Fabrikasjon av decellularisert miltmatrise avledet fra rotter
Summary
Den decellulariserte miltmatrisen (DSM) har lovende applikasjoner innen levervevsteknikk. Denne protokollen skisserer prosedyren for å forberede rotte DSM, som inkluderer høsting av rottemilt, decellularisering av dem gjennom perfusjon og evaluering av den resulterende DSM for å bekrefte dens egenskaper.
Abstract
Levertransplantasjon er den primære behandlingen for leversykdom i sluttstadiet. Imidlertid nødvendiggjør mangelen og mangelfull kvalitet på donororganer utviklingen av alternative terapier. Biokunstige lever (BAL) som bruker decellularisert levermatrise (DLM) har dukket opp som lovende løsninger. Det er imidlertid fortsatt utfordrende å finne egnede DLM-er. Bruken av en decellularisert miltmatrise (DSM) har blitt utforsket som grunnlag for BAL, og tilbyr et lett tilgjengelig alternativ. I denne studien ble rottemilt høstet og decellularisert ved hjelp av en kombinasjon av fryse-tine-sykluser og perfusjon med decellulariseringsreagenser. Protokollen bevarte mikrostrukturene og komponentene i den ekstracellulære matrisen (ECM) i DSM. Den komplette decellulariseringsprosessen tok omtrent 11 timer, noe som resulterte i en intakt ECM i DSM. Histologisk analyse bekreftet fjerning av cellulære komponenter samtidig som ECMs struktur og sammensetning ble beholdt. Den presenterte protokollen gir en omfattende metode for å oppnå DSM, og tilbyr potensielle anvendelser innen levervevsteknikk og celleterapi. Disse funnene bidrar til utviklingen av alternative tilnærminger for behandling av leversykdom i sluttstadiet.
Introduction
Levertransplantasjon er fortsatt den eneste definitive behandlingen for leversykdomi sluttstadiet 1,2,3. Den kritiske mangelen og synkende kvalitet på donororganer har imidlertid økt behovet for alternativ behandling4. I riket av regenerativ medisin har biokunstige lever (BALs) som bruker decellularisert levermatrise (DLM) dukket opp som lovende løsninger 5,6,7. DLM bevarer den opprinnelige leverstrukturen, inkludert det intrikate mikrovaskulære nettverket og komponentene i ECM, og tilbyr et stillas for å skape transplanterbare BAL som potensielt kan lindre leversykdommer.
Til tross for løftet, står adopsjonen av denne teknologien overfor utfordringer, spesielt når det gjelder å skaffe egnede DLM-er. Menneskeavledede DLM-er er mangelvare, mens de fra animalske kilder bærer risikoen for sykdomsoverføring og immunavvisning. I en innovativ tilnærming har vår forskning utforsket bruken av en decellularisert miltmatrise (DSM) som grunnlag for BAL 8,9,10,11. Milt er lettere tilgjengelig i ulike medisinske situasjoner, for eksempel portalhypertensjon, traumatisk ruptur, idiopatisk trombocytopenisk purpura og donasjon etter hjertedød. Derfor er milt mer allment tilgjengelig enn lever for forskningsformål. Pasienter som har gjennomgått splenektomi, lider ikke av alvorlige forhold, noe som ytterligere bekrefter miltens dispensabilitet. Miltens mikromiljø, spesielt den ekstracellulære matriksen og sinusoidene, ligner leverens. Dette gjør milten til et egnet organ for celleadhesjon og proliferasjon i forskning på hepatocytttransplantasjon. Basert på disse funnene har våre tidligere undersøkelser vist at DSM deler sammenlignbare mikrostrukturer og komponenter med DLM og kan støtte overlevelse og funksjon av hepatocytter, inkludert albumin- og ureaproduksjon. Videre har DSM vist seg å forbedre den hepatiske differensieringen av benmarg mesenkymale stamceller, noe som fører til forbedret og konsistent funksjonalitet.
Ved å bruke DSM behandlet med heparin, har vi utviklet funksjonelle BAL som er i stand til å demonstrere effektiv kortsiktig antikoagulasjon og delvis leverfunksjonskompensasjon11. Følgelig har denne tredimensjonale DSM betydelig løfte om fremme av levervevsteknikk og celleterapi. I dette arbeidet presenterer vi de detaljerte metodene for høsting av rottemilt og forberedelse av DSM som bevarer mikrostrukturer og komponenter i ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
BAL representerer en effektiv tilnærming til behandling av leversykdom i sluttstadiet, spesielt i tilfeller der levertransplantasjon hindres av den nåværende mangelen på donororganer6. Et lovende alternativ for å lage BAL er bruken av DLM, som bevarer den opprinnelige leverens naturlige ECM og vaskulære struktur. Imidlertid utgjør mangelen på humant DLM og de potensielle risikoene for infeksjon og immunogenitet forbundet med DLM hos dyr betydelige begrensninger. For å møte denne utfordri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82000624), Natural Science Basic Research Program of Shaanxi (2022JQ-899 &; 2021JM-268), Shaanxi Province Innovation Capability Support Program (2023KJXX-030), Shaanxi Province Key FoU Plan University Joint Project-Key Project (2021GXLH-Z-047), Institutional Foundation of The First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (2021HL-42 &; 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
