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Immunology and Infection

एसिनेटोबैक्टर बाउमानी में मल्टीड्रग एफ्लक्स सिस्टम की विशेषता एक एफ्लक्स-कमी वाले जीवाणु तनाव और एकल-प्रतिलिपि जीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करना

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66471
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, University of Manitoba

Summary

हम एसिनेटोबैक्टर बाउमनी के एक इंजीनियर इफ्लक्स-कमी वाले तनाव में मिनी-टीएन 7-आधारित अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके एक प्रवाह पंप जीन के एकल-प्रतिलिपि गुणसूत्र पूरक के लिए एक आसान प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। यह सटीक आनुवंशिक उपकरण नियंत्रित जीन अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है, जो मल्टीड्रग प्रतिरोधी रोगजनकों में एफ्लक्स पंपों के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है।

Abstract

एसिनेटोबैक्टर बाउमानी को एंटीबायोटिक दवाओं के व्यापक प्रतिरोध के कारण एक चुनौतीपूर्ण ग्राम-नकारात्मक रोगज़नक़ के रूप में पहचाना जाता है। नए और प्रभावी चिकित्सीय विकल्पों को डिजाइन करने के लिए इस प्रतिरोध के पीछे के तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है। दुर्भाग्य से, ए बाउमनी में इन तंत्रों की जांच करने की हमारी क्षमता उपयुक्त आनुवंशिक हेरफेर उपकरणों की कमी से बाधित है। यहां, हम ए बाउमनी स्ट्रेन में सिंगल-कॉपी जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए क्रोमोसोमल मिनी-टीएन 7-आधारित प्रणाली का उपयोग करने के तरीकों का वर्णन करते हैं जिसमें कार्यात्मक आरएनडी-प्रकार के प्रवाह तंत्र का अभाव होता है। सिंगल-कॉपी इंसर्शन और इंड्यूसिबल एफ्लक्स पंप एक्सप्रेशन काफी फायदेमंद होते हैं, क्योंकि हाई-कॉपी नंबर प्लास्मिड पर आरएनडी एफ्लक्स ऑपेरॉन की उपस्थिति अक्सर बैक्टीरिया कोशिकाओं द्वारा खराब सहन की जाती है। इसके अलावा, बढ़ी हुई प्रवाह संवेदनशीलता के साथ सरोगेट ए बाउमनी होस्ट के गुणसूत्र में पुनः संयोजक मिनी-टीएन 7 अभिव्यक्ति वैक्टर को शामिल करने से अन्य प्रवाह पंपों से हस्तक्षेप को रोकने में मदद मिलती है। यह प्रणाली न केवल अनियंत्रित बैक्टीरियल एफ्लक्स पंपों की जांच के लिए बल्कि इन पंपों को लक्षित करने वाले संभावित अवरोधकों की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए भी मूल्यवान है।

Introduction

एसिनेटोबैक्टर बाउमानी एक विश्व स्वास्थ्य संगठन है जो एंटीबायोटिक दवाओं के सभी वर्गों के प्रतिरोध को शामिल करने के कारण एक विश्व स्वास्थ्य संगठन की सर्वोच्च प्राथमिकता वाला रोगज़नक़है 1. यह एक अवसरवादी रोगज़नक़ है जो ज्यादातर अस्पताल में भर्ती होने, घायल या प्रतिरक्षाविज्ञानी लोगों को प्रभावित करता है। A. baumannii बड़े पैमाने पर बहिष्करण पंपों के माध्यम से एंटीबायोटिक दवाओं से बचता है, सबसे अधिक प्रासंगिक निर्यातकों का प्रतिरोध-नोड्यूलेशन-डिवीजन (RND) परिवार है2. यह समझना कि ये प्रवाह पंप यांत्रिक रूप से कैसे काम करते हैं, किसी को लक्षित चिकित्सीय विकल्प विकसित करने की अनुमति देगा।

एक सामान्य तरीका है कि सेलुलर प्रक्रियाओं को विशेष रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से है। हालांकि, ए बाउमनी आनुवंशिक अध्ययन के लिए उपलब्ध उपकरण सीमित हैं, और आगे प्रयोगात्मक डिजाइन को भ्रमित करने के लिए, नैदानिक आइसोलेट्स अक्सर आनुवंशिक जोड़तोड़3 में चयन के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोधी होते हैं। विशेष रूप से एफ्लक्स पंपों का अध्ययन करते समय एक दूसरी बाधा का सामना करना पड़ा है कि वे सख्ती से विनियमित होते हैं-अक्सर अज्ञात कारकों द्वारा-यह मुश्किल को अलग करना और एक पंप4 के लिए फ़ंक्शन को विशेषता देना मुश्किल बनाता है। अनुसंधान टूलबॉक्स का विस्तार करने की इस आवश्यकता को देखते हुए, हमने एक मिनी-टीएन 7-आधारित, एकल-प्रतिलिपि-सम्मिलन, इंड्यूसिबल अभिव्यक्ति प्रणाली विकसित की है जिसमें एफएलपी रीकॉम्बिनेज लक्ष्य (एफआरटी) कैसेट शामिल है, जो चयन मार्कर 5,6,7 (चित्रा 1) को हटाने की अनुमति देता है। पहली बार स्यूडोमोनास 8,9,10 के लिए बनाया गया था, इस सुरुचिपूर्ण क्लोनिंग और अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग सिंगल-कॉपी एफ्लक्स पंप पूरक को आरएनडी एफ्लक्स पंप-कमी वाले तनाव में उत्पन्न करने के लिए किया गया था A. baumannii (ATCC 17978::ΔadeIJK, ΔadeFGH, Δ adeAB: इसके बाद A. baumannii AB258 के रूप में संदर्भित) जिसे हमने11 उत्पन्न किया था. एक समय में एक प्रवाह पंप का अध्ययन करने में सक्षम होने के नाते और उच्च प्रतिलिपि अभिव्यक्ति (जैसा कि आमतौर पर प्लास्मिड-आधारित अभिव्यक्ति प्रणालियों के साथ देखा जाता है) के साथ बैक्टीरिया कोशिकाओं को अभिभूत नहीं किया जाता है, कोई भी न्यूनतम हस्तक्षेप और कम जटिलताओं के साथ प्रत्येक प्रवाह पंप के महत्वपूर्ण, शारीरिक पहलुओं के बारे में बेहतर जान सकता है।

यह लेख बताता है कि7 दिनों के दौरान किए गए सरल चरणों की एक श्रृंखला के माध्यम से A. baumannii AB258 के गुणसूत्र में ब्याज की हटाए गए जीन, RND एफ्लक्स पंप adeIJK के पूरक के लिए मिनी-Tn7 प्रणाली का उपयोग कैसे करें। चरणों का पहला सेट अच्छी तरह से संरक्षित जीएलएमएस जीन(चित्रा 3ए)के डाउनस्ट्रीममें मिनी-टीएन7-आधारित सम्मिलन प्लाज्मिड(चित्रा 2ए)में क्लोन किए गए हटाए गए एफ्लक्स पंप जीन को फिर से पेश करता है। इस प्रक्रिया को एक गैर-प्रतिकृति सहायक प्लाज्मिड(चित्रा 2बी)द्वारा सुगम बनाया जाता है जो टीएन7-संचालित सम्मिलन के लिए आवश्यक ट्रांसपोसेज़ जीन के लिए एन्कोड करता है। चरणों का दूसरा सेट एक अचिह्नित तनाव बनाने के लिए एफआरटी साइटों (चित्रा 3बी) द्वारा फ्लैंक किए गए जेंटामाइसिन जीन के एफएलपी पुन: संयोजन-मध्यस्थता हटाने के लिए एक छांटना प्लाज्मिड(चित्रा 2सी)का उपयोग करता है। यद्यपि इस प्रणाली का उपयोग एंटीबायोटिक प्रतिरोध के संबंध में आरएनडी प्रवाह पंपों की आवश्यक भूमिकाओं और संभावित अवरोधकों को स्पष्ट करने के लिए किया जाता है, इसका उपयोग ब्याज के किसी भी जीन की जांच के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. प्रायोगिक तैयारी

  1. प्लाज्मिड pUC18T-मिनी-Tn7T-LAC-जीएम9 (सम्मिलन प्लाज्मिड, चित्रा 2A) को ब्याज के जीन के साथ शुद्ध करें।
    नोट: यहाँ, ब्याज की जीन adeIJK है। अंतिम प्लाज्मिड एकाग्रता ≥ 100 एनजी /
  2. हेल्पर प्लाज्मिड(पीटीएनएस2)9 और एक्सिशन प्लाज्मिड(पीएफएलपी2एबी)6(चित्रा 2बी,सी,क्रमशः)को शुद्ध करें, आदर्श रूप से ≥100 एनजी/माइक्रोन की अंतिम प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता के लिए।
  3. बाँझ ultrapure पानी के 50 एमएल और बाँझ पौंड (लेनोक्स) शोरबा के 25 एमएल तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें).
  4. कम से कम 10 पौंड अगर प्लेटें तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक में निम्नलिखित योजक हों: सादा (कोई योजक नहीं), 50 माइक्रोग्राम/एमएल पर जेंटामाइसिन (जीएम), 200 माइक्रोग्राम/एमएल पर कार्बेनिसिलिन (सीबी) (एम्पीसिलीन प्रतिरोध जीन के माध्यम से चयन के लिए), और 5% सुक्रोज ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. एलबी अगर पर सम्मिलन के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला तनाव बाहर लकीर और 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। यहाँ, A. baumannii AB258 प्रयोग किया जाता है.
    नोट: इस प्रोटोकॉल को बेंच या जैविक सुरक्षा कैबिनेट पर बन्सन बर्नर का उपयोग करके जितना संभव हो सके बाँझ वातावरण में किया जाना चाहिए। सभी उपभोग्य सामग्रियों (विंदुक युक्तियाँ, इनोक्यूलेटिंग लूप, माइक्रोफ्यूज ट्यूब, आदि) को बाँझ होने की आवश्यकता है।

2. संस्कृति की तैयारी

  1. एक बाँझ टीका पाश या बाँझ लकड़ी inoculating छड़ी का उपयोग कर एक बाँझ 13 एमएल संस्कृति ट्यूब में एलबी शोरबा के 4 एमएल में A . baumannii AB258 की एक एकल कॉलोनी टीका लगाना.
    नोट: एक एकल 4 एमएल संस्कृति का उपयोग एक नमूना और एक नियंत्रण के लिए किया जाता है। आवश्यक नमूनों की संख्या के आधार पर संस्कृतियों की संख्या में वृद्धि।
  2. झटकों (250 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं.
  3. चरण 3 में उपयोग के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ आसुत जल (25-50 एमएल) की एक बोतल रखें।

3. इलेक्ट्रोकोम्पीटेंट कोशिकाओं की तैयारी

  1. बर्फ पर सभी बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब (संस्कृति प्रति दो) और बाँझ electroporation क्यूवेट (संस्कृति प्रति दो) रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)। प्रक्रिया के दौरान जितना संभव हो बर्फ पर नमूने रखें.
  2. बाँझ पानी की बोतल रखें जो बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
  3. रातोंरात जीवाणु संस्कृति के 1.5 एमएल को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में से एक में स्थानांतरित करें।
  4. कोशिकाओं को गोली देने के लिए 2 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन आदर्श रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाएगा, लेकिन परिवेश का तापमान सेंट्रीफ्यूजेशन स्वीकार्य है और हानिकारक नहीं है।
  5. एक 1 एमएल विंदुक का प्रयोग, सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला के सभी हटा दें.
  6. एक ही माइक्रोफ्यूज ट्यूब में बैक्टीरिया संस्कृति का एक और 1.5 एमएल जोड़ें। 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, तो सतह पर तैरनेवाला के सभी हटा दें.
  7. संस्कृति के शेष 1 एमएल के साथ चरण 3.6 एक अंतिम बार दोहराएं।
  8. सेल गोली के लिए बर्फ ठंडा बाँझ पानी के 1 एमएल जोड़ें और कोमल पाइपिंग के साथ फिर से निलंबित जब तक गोली अब माइक्रोफ्यूज ट्यूब के तल पर बैठता है.
  9. 2 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर पुन: निलंबित कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें।
  10. ध्यान से एक 1 एमएल विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला हटा दें. सतह पर तैरनेवाला डालना मत करो, विशेष रूप से बाद धोने के चरणों में जब कोशिकाओं को कम कॉम्पैक्ट छर्रों फार्म करते हैं.
  11. बर्फ-ठंडे बाँझ पानी के साथ इस धोने के चरण को दोहराएं, चरण 3.8 से चरण 3.10, दो बार और।
  12. धीरे बर्फ ठंडा बाँझ पानी के 200 माइक्रोन में अंतिम सेल गोली resuspend.
  13. अंतिम सेल निलंबन के 100 माइक्रोन को दूसरी बर्फ-ठंडी 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। यह दूसरा विभाज्य इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए नकारात्मक नियंत्रण बन जाएगा। बर्फ पर सेल के नमूने रखें.

4. इलेक्ट्रोपोरेशन

  1. एलबी शोरबा के पूर्व गर्म 1 एमएल और एक एलबी + जीएम50 अगर प्लेट (चरण 1.4 में तैयार) प्रत्येक नमूने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थिर इनक्यूबेटर में नियंत्रण के लिए।
  2. 5 माइक्रोन या उससे कम की संयुक्त मात्रा में, पीटीएनएस 2 हेल्पर प्लाज्मिड और पीयूसी 18 टी-मिनी-टीएन 7 टी-एलएसी-जीएम-एडीआईजेके सम्मिलन प्लाज्मिड में से प्रत्येक को इलेक्ट्रोकोम्पेटेंट कोशिकाओं के विभाज्य में 100-200 एनजी जोड़ें।
  3. बुलबुले शुरू करने के बिना electrocompetent कोशिकाओं के साथ प्लास्मिड का पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए कोमल उंगलियों दोहन के साथ मिश्रण.
  4. नकारात्मक नियंत्रण सेल विभाज्य में बाँझ आसुत जल के बराबर मात्रा जोड़ें और ऊपर के रूप में धीरे मिश्रण.
  5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं.
  6. एक बर्फ ठंड electroporation क्यूवेट में पूरे सेल नमूना स्थानांतरण, तो बर्फ पर वापस क्युवेट जगह है. नकारात्मक नियंत्रण सेल नमूने के लिए दोहराएँ.
  7. सेल के नमूने को इलेक्ट्रोपोरेट करें।
    1. इलेक्ट्रोपोरेटर चालू करें और इसे 2.0 केवी (25 माइक्रोन, 200 Ω) पर सेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. किसी भी पालन बर्फ या नमी को हटाने के लिए एक नरम ऊतक के साथ क्युवेट की सतह को पोंछें।
    3. इलेक्ट्रोपोरेटर में क्युवेट डालें और बिजली का झटका दें।
    4. तुरंत क्युवेट में कोशिकाओं के लिए पूर्व गर्म एलबी शोरबा के 0.9 एमएल जोड़ने के लिए और धीरे ऊपर और नीचे विंदुक मीडिया के साथ कोशिकाओं को मिश्रण करने के लिए.
    5. पूरे सेल निलंबन को एक नई 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब (कमरे के तापमान) में स्थानांतरित करें।
    6. इलेक्ट्रोपोरेटर पर समय स्थिर मूल्य की जाँच करें; सर्वोत्तम परिणामों के लिए, यह मान 4 और 6 के बीच होना चाहिए।
  8. नकारात्मक नियंत्रण सेल नमूने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया (चरण 4.7.1 से चरण 4.7.6) दोहराएं।
  9. सेल वसूली के लिए अनुमति देने के लिए 250 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इलेक्ट्रोपोरेटेड नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  10. एक टीका स्प्रेडर का प्रयोग, एक पूर्व गर्म एलबी + जीएम50 अगर प्लेट पर प्रत्येक electroporated सेल नमूना के 100 माइक्रोन फैला.
    1. कोशिकाओं को गोली करने के लिए 2 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर शेष नमूनों को अपकेंद्रित्र करें।
    2. एक विंदुक का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला के सभी को हटाने के बाद, एलबी शोरबा के 100 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    3. प्रत्येक पूरे नमूने को अलग-अलग पूर्व-गर्म एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों पर फैलाएं।
      नोट: इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता तनाव-निर्भर हो सकती है। पहली बार एक तनाव electroporating जब, यह अलग मात्रा में थाली के लिए जानकारीपूर्ण हो सकता है, या यहां तक कि dilutions, electroporation नमूना के जिसके परिणामस्वरूप प्लेटों अलग कालोनियों है सुनिश्चित करने के लिए.
  11. 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

5. पीसीआर आधारित स्क्रीनिंग के लिए रूपांतरित कॉलोनियों का चयन

  1. इलेक्ट्रोपोरेशन प्लेटों की जाँच करें। नकारात्मक नियंत्रण में कोई उपनिवेश नहीं होना चाहिए; नमूने में अलग-अलग कॉलोनियां होनी चाहिए।
    नोट: कालोनियों के साथ प्लेटें, इस कदम पर और बाद के सभी चरणों में जहां कालोनियों या पैच के साथ अगर प्लेटें उत्पादित होती हैं, आगे बढ़ने से पहले 3 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. बाँझ टूथपिक्स का प्रयोग, एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों से 10 एकल कालोनियों लेने के लिए और एक ताजा पौंड + जीएम50 अगर प्लेट पर उन्हें पैच.
  3. 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

6. कॉलोनी पीसीआर द्वारा गुणसूत्र सम्मिलन की पुष्टि

  1. इनक्यूबेटर से पैच कालोनियों युक्त एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों निकालें.
  2. एक बाँझ टूथपिक या बाँझ विंदुक टिप का प्रयोग, एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में बाँझ आसुत जल के 20 माइक्रोन में एक पैच से एक छोटे से हिस्से (एक बड़ी कॉलोनी के आकार के बारे में) निकालें; अच्छी तरह मिलाएं। पानी का नमूना स्पष्ट रूप से बादल बन जाना चाहिए क्योंकि कोशिकाएं टूथपिक से मुक्त हो जाती हैं। किसी भी संख्या में नमूने तैयार करें जिन्हें जांच करने की आवश्यकता है, लेकिन 6 पर्याप्त होना चाहिए।
  3. 5-10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरियल निलंबन युक्त पीसीआर ट्यूब सेते हैं।
  4. एक मिनी अपकेंद्रित्र ( सामग्री की तालिकादेखें) का प्रयोग, गोली सेलुलर मलबे के लिए 2 मिनट के लिए निश्चित अधिकतम गति पर नमूना स्पिन.
  5. सतह पर तैरनेवाला एक नया 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब के लिए स्थानांतरण और बर्फ पर जगह है. इस नमूने में पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट डीएनए शामिल है।
    नोट: इस टेम्पलेट डीएनए पीसीआर के साथ आगे बढ़ने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  6. 1x पोलीमरेज़ बफर, 200 माइक्रोन डीएनटीपी, 0.18 माइक्रोन ABglmS2_F_New फॉरवर्ड प्राइमर, 0.18 माइक्रोन टीएन7आर रिवर्स प्राइमर(तालिका 1), टाक डीएनए पोलीमरेज़ के 1 यू, और 25 माइक्रोन की कुल मात्रा में तैयार टेम्पलेट डीएनए के 1 माइक्रोन युक्त एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। टेम्पलेट डीएनए ( सामग्री की तालिकादेखें) सहित सभी सहित एक नो-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) तैयार करें।
  7. एक थर्मल चक्रक में प्रतिक्रिया की स्थिति दर्ज करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 49 डिग्री सेल्सियस, और कुल 35 चक्रों के लिए 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 12 डिग्री सेल्सियस पकड़। नमूने चलाएं।
  8. 1x की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए लोडिंग डाई के अलावा, 2% अगारोज जेल पर प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के 10 माइक्रोन लोड करें और 40 मिन के लिए 80 वी पर चलाएं। इस प्राइमर जोड़ी के लिए अपेक्षित amplicon आकार 382 बीपी है। एनटीसी में कोई बैंड नहीं होना चाहिए।
  9. उन नमूनों की पहचान करें जिन्होंने अपेक्षित पीसीआर उत्पाद का उत्पादन किया। पीसीआर पॉजिटिव पैच में से किसी से एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों पर एक लकीर प्लेट तैयार करें; 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। लक्ष्य इस चिह्नित तनाव को संरक्षित करने के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक की तैयारी के लिए एकल कालोनियों के साथ एक प्लेट उत्पन्न करना है और एक अचिह्नित तनाव (नीचे वर्णित) बनाने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में।

7.pFLP2 ab का उपयोग करके जीएमआर मार्कर को हटाना

  1. चरण 2 में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें: संस्कृति की तैयारी। रातोंरात संस्कृति तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया नमूना एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों कदम 6.9 में असतत कालोनियों उत्पन्न करने के लिए तैयार से एक एकल कॉलोनी है.
  2. चरण 3 में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें: इलेक्ट्रोकोम्पीटेंट कोशिकाओं की तैयारी। इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए रातोंरात संस्कृति से कोशिकाओं को तैयार करें।
  3. चरण 4 में उल्लिखित प्रक्रिया का पालन करें: इलेक्ट्रोपोरेशन। यहां, कोशिकाओं को पेश करने के लिए प्लास्मिड pFLP2ab (100-200 एनजी) है, जो जेंटामाइसिन प्रतिरोध जीन को हटा देगा, क्रोमोसोमली रूप से डाली गई जीन को ब्याज की ओर ले जाएगा।
  4. कोशिकाओं को 1 घंटे (चरण 4.9) के लिए बरामद किया गया है के बाद, एक पूर्व गर्म पौंड + सीबी200 अगर प्लेट (कदम 1.4 में तैयार) पर electroporated सेल नमूना के 100 माइक्रोन फैला. यह चयनात्मक दबाव सुनिश्चित करता है कि केवल pFLP2ab छांटना प्लाज्मिड को परेशान करने वाली कोशिकाएं बढ़ेंगी।
  5. 16-18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  6. कॉलोनियों के लिए प्लेट की जाँच करें। नकारात्मक नियंत्रण प्लेट में कोई कालोनियां नहीं होनी चाहिए; एलबी + सीबी200 अगर नमूना प्लेट अलग कालोनियों होना चाहिए.
  7. बाँझ टूथपिक्स का उपयोग करना, एक एलबी + सीबी200 अगर प्लेट और एक एलबी + जीएम50 अगर प्लेट पर 20 पृथक कालोनियों तक क्रॉस-पैच करें।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  9. पैच के लिए प्लेटों की जाँच करें। एलबी + सीबी200 अगर प्लेट पर बढ़ने वाले क्लोन लेकिन एलबी + जीएम50 अगर प्लेट में मूल डालने से जेंटामाइसिन प्रतिरोध जीन हटा दिया गया है।
  10. पैच है कि carbenicillin प्रतिरोधी और gentamicin बैक्टीरिया से pFLP2अब प्लाज्मिड के निष्कासन बलों जो 5% (डब्ल्यू / वी) सुक्रोज के साथ पूरक व्यक्तिगत एलबी अगर प्लेटों पर लकीर के लिए अतिसंवेदनशील हैं का चयन करें. 10 कॉलोनियों तक चुनें।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  12. कॉलोनियों के लिए प्लेटों की जाँच करें।
  13. pFLP2अब प्लाज्मिड हानि की एक अंतिम पुष्टि के रूप में, पार पैच 4-6 एक एलबी + सीबी200 अगर प्लेट और एक एलबी अगर प्लेट पर 5% सुक्रोज प्लेटों से अलग कालोनियों.
  14. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16-18 घंटे के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  15. एक क्लोन चुनें जो एलबी अगर प्लेट पर बढ़ रहा है, और वह इस अचिह्नित तनाव को संरक्षित करने के लिए ग्लिसरॉल स्टॉक की तैयारी के लिए कार्बेनिसिलिन संवेदनशील है।
    1. अचिह्नित तनाव का आनुवंशिक सत्यापन कॉलोनी पीसीआर (चरण 6: कॉलोनी पीसीआर द्वारा गुणसूत्र सम्मिलन की पुष्टि करना) के साथ किया जा सकता है जो जेंटामाइसिन प्रतिरोध जीन को लक्षित करने वाले प्राइमरों का उपयोग करता है।
    2. 1x पोलीमरेज़ बफर, 200 माइक्रोन dNTPs, 0.18 माइक्रोन Gm_F फॉरवर्ड प्राइमर, 0.18 माइक्रोन Gm_R रिवर्स प्राइमर(तालिका 1), टाक डीएनए पोलीमरेज़ के 1 यू, और तैयार टेम्पलेट डीएनए के 1 μL युक्त एक पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें 25 माइक्रोन की कुल मात्रा में। टेम्पलेट डीएनए को छोड़कर सभी सहित एक नो-टेम्प्लेट कंट्रोल (एनटीसी) तैयार करें, और चिह्नित तनाव से डीएनए का उपयोग करके एक सकारात्मक नियंत्रण।
    3. एक थर्मल चक्रक में प्रतिक्रिया की स्थिति दर्ज करें: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 50 डिग्री सेल्सियस, और कुल 35 चक्रों के लिए 40 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; 12 डिग्री सेल्सियस पकड़। नमूने चलाएं।
    4. 1x की अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए लोडिंग डाई के अलावा, 1% अगारोज जेल पर प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के 10 माइक्रोन लोड करें और 40 मिनट के लिए 80 वी पर चलाएं। इस प्राइमर जोड़ी के लिए अपेक्षित amplicon आकार 525 बीपी है। सकारात्मक नियंत्रण में एक ही बैंड होना चाहिए; नमूने और एनटीसी में कोई बैंड नहीं होना चाहिए।

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Representative Results

गुणसूत्र सम्मिलन प्रक्रिया एक चयनात्मक अगर प्लेट (चित्रा 1 ए-सी) पर बढ़ रही एक परिणाम कालोनियों को देखने के लिए 3 दिनों में केवल 2 घंटे कुल लेता है. परिवर्तन प्लेट पर कॉलोनियों की अपेक्षित संख्या तनाव पर निर्भर है: कोई 20-30 या सैकड़ों कॉलोनियों को देख सकता है क्योंकि attTn7 साइटों पर Tn7 का सम्मिलन विशिष्ट और कुशल9 है। चयनात्मक मीडिया (चित्रा 4 ए) पर पैचिंग परिवर्तन प्लेट कालोनियों रूपांतरित तनाव को संरक्षित करता है और कॉलोनी पीसीआर स्क्रीनिंग(चित्रा 1ई और चित्रा 4बी)के लिए प्रारंभिक सामग्री प्रदान करता है। पीसीआर द्वारा कॉलोनियों की स्क्रीनिंग को न्यूनतम रखा जा सकता है-10 से अधिक कॉलोनियों को संसाधित करने की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए, और अधिकांश को सम्मिलन के लिए सकारात्मक परिणाम प्राप्त करना चाहिए। स्क्रीनिंग प्राइमर, ABglmS2_F_New और टीएन7आर(तालिका 1)के लिए पीसीआर उत्पाद, 382 बीपी(चित्रा 4बी)है; प्रतिक्रिया के लिए नकारात्मक नियंत्रण जंगली प्रकार ए बौमानी एटीसीसी 17978 (चित्रा 4 बी लेन 2), एबी 258 (चित्रा 4 बी लेन 3), और कोई टेम्पलेट (चित्रा 4 बी लेन 5) शामिल हैं। पीसीआर-पॉजिटिव होने वाली कॉलोनियां पूरक, चिह्नित उपभेदों का प्रतिनिधित्व करती हैं।

जेंटामाइसिन प्रतिरोध जीन (अनमार्किंग) को हटाने में 3 घंटे से भी कम समय लगता है, 6 दिनों तक फैला रहता है क्योंकि छांटना प्लाज्मिड के साथ परिवर्तित कोशिकाओं को चयनात्मक चढ़ाना के माध्यम से चुना जाना चाहिए, और फिर छांटना प्लाज्मिड को बैक्टीरिया (चित्रा 1एफ)से ठीक करने की आवश्यकता होती है। Flp-FRT पुनर्संयोजन-आधारित छांटना सटीक और प्रभावी है और इसके परिणामस्वरूप परिवर्तन प्लेट पर ≥20 कालोनियां होनी चाहिए। कार्बेनिसिलिन (छांटना प्लास्मिड द्वारा प्रदत्त β-लैक्टम प्रतिरोध के लिए चयन) और जेंटामाइसिन (जेंटामाइसिन प्रतिरोध के नुकसान की तलाश में) पर क्रॉस-पैच किए गए कालोनियों को क्रमशः कार्बेनिसिलिन-प्रतिरोधी और जेंटामाइसिन-संवेदनशील होना चाहिए। छांटना प्लाज्मिड 5% सुक्रोज अगर प्लेटों पर वृद्धि से बैक्टीरिया से बाहर मजबूर है. सुक्रोज पर वृद्धि कोशिकाओं को pFLP2एबी को खत्म करने के लिए मजबूर करती है क्योंकि प्लाज्मिड पर सैकबी जीन सुक्रोज के रूपांतरण को लेवांस, बैक्टीरिया12,13 के लिए एक पॉलीसेकेराइड विषाक्त को बढ़ावा देता है। 5% सुक्रोज मीडिया पर बढ़ने वाली सभी कॉलोनियों को केवल सादे एलबी अगर प्लेटों पर बढ़ना चाहिए; कार्बेनिसिलिन अगर प्लेटों पर कोई वृद्धि नहीं होनी चाहिए। सादे एलबी अगर प्लेटों पर उगने वाली कालोनियां अचिह्नित उपभेदों का प्रतिनिधित्व करती हैं। जेंटामाइसिन मार्कर के नुकसान की पुष्टि कॉलोनी पीसीआर द्वारा Gm_F और Gm_R प्राइमरों (तालिका 1 और चित्रा 5) का उपयोग करके प्राप्त की जा सकती है। यह प्राइमर जोड़ी केवल सकारात्मक नियंत्रण में 525 बीपी का एक एम्प्लिकॉन पैदा करती है (शुरू में बनाया गया चिह्नित तनाव, चित्रा 5 लेन 4); जंगली प्रकार एटीसीसी 17978 (चित्रा 5 लेन 2), एबी 258 (चित्रा 5 लेन 3), किसी भी परीक्षण कॉलोनी (चित्रा 5 लेन 5), और नो-टेम्पलेट नियंत्रण (चित्रा 5 लेन 6) प्रवर्धन नहीं दिखाना चाहिए।

एक बार अचिह्नित तनाव की पुष्टि हो जाने के बाद, कार्यात्मक परीक्षण फेनोटाइपिक परख के साथ शुरू हो सकता है। यहां, स्पष्ट पहली पसंद एंटीबायोटिक दवाओं की एक श्रृंखला की न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) का निर्धारण कर रही है: सिप्रोफ्लोक्सासिन AdeIJK का एक ज्ञात सब्सट्रेट है, टेट्रासाइक्लिन को AdeIJK (प्रमुख प्रवाह पंप AdeAB) द्वारा हटाया जा सकता है, और कनामाइसिन का अपेक्षाकृत मामूली प्रभाव है A. baumannii ATCC 17978 2,14। सीएलएसआई दिशानिर्देशों15 के अनुसार शोरबा माइक्रो-कमजोर पड़ने की विधि का उपयोग करते हुए, पूरक अचिह्नित तनाव AB258::adeIJK को 50 माइक्रोन आईपीटीजी की अनुपस्थिति और उपस्थिति में प्रत्येक एंटीबायोटिक के साथ चुनौती दी गई थी; जंगली प्रकार के तनाव एटीसीसी 17978 और आरएनडी प्रवाह की कमी वाले तनाव एबी 258 को नियंत्रण(तालिका 2)के रूप में शामिल किया गया था। कुल मिलाकर, एमआईसी मूल्यों में देखी गई प्रवृत्ति AB258::adeIJK की अपेक्षित कहानी-कम संवेदनशीलता को सिप्रोफ्लोक्सासिन और टेट्रासाइक्लिन को एफ्लक्स पंप की प्रेरित अभिव्यक्ति के साथ बताती है, यह सत्यापित करते हुए कि adeIJK का सम्मिलन सफल रहा।

Figure 1
चित्रा 1: प्रक्रिया का अवलोकन। (ए) पूरक होने के लिए ए बाउमनी तनाव की एक रातोंरात संस्कृति तैयार की जाती है। (बी) रातोंरात संस्कृति से कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से 3 बार पानी से धोया जाता है और बर्फ पर रखा जाता है। (सी)वितरण और सहायक प्लास्मिड कोशिकाओं में जोड़े जाते हैं और 20 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन होते हैं। नमूना electroporated है, एलबी मीडिया जोड़ा जाता है, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ठीक करने की अनुमति दी जाती है. कोशिकाओं का एक 100 माइक्रोन विभाज्य एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों पर फैल गया है और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन है। (डी)परिवर्तन प्लेट से कालोनियों एक एलबी + जीएम50 अगर प्लेट पर पैच कर रहे हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात उगाया जाता है. (ई) पैच कालोनियों पीसीआर के लिए एक प्रवर्धन गुणसूत्र प्रविष्टि साइट फैले एक प्रवर्धन उत्पाद की उपस्थिति के लिए स्क्रीन के लिए तैयार कर रहे हैं. पीसीआर प्रवर्धन की कल्पना अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा की जाती है। पीसीआर-पॉजिटिव नमूने गुणसूत्र में रुचि के जीन के सफल सम्मिलन और एक चिह्नित तनाव के निर्माण का प्रतिनिधित्व करते हैं। (एफ) जेंटामाइसिन के लिए सकारात्मक कॉलोनी चरणों (ए-सी) के रूप में तैयार की जाती है, जिसमें पीएलएफपी 2एबी प्लास्मिड के इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ क्रोमोसोमल सम्मिलन से जेंटामाइसिन कैसेट को हटाने के लिए तैयार किया जाता है। एलबी + सीबी200 अगर पर चयनात्मक चढ़ाना प्लाज्मिड के तेज की पुष्टि करता है। एलबी + सीबी200 और एलबी + जीएम50 अगर प्लेटों पर डुप्लिकेट पैचिंग से सीबीआर और जीएमएस हैं जो कॉलोनियों को प्रकट करते हैं जो सम्मिलन से जेंटामाइसिन कैसेट के नुकसान की पुष्टि करते हैं। 5% सुक्रोज पर चयनित सीबीआर कालोनियों की वृद्धि कोशिकाओं से pLFP2ab प्लाज्मिड का इलाज करती है। 5% सुक्रोज प्लेट से कालोनियों को एलबी + सीबी200 अगर और एलबी अगर पर वांछित सीबीएस और जीएमएस कॉलोनियों को प्रकट करने और अचिह्नित तनाव के निर्माण की पुष्टि करने के लिए पैच किया जाता है। ग्राम50, 50 μg/mL पर जेंटामाइसिन; सीबी200, कार्बेनिसिलिन 200 माइक्रोग्राम / एमएल पर; आर, प्रतिरोधी; एस, संवेदनशील। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: प्लास्मिड इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया. (ए) pUC18T-मिनी-Tn7T-LAC-जीएम (सम्मिलन प्लाज्मिड), (बी) pTNS2 (सहायक प्लाज्मिड), और (सी) pFLP2ab (छांटना प्लाज्मिड) के सामान्य प्लाज्मिड मानचित्र। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सम्मिलन और अचिह्नन का योजनाबद्ध। (ए) सम्मिलन। A. baumannii गुणसूत्र में एकल Tn7 सम्मिलन स्थल glmS2 जीन के अंत से 24 bp स्थित है। सम्मिलन प्लास्मिड और सहायक प्लाज्मिड का सह-इलेक्ट्रोपोरेशन ब्याज के जीन (सम्मिलित जीन, बैंगनी) के पूरक के साथ-साथ बाकी सम्मिलन कैसेट (मार्कर छांटना के लिए एफआरटी साइटें, पीला; जेंटामाइसिन प्रतिरोध के लिए accC1 जीन, हरा; इंड्यूसिबल अभिव्यक्ति के लिए लैकआईक्यू जीन, नीला) गुणसूत्र में। (बी) अचिह्नित। pFLP2ab छांटना प्लाज्मिड के साथ पूरक, चिह्नित सम्मिलन तनाव का इलेक्ट्रोपोरेशन Flp-FRT पुनर्संयोजन (FRT साइटों, पीले) के माध्यम से जेंटामाइसिन प्रतिरोध जीन (accC1, हरा) को हटाने की सुविधा देता है, जिससे एक अचिह्नित तनाव पैदा होता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: परिवर्तन, पैचिंग, और कॉलोनी पीसीआर द्वारा सम्मिलन पुष्टि. (ए) पैचिंग के बाद परिवर्तन कालोनियों की वृद्धि, और (बी) क्रोमोसोमल सम्मिलन की पुष्टि करने के लिए ABglmS_F_New (ग्रे) और टीएन7आर (नारंगी) प्राइमरों के साथ कॉलोनी पीसीआर प्रवर्धन का प्रतिनिधि परिणाम। लेन 1: कम आणविक भार डीएनए सीढ़ी; लेन 2: एटीसीसी 179798; लेन 3: AB258; लेन 4: AB258::adeIJK-LAC-GM; लेन 5: नो-टेम्प्लेट कंट्रोल। 382 bp का अपेक्षित बैंड लेबल किया जाता है। ध्यान दें कि जेंटामाइसिन-विशिष्ट प्राइमरों (Gm_F और Gm_R, हरे) का उपयोग गुणसूत्र सम्मिलन की पुष्टि करने के लिए भी किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: कॉलोनी पीसीआर द्वारा मार्कर के नुकसान की पुष्टि। पीएफएलपीएबी-आधारित छांटना के माध्यम से एंटीबायोटिक मार्कर के नुकसान की पुष्टि करने के लिए जेंटामाइसिन-विशिष्ट प्राइमरों (Gm_F और Gm_R) के साथ कॉलोनी पीसीआर प्रवर्धन का प्रतिनिधि परिणाम। लेन 1: कम आणविक भार डीएनए सीढ़ी; लेन 2: एटीसीसी 179798; लेन 3: AB258; लेन 4: AB258::adeIJK-LAC-GM; लेन 5: AB258::adeIJK; लेन 6: नो-टेम्प्लेट कंट्रोल। 525 bp का अपेक्षित बैंड लेबल किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उपभेदों, प्लास्मिड, और प्राइमर प्रासंगिक विशेषताएं हवाला
दाग
A. बौमानी एटीसीसी 17978 प्रकार तनाव एटीसीसी
A. बौमानी एटीसीसी 17978 एबी258 Δएडीएबी, Δएडीएफजीएच, Δएडीआईजेके 11
प्लास्मिड
pUC18T-miniTn7T-जीएम-एलएसी जीएमआर, एम्पआर 9
pUC18T-miniTn7T-जीएम-LAC-adeIJK जीएमआर, एम्पआर, एडीआईजेके यह अध्ययन
पीटीएनएस2 एम्पआर 9
pFLP2ab pWH1266 मूल या प्रतिकृति, sacB, AmpR 7
प्राइमरों अनुक्रम (5′–3′)
ABglmS_F_New CACAGCATAACTGGACTGATTTC 7
टीएन7आर TATGGAAGAAGTTCAGGCTC 7
Gm_F TGGAGCAGCAACGATGTTAC यह अध्ययन
Gm_R TGTTAGGTGGCGGTACTTGG यह अध्ययन

तालिका 1: बैक्टीरियल उपभेदों, प्लास्मिड, और प्राइमरों इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया. जीएम, जेंटामाइसिन; एएमपी, एम्पीसिलीन; आर, प्रतिरोधी।

सिप्रोफ्लोक्सासिन टेट्रासाइक्लिन कनामाइसिन
आईपीटीजी − + − + − +
एटीसीसी 17978 0.250 मरोड़ना 0.500 मरोड़ना 1.5 मरोड़ना
एबी258 0.031 मरोड़ना 0.063 मरोड़ना 4 मरोड़ना
AB258::adeIJK 0.016 0.063 0.031 0.125 8 2
तह परिवर्तन 4.01 4.03 0.25

तालिका 2: एंटीबायोटिक संवेदनशीलता के माध्यम से सम्मिलित जीन की कार्यक्षमता का परीक्षण। A. baumannii ATCC 17978, AB258, uninduced AB258::adeIJK, और IPTG-प्रेरित AB258::adeIJK के लिए सिप्रोफ्लोक्सासिन, टेट्रासाइक्लिन और कनामाइसिन के खिलाफ न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (MIC) मूल्यों की तुलना। गुना परिवर्तन = प्रेरित (+ IPTG)/अप्रेरित (− IPTG); nd = निर्धारित नहीं।

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Discussion

भले ही ए बाउमनी में एक इंड्यूसिबल सिंगल-कॉपी जीन अभिव्यक्ति प्रणाली के गुणसूत्र सम्मिलन के लिए यह प्रक्रिया तकनीकी रूप से सीधी है और श्रम-गहन नहीं है, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन पर जोर देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, सक्षम कोशिकाओं की तैयारी बर्फ पर जितना संभव हो उतना किया जाना चाहिए क्योंकि कोशिकाएं बर्फ के ठंडे पानी के साथ मीडिया के प्रतिस्थापन के दौरान नाजुक हो जाती हैं। आदर्श रूप से, सेंट्रीफ्यूजेशन चरण 4 डिग्री सेल्सियस पर किए जाते हैं, लेकिन कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूजेशन स्वीकार्य है। पानी धोने के दौरान कोशिकाओं की बढ़ती नाजुकता को देखते हुए, कोमल पाइपिंग भी महत्वपूर्ण है। दूसरा, इलेक्ट्रोपोरेशन आयनों की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील है। पेलेटिंग के कई दौर के साथ कोशिकाओं को धोना और पानी में निलंबित करना सुनिश्चित करता है कि मीडिया पूरी तरह से हटा दिया गया है। इसके अलावा, प्लास्मिड ताजा शुद्ध किया जाना चाहिए और मानक किट क्षालन बफर (सामान्य रूप से ते बफर) में eluted किया जा सकता है जब तक प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता काफी अधिक है. हम नमूना की आयनिक ताकत को बहुत कम रखने के लिए सेल निलंबन के 100 माइक्रोन में प्लास्मिड के <5 माइक्रोन को जोड़ने का लक्ष्य रखते हैं, हालांकि 10 माइक्रोन तक सहन किया जाना चाहिए। तीसरा, चयनात्मक अगर प्लेटों जोड़ा एंटीबायोटिक की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए जरूरत के रूप में तैयार किया जाना चाहिए. ध्यान दें कि छांटना प्लाज्मिड, pFLP2ab के परिवर्तन के दौरान चयन के लिए सामान्य एम्पीसिलीन के बजाय कार्बेनिसिलिन का उपयोग किया गया था। A. baumannii आंतरिक रूप से एमिनोपेनिसिलिन (एम्पीसिलीन)16के लिए प्रतिरोधी है; एक कार्बोक्सीपेनिसिलिन (कार्बेनिसिलिन) को प्रतिस्थापित करने से प्लाज्मिड-एन्कोडेड β-लैक्टामेज़ के साथ निरंतर चयन की अनुमति मिलती है।

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन अधिक सूक्ष्म है और एसिनेटोबैक्टर की विभिन्न प्रजातियों (या यहां तक कि एक ही प्रजाति के भीतर आनुवंशिक रूप से हेरफेर किए गए उपभेदों) और संभवतः प्रयोगशाला में उपयोग किए जाने वाले विशेष अभिकर्मकों के बीच भिन्न होगा। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए उपयोग किया जाने वाला वोल्टेज 1.8 और 2.5 केवी के बीच भिन्न हो सकता है, और पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए पोलीमरेज़ के आधार पर थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति को थोड़ा बदलने की आवश्यकता हो सकती है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिकाओं को खराब बढ़ रहे हैं तो इस पर विचार करने के लिए सहायक संकेत 50 माइक्रोग्राम / एमएल से 30 माइक्रोग्राम / एमएल तक अगर प्लेटों में जेंटामाइसिन की एकाग्रता को कम करना और / या अगर प्लेटों के इनक्यूबेशन समय को ≥ 24 घंटे तक बढ़ाना शामिल है। जेंटामाइसिन कैसेट को हटाने के चरणों के बारे में, 10% सुक्रोज के साथ एलबी अगर प्लेटों का उपयोग करके और / या कार्बेनिसिलिन प्रतिरोध बनी रहती है तो ≥24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें इनक्यूबेट करना बेहतर सफलता मिल सकती है।

इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ उपयोग के लिए कई ए बाउमनी सेल तैयारी के तरीके साहित्य में पाए जा सकते हैं, लेकिन वे अक्सर प्रारंभिक रातोंरात संस्कृति के बाद एक उप-संस्कृति कदम और फिर एक निर्धारित ऑप्टिकल घनत्व के लिए एक लंबा विकास चरण शामिल करते हैं। हमने पाया है कि एक साधारण रातोंरात संस्कृति का उपयोग उतना ही प्रभावी ढंग से किया जा सकता है। ए बाउमनी के इलेक्ट्रोपोरेशन को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है, और पाठकों को यहांप्रोटोकॉल 17,18 के इस विशिष्ट पहलू में और जानकारी मिल सकती है। प्लाज्मिड-आधारित पूरक प्रणाली की तुलना में इस मिनी-टीएन 7 गुणसूत्र जीन पूरक प्रणाली के प्रमुख लाभ आईपीटीजी-नियंत्रणीय लैकआईक्यू रिप्रेसर सिस्टम के माध्यम से पूरक जीन की अभिव्यक्ति के स्तर को विनियमित करने की क्षमता और जेंटामाइसिन मार्कर (एएसीसी 1 जीन) को हटाने का विकल्प है फ़्लैंकिंग FRT साइटें। यह देखा गया कि प्रवाह पंप की अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की सहनशीलता पंप डाला के आधार पर भिन्न हो सकते हैं. उदाहरण के लिए, कोशिकाएं AdeABC या AdeFGH की तुलना में AdeIJK की अभिव्यक्ति के प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं; इसे संस्कृति की स्थिति में आईपीटीजी की एकाग्रता को संशोधित करके संबोधित किया जा सकता है। एंटीबायोटिक मार्कर को हटाने से निरंतर चयन दबाव के कारण तनाव के लिए उत्परिवर्ती जोखिम कम हो जाता है और अप्रतिबंधित एंटीबायोटिक संवेदनशीलता जांच के लिए भी अनुमति देता है3.

इस मिनी-टीएन 7 प्रणाली का उपयोग स्यूडोमोनास 9,10, यर्सिनिया9, बर्कहोल्डरिया19, ज़ैंथोमोनस20 और एसिनेटोबैक्टर 5,6,21,22 प्रजातियों के साथ सफलतापूर्वक किया गया है, हालांकि, कुछ सीमाएं मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, A. baumannii में जीनोम5 में केवल एक कार्यात्मक attTn7 सम्मिलन स्थल है, इसलिए कई विलोपन के साथ एक तनाव बनाया जा सकता है, लेकिन एक समय में केवल एक जीन को पूरक किया जा सकता है। इसके अलावा, यह प्रणाली अभी तक ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया10 के लिए प्रभावी साबित नहीं हुई है।

आरएनडी एफ्लक्स पंप एंटीबायोटिक प्रतिरोध के महत्वपूर्ण सूत्रधार हैं ए। जो चीज उन्हें इतना शक्तिशाली बनाती है वह है उनकी तीन-भाग संरचना जो आंतरिक और बाहरी झिल्ली में फैली हुई है, जिससे पेरिप्लाज्म से एंटीबायोटिक दवाओं को कोशिका के बाहर तक हटाने की अनुमति मिलती है। सबसे अधिक अध्ययन और सर्वव्यापी आरएनडी पंप-नामित AdeABC, AdeFGH, और AdeIJK-सभी वर्गों को शामिल एंटीबायोटिक दवाओं को खत्म करने के लिए दिखाया गया है। विस्तार से एफ्लक्स पंप फ़ंक्शन को स्पष्ट करना मल्टीड्रग-प्रतिरोधी उपभेदों के खिलाफ उपन्यास चिकित्सीय विकल्पों को डिजाइन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु प्रदान करेगा। AB258 ट्रिपल RND पंप विलोपन तनाव का उपयोग करना और एक समय में एक पंप को वापस पूरक करना प्रत्येक पंप के अध्ययन के लिए दूसरों से स्वतंत्र होने की अनुमति देता है, प्रत्येक के लिए उनके अद्वितीय सब्सट्रेट प्रोफाइल और सबसे प्रभावी अवरोधकों के लिए समझदार होता है। बेशक, जीवाणु के सामान्य कार्य में एफ्लक्स पंपों की "दिन-प्रतिदिन" भूमिका भी होती है। उन भूमिकाओं को समझने से पंपों का अप्रत्यक्ष अपंग हो सकता है, जो बदले में, एंटीबायोटिक प्रवाह को बाधित करेगा, संभवतः मल्टीड्रग-प्रतिरोधी बैक्टीरिया को एक बार फिर से आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अतिसंवेदनशील बना देगा। आम तौर पर, मिनी-टीएन 7 प्रणाली का उपयोग विस्तृत अध्ययन या सहायक मार्करों के लिए ब्याज के किसी भी जीन को पेश करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, सूक्ष्म इमेजिंग6 के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन।

मल्टीड्रग प्रतिरोधी बैक्टीरिया का बढ़ता प्रसार हम सभी के लिए चिंता का विषय है। ए बॉमनी जैसे रोगजनकों में एफ्लक्स पंपों द्वारा प्रदान किए गए सुरक्षात्मक तंत्र को समझना गंभीर संक्रमणों से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है। यह क्रोमोसोमल सिंगल-कॉपी जीन अभिव्यक्ति प्रणाली यंत्रवत अध्ययन के साथ-साथ एफ्लक्स पंप फ़ंक्शन को विफल करने के लिए अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद से एके तक डिस्कवरी अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। आंकड़ों में प्रयुक्त योजनाबद्ध BioRender.com के साथ बनाए गए हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube VWR 20170-012 For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72-690-301 General use
13-mL culture tubes, Pyrex Fisher 14-957K Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer Froggabio LD010 Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial Fisher 351271-212 Agarose gel running buffer component
Agar Bioshop AGR003 Solid growth media
Agarose BioBasic D0012 Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit Fisher 29-237-54 Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin Fisher 50841231 Selective media
Culture tube closures Fisher 13-684-138 Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set Biobasic DD0058 PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater Fisher 88860023 Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes VWR 89047-208 2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator Cole Parmer 940000009 110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide Fisher BP102-1 Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) VWR CA-EM4050 Agarose gel running buffer component
Gentamicin Biobasic GB0217 For the preparation of selective media
Glycerol Fisher G33 Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking) New Brunswick Scientific M1352-0000 Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static) Fisher 11-690-550D Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop Sarstedt 86.1562.050 Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader Sarstedt 86.1569.005 Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox Fisher BP1427 Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge Fisher 75002431 Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge Fisher S67601B Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes SPL Life Sciences 10090 For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes  Mandel Various Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply Biorad 1645050 PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers IDT NA PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose BioBasic SB0498 For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase FroggaBio T-500 PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler Biorad 1861096 Model T100 for PCR
Toothpicks Fisher S24559 For patching colonies onto agar plates
Trizma base Sigma T1503 Agarose gel running buffer component
Ultrapure water Millipore Sigma ZLXLSD51040 MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker Biobasic M103R-2 Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks Fisher 29-801-02 Inoculating cultures with colonies from agar plates

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References

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380 (2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288 (2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373 (2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110 (2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045 (2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16 (2020).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 203
<i>एसिनेटोबैक्टर बाउमानी</i> में मल्टीड्रग एफ्लक्स सिस्टम की विशेषता एक एफ्लक्स-कमी वाले जीवाणु तनाव और एकल-प्रतिलिपि जीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करना
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White, D., Kumar, A. Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System. J. Vis. Exp. (203), e66471, doi:10.3791/66471 (2024).

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