Herstellung einer dezellularisierten Milzmatrix aus Ratten
Summary
Die dezellularisierte Milzmatrix (DSM) bietet vielversprechende Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering in der Leber. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Vorbereitung des DSM von Ratten, das die Entnahme von Rattenmilz, ihre Dezellularisierung durch Perfusion und die Bewertung des resultierenden DSM zur Bestätigung seiner Eigenschaften umfasst.
Abstract
Die Lebertransplantation ist die primäre Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium. Der Mangel und die unzureichende Qualität der Spenderorgane machen jedoch die Entwicklung alternativer Therapien erforderlich. Biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, haben sich als vielversprechende Lösungen herausgestellt. Die Beschaffung geeigneter DLMs bleibt jedoch eine Herausforderung. Die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) wurde als Grundlage für BALs erforscht und bietet eine leicht verfügbare Alternative. In dieser Studie wurde die Milz von Ratten unter Verwendung einer Kombination aus Gefrier-Auftau-Zyklen und Perfusion mit Dezellularisierungsreagenzien entnommen und dezellularisiert. Das Protokoll bewahrte die Mikrostrukturen und Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb des DSM. Der vollständige Dezellularisierungsprozess dauerte ca. 11 h, was zu einer intakten EZM innerhalb des DSM führte. Die histologische Analyse bestätigte die Entfernung zellulärer Komponenten unter Beibehaltung der Struktur und Zusammensetzung der EZM. Das vorgestellte Protokoll bietet eine umfassende Methode zur Gewinnung von DSM und bietet potenzielle Anwendungen im Bereich des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. Diese Erkenntnisse tragen zur Entwicklung alternativer Ansätze für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium bei.
Introduction
Die Lebertransplantation ist nach wie vor die einzige definitive Behandlung für Lebererkrankungen im Endstadium 1,2,3. Der kritische Mangel und die abnehmende Qualität von Spenderorganen haben jedoch den Bedarf an alternativen Behandlungen erhöht4. Im Bereich der regenerativen Medizin haben sich biokünstliche Lebern (BALs), die eine dezellularisierte Lebermatrix (DLM) verwenden, als vielversprechende Lösungen erwiesen 5,6,7. Die DLM bewahrt die ursprüngliche Leberstruktur, einschließlich ihres komplizierten mikrovaskulären Netzwerks und der Komponenten der EZM, und bietet ein Gerüst für die Erstellung transplantierbarer BALs, die möglicherweise Lebererkrankungen lindern könnten.
Trotz des Versprechens steht die Einführung dieser Technologie vor Herausforderungen, insbesondere bei der Beschaffung geeigneter DLMs. Vom Menschen stammende DLMs sind knapp, während solche aus tierischen Quellen das Risiko der Übertragung von Krankheiten und der Immunabstoßung bergen. In einem innovativen Ansatz haben wir in unserer Forschung die Verwendung einer dezellularisierten Milzmatrix (DSM) als Grundlage für die BALs 8,9,10,11 untersucht. Milz ist in verschiedenen medizinischen Situationen leichter verfügbar, z. B. bei portaler Hypertonie, traumatischer Ruptur, idiopathischer thrombozytopenischer Purpura und Spende nach dem Herztod. Daher ist Milz für Forschungszwecke weiter verbreitet als Leber. Patienten, die sich einer Splenektomie unterzogen haben, leiden nicht an schweren Erkrankungen, was die Entbehrlichkeit der Milz weiter bestätigt. Die Mikroumgebung der Milz, insbesondere der extrazellulären Matrix und der Sinusoide, ähnelt der der Leber. Damit ist die Milz ein geeignetes Organ für die Zelladhäsion und -proliferation in der Hepatozytentransplantationsforschung. Basierend auf diesen Erkenntnissen haben unsere bisherigen Untersuchungen gezeigt, dass DSMs vergleichbare Mikrostrukturen und Komponenten mit DLMs aufweisen und das Überleben und die Funktion von Hepatozyten, einschließlich der Albumin- und Harnstoffproduktion, unterstützen können. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass DSMs die hepatische Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks verbessern, was zu einer verbesserten und konsistenten Funktionalität führt.
Durch den Einsatz von DSMs, die mit Heparin behandelt wurden, haben wir funktionelle BALs entwickelt, die in der Lage sind, eine wirksame kurzfristige Antikoagulation und eine partielle Leberfunktionskompensation zu demonstrieren11. Folglich ist dieses dreidimensionale DSM vielversprechend für die Weiterentwicklung des Lebergewebe-Engineerings und der Zelltherapie. In dieser Arbeit stellen wir die detaillierten Methoden zur Entnahme von Rattenmilz und zur Herstellung von DSM vor, die die Mikrostrukturen und Komponenten der EZM erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die BALs stellen einen wirksamen Ansatz für die Behandlung von Lebererkrankungen im Endstadium dar, insbesondere in Fällen, in denen eine Lebertransplantation durch den derzeitigen Mangel an Spenderorganen behindertwird 6. Eine vielversprechende Option zur Erstellung von BALs ist die Verwendung von DLM, bei der die natürliche EZM und die Gefäßstruktur der nativen Leber erhalten bleiben. Die Knappheit von DLM beim Menschen und die potenziellen Infektions- und Immunogenitätsrisiken, die mit ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (82000624), dem Natural Science Basic Research Program von Shaanxi (2022JQ-899 & 2021JM-268), dem Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), dem Shaanxi Province Key R&D Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), der Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (2021HL-42 & 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
