Изготовление децеллюляризованной матрицы селезенки, полученной из крыс
Summary
Децеллюляризованный матрикс селезенки (DSM) имеет многообещающее применение в области тканевой инженерии печени. В этом протоколе описана процедура подготовки DSM крысы, которая включает в себя сбор селезенки крысы, децеллюляризацию их с помощью перфузии и оценку полученного DSM для подтверждения его характеристик.
Abstract
Трансплантация печени является основным методом лечения терминальной стадии заболевания печени. Однако нехватка и недостаточное качество донорских органов обусловливают необходимость разработки альтернативных методов лечения. Биоискусственная печень (БАЛ), использующая децеллюляризованный матрикс печени (DLM), стала многообещающим решением. Однако поиск подходящих DLM остается сложной задачей. Использование децеллюляризованной матрицы селезенки (DSM) было изучено в качестве основы для БАЛ, предлагая легкодоступную альтернативу. В этом исследовании селезенка крыс была собрана и децеллюляризирована с использованием комбинации циклов замораживания-оттаивания и перфузии с реагентами децеллюляризации. Протокол сохранил микроструктуры и компоненты внеклеточного матрикса (ECM) в DSM. Полный процесс децеллюляризации занял около 11 часов, в результате чего в DSM образовалась неповрежденная ВКМ. Гистологический анализ подтвердил удаление клеточных компонентов при сохранении структуры и состава ВКМ. Представленный протокол обеспечивает комплексный метод получения DSM, предлагая потенциальные приложения в тканевой инженерии печени и клеточной терапии. Эти результаты способствуют разработке альтернативных подходов к лечению терминальной стадии заболевания печени.
Introduction
Трансплантация печени остается единственным окончательным методом лечения терминальной стадии заболевания печени 1,2,3. Однако критическая нехватка и снижение качества донорских органов повысили потребность в альтернативных методах лечения4. В области регенеративной медицины биоискусственная печень (БАЛ) с использованием децеллюляризованного матрикса печени (ДЛМ) стала многообещающим решением 5,6,7. DLM сохраняет исходную структуру печени, включая ее сложную микрососудистую сеть и компоненты ECM, предлагая каркас для создания трансплантируемых БАЛ, которые потенциально могут облегчить заболевания печени.
Несмотря на перспективы, внедрение этой технологии сталкивается с проблемами, особенно в поиске подходящих DLM. DLM человеческого происхождения в дефиците, в то время как те, что получены из животных источников, несут риск передачи заболеваний и иммунного отторжения. В рамках инновационного подхода в нашем исследовании изучалось использование децеллюляризованного матрикса селезенки (DSM) в качестве основы для БАЛ 8,9,10,11. Селезенка более доступна в различных медицинских ситуациях, таких как портальная гипертензия, травматический разрыв, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и донорство после сердечной смерти. Поэтому селезенка более доступна, чем печень, для исследовательских целей. Пациенты, перенесшие спленэктомию, не страдают тяжелыми состояниями, что еще раз подтверждает незаменимость селезенки. Микроокружение селезенки, особенно внеклеточный матрикс и синусоиды, похоже на микроокружение печени. Это делает селезенку подходящим органом для клеточной адгезии и пролиферации в исследованиях трансплантации гепатоцитов. Основываясь на этих результатах, наши предыдущие исследования продемонстрировали, что DSM имеют схожие микроструктуры и компоненты с DLM и могут поддерживать выживание и функцию гепатоцитов, включая выработку альбумина и мочевины. Кроме того, было показано, что DSM усиливают печеночную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, что приводит к улучшению и стабильности функциональности.
Используя DSM, обработанные гепарином, мы разработали функциональные БАЛ, способные демонстрировать эффективную краткосрочную антикоагулянтную терапию и частичную компенсацию функции печени11. Следовательно, эта трехмерная DSM имеет значительные перспективы для развития тканевой инженерии печени и клеточной терапии. В данной работе мы подробно представляем методы забора селезенки крыс и приготовления ДСМ, сохраняющие микроструктуры и компоненты ВКМ.
Protocol
Representative Results
Discussion
БАЛ представляют собой эффективный подход к лечению терминальной стадии заболевания печени, особенно в тех случаях, когда трансплантация печени затруднена из-за текущей нехватки донорских органов6. Многообещающим вариантом создания БАЛ является использование ДЛМ, котор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82000624), Программой фундаментальных исследований в области естественных наук провинции Шэньси (2022JQ-899 и 2021JM-268), Программой поддержки инновационного потенциала провинции Шэньси (2023KJXX-030), Совместным проектом Университета ключевых исследований и разработок провинции Шэньси (2021GXLH-Z-047), Институциональным фондом Первой аффилированной больницы Сианьского университета Цзяотун (2021HL-42 & 2021HL-21).
Materials
| Anesthesia Machine | Harvard Apparatus | tabletop | animal anesthesia |
| bubble trap | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd. | pore diameter: 5 μm | prevent air bubbles |
| Buprenorphine | TIPR Pharmaceutical Responsible Co.,Ltd | an analgesic | |
| Hemostatic Forceps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd | J31020 | surgical tool |
| Heparinized Saline | SPH No.1 Biochemical & Pharmaceutical Co., LTD | prevent the formation of thrombosis | |
| Isoflurane | RWD life Science Co. | anesthetic:for the induction and maintenanceof anesthesia | |
| Penicillin-Streptomycin | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0222 | antibiotics in vitro to prevent microbial contamination |
| Peristaltic Pump | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | BT100-1L | |
| Phosphate-Buffered Saline | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 4481228 | phosphoric acid buffer salt solution |
| Silicone Tube | Baoding Longer Precision Pump Co., Ltd. | 2.4×0.8mm | |
| Silk Suture | Yangzhou Jinhuan Medical Instrument Factory | 6-0 and 3-0 | ligate blood vessels |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 151-21-3 | ionic detergent, dissolves both cell and nuclear membranes |
| Syringe Pump | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | BeneFusion SP5 | intravenous infusion |
| Triton X-100 | Shanghai Titan Scientific Co., Ltd. | 9002-93-1 | non-ionic detergent, disrupts lipid-lipid, lipid-protein, and DNA-protein interactions |
| Venous Catheter | B. Braun Company | 24G | inserting the spleen artery |
References
- Xu, X. State of the art and perspectives in liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 22 (1), 1-3 (2023).
- Hautz, T., et al. Immune cell dynamics deconvoluted by single-cell RNA sequencing in normothermic machine perfusion of the liver. Nat Commun. 14 (1), 2285 (2023).
- Cardini, B., et al. Live confocal imaging as a novel tool to assess liver quality: insights from a murine model. Transplantation. 104 (12), 2528-2537 (2020).
- Ding, Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising therapeutic agent for the treatment of liver diseases. Int J Mol Sci. 23 (18), 10972 (2022).
- Yaghoubi, A., et al. Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 36 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. 16 (7), 814-820 (2010).
- Xiang, J., et al. The effect of riboflavin/UVA cross-linking on anti-degeneration and promoting angiogenic capability of decellularized liver matrix. J Biomed Mater Res A. 105 (10), 2662-2669 (2017).
- Liu, P., et al. Implantation strategy of tissue-engineered liver based on decellularized spleen matrix in rats. J South Med Univ. 38 (6), 698-703 (2018).
- Xiang, J., et al. Decellularized spleen matrix for reengineering functional hepatic-like tissue based on bone marrow mesenchymal stem cells. Organogenesis. 12 (3), 128-142 (2016).
- Gao, R., et al. Hepatocyte culture in autologous decellularized spleen matrix. Organogenesis. 11 (1), 16-29 (2015).
- Liu, P., et al. Hemocompatibility improvement of decellularized spleen matrix for constructing transplantable bioartificial liver. Biomed Mater. 14 (2), 25003 (2019).
- Somuncu, &. #. 2. 1. 4. ;. Decellularization concept in regenerative medicine. Adv Exp Med Biol. 1212, 71-85 (2020).
- Neishabouri, A., Soltani, K. A., Daghigh, F., Kajbafzadeh, A. M., Majidi, Z. M. Decellularization in tissue engineering and regenerative medicine: evaluation, modification, and application methods. Front Bioeng Biotech. 10, 805299 (2022).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
- Gui, L., Muto, A., Chan, S. A., Breuer, C. K., Niklason, L. E. Development of decellularized human umbilical arteries as small-diameter vascular grafts. Tissue Eng Pt A. 15 (9), 2665-2676 (2009).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials For peripheral nerve repair and regeneration. Curr Neuropharmacol. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
