 완충 용액에 염료를 희석하고 아프로티닌(10μg/mL)을 추가합니다. 단일 슬라이스를 옮기고 실온의 오비탈 셰이커에서 30-60분 동안 배양하고 빛으로부터 보호하십시오. 배양 시간 동안 융합 주위 주사기를 채우고 튜브를 프라이밍하여 slice 이미징 설정을 준비합니다(그림 5A,B). 모든 장치를 연결하고 히터를 켠 다음 펌프 흐름을 시작합니다. 유량 가열과 플랫폼 히터를 모두 사용하고 0.5mL/분의 유속을 사용하는 것이 좋습니다. 이미징 챔버에 단일 슬라이스를 부드럽게 놓고 하프를 사용하여 고정합니다. 저배율 대물렌즈를 사용하여 이미징 영역을 식별합니다. 반사를 사용하면 섬 면적을 식별하는 데 도움이 됩니다(그림 5C). 더 높은 배율의 목표(예: 20x 또는 40x)로 전환하고 실험 설정에 따라 위치를 조정합니다.NOTE: 최적의 셀 생존력과 islet 무결성을 보장하려면 광학 섹션이 절단 표면 아래 1-2 셀 레이어에 위치하는 것이 좋습니다. Z-stack 및/또는 타일 스캔 위치를 설정합니다. 이미징 간격과 촬영 시간을 설정합니다. 여기서, 개별 세포의 구별을 허용하기 위해 최소 256 x 256의 해상도, 5-10초의 이미징 간격 및 30-60μm의 z-stack 범위(해당되는 경우)를 사용했으며, 평면 간 간격은 10μm(하나의 세포층)입니다. 자세한 이미징 설정은 그림 6 을 참조하십시오.알림: 최상의 해상도와 최대 면적을 얻기 위해 이미징 매개변수를 설정하되 샘플의 표백을 피하십시오. 이미징을 시작하고 실험에 따라 용액 유입을 전환합니다. 완료되면 절편을 수집하여 면역조직화학을 위해 고정합니다.

Representative Results

프로토콜이 성공적으로 실행되면 1g의 췌장 조직에서 약 100-200개의 절편이 생성됩니다. 그 후, 이러한 슬라이스는 기능 평가를 진행하기 전에 섬이 풍부한 슬라이스를 식별하기 위해 실체현미경 검사를 받아야 합니다. 플루오레세인 다이아세테이트(FDA) 및 프로피듐 요오드화물(PI)로 라벨링하여 결정된 생존율은 80%-90%에 이를 것으로 예상됩니다(그림 2A). 생존력은 슬라이싱 공정 중 셀 손상으로 인해 절단 표면에서 현저히 낮을 수 있습니다. 생존 가능한 절편에서 동적 호르몬 분비(그림 2B)가 관찰되어 고포도당에 노출되고 염화칼륨(KCl)으로 막이 탈분극될 때 강력한 인슐린 방출이 발생합니다. 반대로, 슬라이싱 절차 중에 지연이 있거나 조직 품질이 최적이 아닌 경우 결과가 크게 달라집니다. 얻어진 절편의 수가 감소할 수 있으며, 생존도 평가는 PI로 표지된 비생존 세포의 비율이 더 높을 수 있음을 나타낼 수 있습니다(그림 2C). 이러한 경우, 기능 평가는 고포도당 및 막 탈분극에 대한 반응이 감소하거나 아예 없는 것으로 나타냅니다(그림 2D). 최적이 아닌 실험의 데이터는 적시에 정확한 실행과 조직 품질의 중요성을 보여주며, 이는 조직 생존력을 감소시키고 기능을 손상시킬 수 있습니다. 이러한 부정적인 결과는 이 방법의 성공을 위해 고려해야 할 중요한 요소를 상기시키는 귀중한 역할을 합니다. 칼슘 이미징의 일반적인 결과는 그림 5D와 같이 히트 맵으로 시각화되거나 그림 5E와 같이 개별 세포에 대한 별도의 추적으로 시각화됩니다. 염료는 모든 세포 유형을 무차별적으로 표지하므로 반응에 따라 세포를 구별하기 위해 특정 자극이 필수적이라는 점을 강조하는 것이 중요합니다. 생존 가능한 세포를 식별하기 위해 KCl을 사용하고 평균 기준선 반응을 두 개 이상의 표준 오차로 초과하는 반응을 기준으로 세포를 정렬합니다. 또한 절편을 고정하고 염색할 수 있어 세포 유형을 식별할 수 있습니다. 그림 1: 조직 가공 및 슬라이싱. (A) 처리되지 않은 췌장 조직 1g. (B) 아가로스 삽입을 위해 세척된 췌장 조각. (C) 바이브라톰을 사용한 슬라이싱 절차. (D) 갓 자른 인간의 췌장 조각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 조직 생존율 및 인슐린 분비 데이터. (A) 생존 가능한 조직 절편의 대표 이미지. 반사된 레이저 광(회색, 왼쪽 상단), 죽은 세포에 대한 PI(빨간색, 왼쪽 하단), 살아있는 세포에 대한 FDA(녹색, 오른쪽 하단), 살아있는 세포와 죽은 세포에 대한 병합 이미지(오른쪽 상단)의 최대 강도 투영. 점선은 섬을 나타냅니다. 눈금 막대 50 μm. (B) 당뇨병이 없는 단일 기증자로부터 인간 췌장 조직 절편의 동적 인슐린 분비. 인슐린 동역학은 고혈당 자극 6분 후 첫 번째 단계 피크 반응을 보인 후 정체기 두 번째 단계를 보여줍니다. 데이터는 5.5mM 포도당에서 평균 기준선 분비량으로 정규화됩니다(자극 지수, 접힘 변화). (A)와 같이 동일한 기증자의 절편에 대해 분비가 수행되었습니다. (C) 생존 불가능한 조직 절편에 대한 대표 이미지. 반사된 레이저 광(회색, 왼쪽 상단), 죽은 세포에 대한 PI(빨간색, 왼쪽 하단), 살아있는 세포에 대한 FDA(녹색, 오른쪽 하단), 살아있는 세포와 죽은 세포에 대한 병합 이미지(오른쪽 상단)의 최대 강도 투영. 점선은 섬을 나타냅니다. 눈금 막대 50 μm. (D) 당뇨병이 없는 단일 기증자로부터 인간 췌장 조직 절편의 동적 인슐린 분비. 인슐린 역학은 KCl에 의한 포도당 자극 인슐린 분비와 막 탈분극의 명확한 손실을 보여줍니다. 데이터는 5.5mM 포도당에서 평균 기준선 분비량으로 정규화됩니다(자극 지수, 접힘 변화). 분비는 (C)와 같이 동일한 기증자로부터의 절편에서 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 동적 주융을 위한 조직 로딩. (A) 적층형 슬라이스 챔버. 개별 슬라이스는 인서트에 표시된 대로 금속 그리드에 로드됩니다. (B) 섬 챔버에 고립된 섬을 적재합니다. perifusion 기계에 연결된 슬라이스 및 아일릿 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 단편 및 고립된 섬에서의 호르몬 분비. 패널 (A) 및 (B)에 표시된 데이터는 패널 (C) 및 (D)와 비교하여 다른 기증자로부터 얻은 것입니다. (A) 당뇨병이 없는 한 명의 기증자의 췌장 조직 절편 3개에서 절대 호르몬 분비. 인슐린 분비는 녹색으로, 글루카곤 분비는 자홍색으로 표시됩니다. (B) (A)에 표시된 호르몬 분비는 총 호르몬 함량 (함량의 %)으로 정규화됩니다. 함량은 실험에 사용된 3개의 슬라이스 모두에서 측정됩니다. (C) 동일한 비당뇨병 기증자로부터 고립된 섬(100개 섬) 및 췌장 조직 절편(3개 절편)의 동적 인슐린 분비. 데이터는 절대 숫자(mU/L)로 표시됩니다. (D) (C)에 표시된 인슐린 분비는 총 인슐린 함량(함량의 %)으로 정규화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 이미징 설정 및 예상 결과. (A) 정립 컨포칼 현미경을 사용한 기능적 이미징 설정 및 융합 주변 설정. (B) 유입 및 유출에 연결된 이미징 챔버. (C) 반사광(위)과 Fluo4 신호(아래)를 보여주는 건강한 인간 기증자의 조직 절편 내 섬의 컨포칼 이미지 Z 스택. 반사는 슬라이스(점선) 내의 섬을 식별하는 데 사용됩니다. (D) 5.5mM 포도당에서 기저 신호 강도로 정규화된 Fluo4의 형광 강도와 높은 포도당(16.7mM)으로 자극으로 표현되는 섬 세포의 시험관 내 Ca2+ 역학을 보여주는 히트맵. 각 행은 x축에서 시간이 지남에 따라 단일 셀을 나타내며 색상 척도에 표시된 기준선(dF/F)에 대한 형광 강도의 크기 변화(%)에 대한 응답은 파란색(낮은 강도)에서 빨간색(높은 강도)까지 표시됩니다. (E) 고포도당에 대한 반응을 보이는 4개의 개별 세포의 대표적인 흔적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 칼슘 이미징 설정. 40μm(XYZT 이미징)의 타임랩스 녹화를 수행하기 위해 선택한 대표 설정의 소프트웨어 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

여기에서는 생존 가능한 췌장 조직 절편을 생성하고 동적 호르몬 분비 및 기능 이미징과 같은 기능적 판독을 위한 사용을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인간 섬 분리와 유사하게, 절편 절차의 성공은 기증자 특성, 조직 운송 시간 및 조직 품질을 포함한 다양한 요인에 의해 영향을 받는다^25,29. 따라서 실험을 위한 조직 샘플을 신중하게 선택하고 허혈 시간을 최소한으로 유지하는 것이 중요합니다. 이러한 맥락에서, 사체 기증자 외에 인간 조직의 다른 잠재적 출처를 신중하게 고려해야 한다. 수술 기증자를 포함하면 기능적 절편 데이터를 동일한 환자의 관련 in vivo 정보와 결합할 수 있는 옵션이 제공되어 번역 관련성이 강화됩니다¹¹. 그러나 이 조직 공급원은 일반적으로 국소 종양으로 인해 췌장 절제술을 받는 고령 환자로부터 생검을 받기 때문에 다른 요인을 가져옵니다. 특히, 췌장 생검은 당뇨병과 관련하여 수행되지 않습니다.

실제 슬라이싱 절차를 수행할 때 적시에 조직을 처리하는 것이 중요합니다. 절편은 이 프로토콜에 설명된 대로 몇 시간 동안 보관하거나 Qadir et ^al.19에 설명된 대로 장기간 배양할 수 있습니다. 현재로서는 이 프로토콜이 장기간에 걸쳐 절편 생존력을 유지할 수 있는 유일한 방법이지만, 향후 노력은 다양한 배양 시간에 걸친 기능적 변화를 평가하고 동일한 공여체의 고립된 섬과 비교해야 합니다.

이 과정에서 가장 중요한 단계는 아가로스에 삽입하기 전에 신중한 조직 준비입니다. 큰 덕트와 섬유화 조직은 슬라이싱 과정을 복잡하게 만들 수 있으며 잠재적으로 아가로스에서 조직 블록이 떨어져 나올 수 있습니다. 이 문제가 발생하고 조각이 적절한 크기로 유지되면 슬라이싱을 위해 다시 처리하고 포함할 수 있습니다. 좋은 조직 품질과 세심한 가공을 유지하면 슬라이싱 절차의 효율성이 크게 향상되고 슬라이스의 최대량과 품질을 얻을 수 있습니다. 조직 준비에서 절편 생성까지 경과된 시간은 2-3시간을 초과해서는 안 되며, 간격이 길면 조직 생존력에 큰 영향을 미칩니다.

slice perifusion 동안 간단하지만 중요한 단계는 챔버에 완벽하게 맞도록 slice를 정밀하게 트리밍하는 것입니다. 이를 통해 조직의 적절한 목욕과 중단 없는 흐름이 가능합니다. 프로토콜이 시작되면 호르몬 방출의 원치 않는 급증을 방지하기 위해 챔버의 추가 조작을 피하는 것이 중요합니다. 충분한 완충액을 준비해야 하며, 공기 흡입 및 챔버 건조를 방지하기 위해 튜브가 용액 바닥에 도달해야 합니다.

칼슘 이미징의 경우 실험적 요구와 설계에 따라 관심 영역을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 빛 노출을 줄이거나 전체 프로토콜 시간을 단축하는 이미징 매개변수를 선택하여 광표백을 최소화하는 것이 중요합니다. 동적 호르몬 분비와 마찬가지로 적절한 용액 흐름과 가열된 설정을 유지하는 것이 중요한데, 이는 절편이 최적의 기능을 위해 거의 생리학적 조건(예: 37°C)을 필요로 하기 때문입니다.

췌장 조직 절편은 췌장의 구조적 무결성을 효과적으로 유지하여 다양한 세포 유형 간의 세포 간 연결을 보존합니다. 결과적으로, 그들은 고립된 섬과 함께 작업하는 것에 대한 대안을 제공하여 내분비 및 외분비 기능과 그들의 상호 작용에 대한 동시 탐색을 용이하게 합니다. 개별 세포 유형의 상호 작용을 평가하려면 세포 유형을 구별하는 것이 중요합니다. 사후 염색도 한 가지 옵션이지만, 사용 가능한 형광 프로브와 정확한 세포층을 찾는 데 어려움이 있다는 점에서 한계가 있습니다. 따라서, 반응에 기초한 세포 구별을 가능하게 하기 위해 세포 특이적 자극을 프로토콜에 통합하는 것이 바람직하다. 생쥐 또는 인간 절편의 세포 유형을 구별하기 위해 효과적인 자극에는 알파 세포^21,30에 대한 아드레날린, 델타 세포³¹에 대한 그렐린, 아시나 세포 ^5,32에 대한 세룰린, 유관 세포³³에 대한 담즙산, 혈관 세포²²에 대한 노르에피네프린이 포함됩니다. 분비 반응을 측정하기 위해 유사한 자극을 사용할 수 있습니다. 이미징 연구는 개별 세포에 초점을 맞추는 반면, 분비 연구는 집단 반응을 분석합니다. 따라서 원하는 결과를 감지하기 위해 충분한 수의 슬라이스를 포함하는 것이 중요합니다. 최적의 양은 세포 유형에 따라 다를 수 있으며, 내분비 세포에 충분한 것으로 입증된 세 조각이 있습니다. 그러나 중요한 정보가 누락될 위험이 있는 것보다 검색 가능성을 보장하기 위해 더 많은 조각을 사용하는 것이 좋습니다.

다른 방법과 마찬가지로 조직 절편에는 결과를 해석할 때 고려해야 하는 제한 사항이 있습니다. 특정 세포 유형을 표적으로 하는 자극 적용은 slice의 다른 세포 유형에 영향을 미칠 수 있으며, 잠재적으로 피드백 루프를 트리거할 수 있습니다. 그러나 이러한 것들 또한 연구하는 것이 중요하므로 측정된 반응은 생리적 반응을 더 잘 나타낼 수 있습니다. 선택적 세포 표적화를 위해 기존의 in vitro 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 중요한 것은 아시나 세포에는 단백질을 분해하고 조직 절편을 소화할 수 있는 췌장 효소가 포함되어 있어 몇 시간 내에 세포가 분해된다는 것입니다. 생존력을 유지하기 위해서는, 트립신 억제제의 적용이 라벨링 목적으로 사용되는 바이러스의 성공적인 전달을 방해할 수 있더라도 절편이 정적 상태에 있을 때 트립신 억제제의 일관된 사용이 필수적입니다.

섬 분리와 비교했을 때, 공여체 변동성과 조직 품질은 얻어진 절편의 양과 생존력 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이싱 후 생존력이 충분하지 않으면 수명이 짧아지고 슬라이스를 배양하는 능력이 저하될 수 있습니다. 또한, 섬 수는 기증자에 따라 크게 다를 수 있으므로 실험을 수행하기 전에 섬 함량을 추정하기가 어렵습니다. 결과적으로, 기증자 수용 기준을 신중하게 선택하고 분비 또는 기준선으로의 접힘 변화에 대한 호르몬 함량의 비율과 같은 적절한 정규화 방법의 구현이 중요합니다. 일관된 결과를 얻으려면 실험 전에 조직 절편 생존력을 평가하는 것이 좋습니다. 또한 관련 제어 자극(예: KCl)을 실험에 통합하는 것이 권장됩니다. 이미징과 같은 개별 세포 분석의 경우, 이러한 제어 자극에 대한 반응을 기반으로 세포를 사전 분류하는 방법을 구현할 수 있습니다. 언급된 어려움에도 불구하고 슬라이스는 현재 연구 방법에 귀중한 보강을 제공합니다.

설명된 프로토콜은 여러 응용 분야의 시작점으로 사용할 수 있으며, 췌장 절편을 조작하고 다양한 자극 후 반응을 검사할 수 있습니다. 또한 쥐 또는 인간의 췌장 절편을 활용한 수많은 연구 조사로 독자를 안내하여 실험을 계획하는 사람들에게 귀중한 통찰력을 제공합니다. 미래에는 췌장 절편을 사용하여 잠재적인 치료법을 조사하거나 질병 메커니즘을 모델링할 수 있습니다.

Materials

Alanine	Sigma	A7627	amino acid
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig	Invitrogen	A11073	secondary antibody
AlexaFluor 546 goat anti-rat	Thermo Fisher	A11077	secondary antibody
AlexaFluor 647 goat anti-mouse	Thermo Fisher	A21235	secondary antibody
Aprotinin	Sigma	A1153	inhibitor
Arginine	Sigma	A5006	amino acid
Calbryte 520 AM	AAT Bioquest	20651	Calcium dye
Fluo4-AM	Invitrogen	F14201	Calcium dye
Fluorescein diacetat	Sigma	F7378	viability marker
Glucagon	Sigma	G2654	primary antibody
Glucagon ELISA (human kit)	Mercodia	10-1271-01	ELISA for hormone detection
Glutamine	Sigma	G3126	amino acid
Insulin	Dako	A-0546	primary antibody
Insulin ELISA (human)	Mercodia	10-1113-01	ELISA for hormone detection
Low melting point agarose	Sigma	A9414
LSM 900	Zeiss		confocal microscope
Pancreas Slice Chamber	Biorep Technologies	PERI-PSC-001	slice chamber for perifucion
Pancreas Slice Chamber Extender Kit	Biorep Technologies	PERI-PSC-EXT	slice chamber for perifucion
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate	Biorep Technologies	PERI-PSC-PP	slice chamber for perifucion
Perifusion system with automated tray handling	Biorep Technologies	PERI4-02-230-FA
Propidium iodide	Life technologies	P1304MP	dead marker
Semi-automatic vibratome VT1200S	Leica	14048142066
Somatostatin	Millipore	MAB354	primary antibody