Fremstilling af decellulariseret miltmatrix afledt af rotter
Summary
Den decellulariserede miltmatrix (DSM) har lovende anvendelser inden for levervævsteknik. Denne protokol skitserer proceduren til fremstilling af rotte-DSM, som omfatter høst af rottemilt, decellularisering af dem gennem perfusion og evaluering af den resulterende DSM for at bekræfte dens egenskaber.
Abstract
Levertransplantation er den primære behandling for leversygdom i slutstadiet. Manglen på og den utilstrækkelige kvalitet af donororganer nødvendiggør imidlertid udvikling af alternative behandlingsformer. Biokunstige lever (BAL’er) ved hjælp af decellulariseret levermatrix (DLM) har vist sig som lovende løsninger. Det er dog fortsat en udfordring at finde egnede DLM’er. Brugen af en decellulariseret miltmatrix (DSM) er blevet undersøgt som et fundament for BAL’er, der tilbyder et let tilgængeligt alternativ. I denne undersøgelse blev rottemilt høstet og decellulariseret ved hjælp af en kombination af fryse-optøningscyklusser og perfusion med decellulariseringsreagenser. Protokollen bevarede mikrostrukturerne og komponenterne i den ekstracellulære matrix (ECM) inden for DSM. Den komplette decellulariseringsproces tog ca. 11 timer, hvilket resulterede i en intakt ECM i DSM. Histologisk analyse bekræftede fjernelsen af cellulære komponenter, samtidig med at ECM’s struktur og sammensætning blev bevaret. Den præsenterede protokol giver en omfattende metode til opnåelse af DSM, der tilbyder potentielle anvendelser inden for levervævsteknik og celleterapi. Disse resultater bidrager til udviklingen af alternative tilgange til behandling af leversygdom i slutstadiet.
Introduction
Levertransplantation er fortsat den eneste endelige behandling af leversygdomi slutstadiet 1,2,3. Den kritiske mangel og faldende kvalitet af donororganer har imidlertid øget behovet for alternativ behandling4. Inden for regenerativ medicin har biokunstige lever (BAL’er), der anvender decellulariseret levermatrix (DLM), vist sig at være lovende løsninger 5,6,7. DLM bevarer den oprindelige leverstruktur, herunder dets indviklede mikrovaskulære netværk og komponenter i ECM, og tilbyder et stillads til oprettelse af transplanterelige BAL’er, der potentielt kan lindre leversygdomme.
På trods af løftet står indførelsen af denne teknologi over for udfordringer, især med hensyn til indkøb af egnede DLM’er. Der er mangel på DLM’er fra mennesker, mens DLM’er fra animalske kilder indebærer risici for sygdomsoverførsel og immunafstødning. I en innovativ tilgang har vores forskning undersøgt brugen af en decellulariseret miltmatrix (DSM) som grundlag for BALs 8,9,10,11. Milt er lettere tilgængelige i forskellige medicinske situationer, såsom portalhypertension, traumatisk ruptur, idiopatisk trombocytopenisk purpura og donation efter hjertedød. Derfor er milt mere bredt tilgængelige end lever til forskningsformål. Patienter, der har gennemgået splenektomier, lider ikke af alvorlige tilstande, hvilket yderligere bekræfter miltens dispenserbarhed. Miltens mikromiljø, især den ekstracellulære matrix og sinusoider, ligner leverens. Dette gør milten til et egnet organ til celleadhæsion og proliferation i hepatocyttransplantationsforskning. Baseret på disse resultater har vores tidligere undersøgelser vist, at DSM’er deler sammenlignelige mikrostrukturer og komponenter med DLM’er og kan understøtte overlevelsen og funktionen af hepatocytter, herunder albumin- og urinstofproduktion. Desuden har DSM’er vist sig at forbedre leverdifferentieringen af mesenkymale stamceller fra knoglemarv, hvilket fører til forbedret og konsistent funktionalitet.
Ved at anvende DSM’er behandlet med heparin har vi konstrueret funktionelle BAL’er, der er i stand til at demonstrere effektiv kortvarig antikoagulation og delvis leverfunktionskompensation11. Derfor har denne tredimensionelle DSM et betydeligt løfte om fremskridt inden for levervævsteknik og celleterapi. I dette arbejde præsenterer vi de detaljerede metoder til høst af rottemilt og forberedelse af DSM, der bevarer mikrostrukturerne og komponenterne i ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
BAL’erne repræsenterer en effektiv tilgang til behandling af leversygdom i slutstadiet, navnlig i tilfælde, hvor levertransplantation hindres af den nuværende mangel på donororganer6. En lovende mulighed for at skabe BAL’er er brugen af DLM, som bevarer den indfødte levers naturlige ECM og vaskulære struktur. Knapheden på humant DLM og de potentielle risici for infektion og immunogenicitet, der er forbundet med DLM fra dyr, udgør imidlertid betydelige begrænsninger. For at løse denne udf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 &; 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (2021HL-42 &; 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
