Isolering av adenoassosierte virale vektorer gjennom en enkelttrinns og halvautomatisk heparinaffinitetskromatografiprotokoll

Summary

Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for generering og rensing av adenoassosierte virale vektorer ved bruk av en optimalisert heparinbasert affinitetskromatografimetode. Den presenterer en enkel, skalerbar og kostnadseffektiv tilnærming, og eliminerer behovet for ultrasentrifugering. De resulterende vektorene utviser høy renhet og biologisk aktivitet, noe som viser deres verdi i prekliniske studier.

Abstract

Adenoassosiert virus (AAV) har blitt en stadig mer verdifull vektor for in vivo genlevering og gjennomgår for tiden kliniske studier på mennesker. Imidlertid bruker de ofte brukte metodene for å rense AAVer cesiumklorid eller iodixanoltetthetsgradient ultrasentrifugering. Til tross for fordelene er disse metodene tidkrevende, har begrenset skalerbarhet og resulterer ofte i vektorer med lav renhet. For å overvinne disse begrensningene, vender forskere oppmerksomheten mot kromatografiteknikker. Her presenterer vi en optimalisert heparinbasert affinitetskromatografiprotokoll som fungerer som et universelt fangsttrinn for rensing av AAV-er.

Denne metoden er avhengig av den iboende affiniteten til AAV serotype 2 (AAV2) for heparansulfatproteoglykaner. Spesifikt innebærer protokollen at plasmider koder for de ønskede AAV-kapsidproteinene med AAV2, noe som gir mosaikk-AAV-vektorer som kombinerer egenskapene til begge foreldreserotypene. Kort sagt, etter lysering av produsentceller, blir en blanding som inneholder AAV-partikler direkte renset etter en optimalisert enkelttrinns heparinaffinitetskromatografiprotokoll ved bruk av et standard FPLC-system (Fast Protein Liquid Chromatography). Rensede AAV-partikler blir deretter konsentrert og utsatt for omfattende karakterisering med hensyn til renhet og biologisk aktivitet. Denne protokollen tilbyr en forenklet og skalerbar tilnærming som kan utføres uten behov for ultrasentrifugering og gradienter, noe som gir rene og høye virale titere.

Introduction

Adeno-associated virus (AAV) vektor er i ferd med å erobre sin vei som et av de mest lovende leveringssystemene i dagens genterapistudier. Opprinnelig identifisert i 1965¹, er AAV et lite, ikke-innkapslet virus, med et icosahedral proteinkapsid på ca. 25 nm i diameter, som har et enkeltstrenget DNA-genom. AAV-er tilhører Parvoviridae-familien og Dependoparvovirus-slekten på grunn av deres unike avhengighet av samtidig infeksjon med et hjelpervirus, som herpes simplex-virus eller, oftere, adenovirus, for å fullføre sin lytiske syklus ^2,3.

Det 4,7 kilo tunge genomet til AAV-er består av to åpne leserammer (ORF) flankert av to inverterte terminale repetisjoner (ITR) som danner karakteristiske T-formede hårnålsender⁴. ITR er de eneste cis-virkende elementene som er kritiske for AAV-pakking, replikering og integrasjon, og er derfor de eneste AAV-sekvensene som beholdes i rekombinante AAV (rAAV) vektorer. I dette systemet leveres genene som er nødvendige for vektorproduksjon separat, i trans, slik at genet av interesse kan pakkes inn i viruskapsidet ^5,6.

Hvert virusgen kodifiserer forskjellige proteiner gjennom alternativ spleising og startkodoner. Innenfor Rep ORF er fire ikke-strukturelle proteiner (Rep40, Rep52, Rep68 og Rep78) kodet, og spiller avgjørende roller i replikasjon, stedsspesifikk integrasjon og innkapsling av viralt DNA ^7,8. Cap ORF fungerer som en mal for uttrykket av tre strukturelle proteiner som skiller seg fra hverandre ved deres N-terminal, (VP1, VP2 og VP3), som samles for å danne et 60-mer viralt kapsid i forholdet 1: 1: 10 ^4,9. I tillegg koder et alternativt ORF nestet i Cap-genet med et ikke-konvensjonelt CUG-startkodon for et samlingsaktiverende protein (AAP). Dette nukleære proteinet har vist seg å interagere med de nylig syntetiserte kapsidproteinene VP1-3 og fremme kapsidmontering^10,11.

Forskjeller i aminosyresekvensen til kapsidet forklarer de 11 naturlig forekommende AAV-serotypene og over 100 varianter isolert fra mennesker og ikke-humant primatvev ^7,12,13. Variasjoner i konformasjonen av strukturelt variable regioner styrer de distinkte antigene egenskapene og reseptorbindende spesifisitetene til kapsider fra forskjellige stammer. Dette resulterer i distinkte vevstropismer og transduksjonseffektivitet på tvers av forskjellige pattedyrorganer¹⁴.

Tidlige produksjonsmetoder for rAAVs baserte seg på adenovirusinfeksjon for hjelperformål 15,16,17,18,19. Til tross for at det er effektivt og vanligvis enkelt å produsere i stor skala, oppstår flere problemer fra denne infeksjonen. Selv etter rensingen og et varmedenaturerende trinn for inaktivering kan adenovirale partikler fortsatt være til stede i AAV-preparater, noe som utgjør et uønsket sikkerhetsproblem²⁰. Videre er tilstedeværelsen av denaturerte adenovirale proteiner uakseptabelt for klinisk bruk. Andre produksjonsstrategier utnytter rekombinante herpes simplex-virusstammer konstruert for å bringe Rep / Cap og transgen inn i målcellene²¹ eller av baculovirus-insektcellesystemet²². Selv om disse systemene gir fordeler når det gjelder skalerbarhet og GMP-kompatibilitet, står de fortsatt overfor lignende problemer.

Trippeltransfeksjonsmetoden for rAAV-produksjon har ofte blitt brukt for å enkelt overvinne disse problemene. Kort fortalt er rAAV-samlingen avhengig av transient transfeksjon av celler med tre plasmider som koder for: 1) transgenekspresjonskassetten pakket mellom ITR-ene fra villtype AAV2-genomet (pITR); 2) Rep / Cap-sekvensene som er nødvendige for replikasjon og virionmontering (pAAV-RC); og 3) de minimale adenovirale proteinene (E1A, E1B, E4 og E2A) sammen med adenovirusvirusassosierte RNA som kreves for hjelpereffekten (pHelper) ^6,20,23. Mens plasmidtransfeksjonsmetoder gir enkelhet og fleksibilitet for rAAV-produksjon i prekliniske studier, har disse prosedyrene begrensninger når det gjelder skalerbarhet og reproduserbarhet når de brukes på storskala produksjon. Som en alternativ tilnærming kan rAAV-produksjon oppnås ved bruk av AAV-produsentcellelinjer (med både adherent og suspensjonsvekst), som stabilt uttrykker enten AAV Rep/Cap-gener eller Rep/Cap i kombinasjon med vektorkonstruksjoner. I disse systemene blir adenovirale hjelpergener introdusert gjennom plasmidtransfeksjon. Selv om denne strategien forbedrer skalerbarheten til cellekulturprosessen, er den teknisk kompleks og tidkrevende 21,24,25.

I begge tilfeller lyseres produsentcellene og utsettes for ett eller flere rensetrinn. For tiden inkluderer de viktigste metodene for rensing av rAAVs bruk av cesiumklorid (CsCl) eller iodixanol ultra-high speed density gradient sentrifugering fulgt, eller ikke, av kromatografiteknikker²⁶. Det opprinnelige renseskjemaet for viral utfelling brukte ammoniumsulfat, etterfulgt av to eller tre runder med ultrasentrifugering gjennom en CsCl-gradient. De viktigste fordelene ved denne prosessen inkluderer muligheten til å rense alle serotyper og evnen til fysisk å skille fulle partikler fra tomme kapsider basert på deres forskjellige tettheter. Denne metoden er imidlertid forseggjort, tidkrevende og har begrenset skalerbarhet, noe som ofte resulterer i dårlig utbytte og lav prøvekvalitet 27,28,29,30. Videre er dialyse mot en fysiologisk buffer ofte nødvendig før in vivo studier på grunn av de toksiske effektene som CsCl kan utøve på pattedyr.

Iodixanol har også blitt brukt som et alternativt iso-osmotisk gradientmedium for å rense rAAV-vektorer, med fordeler over CsCl fra både sikkerhets- og vektorstyrkesynspunkter. Imidlertid, som CsCl, presenterer iodixanol-metoden noen ulemper knyttet til belastningskapasiteten til cellekulturlysat (og dermed skalerbarheten til rAAV-rensing), og det er fortsatt en tidkrevende og kostbar metode^30,31.

For å overvinne disse begrensningene, vendte forskerne oppmerksomheten mot kromatografiteknikker. I denne forbindelse ble det utviklet flere rensemetoder som enten inkorporerer affinitets-, hydrofobe eller ionebytterkromatografimetoder. Disse metodene er avhengige av de biokjemiske egenskapene til en bestemt serotype, inkludert deres naturlige reseptorer, eller ladningsegenskapene til viruspartikkel³². For eksempel åpnet oppdagelsen av at AAV2, AAV3, AAV6 og AAV13 fortrinnsvis binder seg til heparansulfatproteoglykaner (HSPG), muligheten for å bruke det nært beslektede heparinet i affinitetskromatografirensing. Imidlertid kan bindingsstedene til HSPG variere mellom serotyper, mediere AAV-tilknytning og infeksjon av målceller på forskjellige måter 2,33,34,35,36. På den annen side binder AAV1, AAV5 og AAV6 seg til N-bundet sialinsyre (SA), mens AAV4 bruker O-bundet SA ^2,14,34. Etter samme begrunnelse er det også utviklet en ett-trinns affinitetskromatografiprotokoll for rensing av rAAV5 basert på bruk av mucin, et pattedyrprotein som er høyt anriket i SA³⁷. Som heparinbaserte teknikker er denne rensingen også avhengig av den spesifikke serotypen som genereres. Bortsett fra heparin og mucin, har andre ligander blitt undersøkt for affinitetskromatografi, slik som A20 monoklonalt antistoff og kamelid enkeltdomeneantistoffer (AVB Sepharose og POROS CaptureSelect) 22,23,38,39,40,41. Andre innovative strategier for å forbedre de tidligere eksisterende rensemetodene innebærer innføring av små modifikasjoner i rAAV-kapsidet for å presentere spesifikke bindingsepitoper. For eksempel kan heksa-histidinmerkede eller biotinylerte rAAVer renses ved hjelp av ligander som retter seg mot disse epitopene (henholdsvis nikkelnitrilotrieddiksyre og avidinharpikser)42,43,44.

I et forsøk på å utvide de ønskede egenskapene til rAAV, har etterforskerne krysskledd virionene ved å blande kapsidene deres. Dette oppnås ved å tilføre kapsidgenet fra to distinkte AAV-serotyper i ekvimolære eller forskjellige forhold under produksjonen, noe som gir opphav til en kapsidstruktur sammensatt av en blanding av kapsidunderenheter fra forskjellige serotyper 34,45,46,47,48,49,50 . Tidligere studier gir fysiske bevis på at samuttrykkende kapsidproteiner fra AAV2 med AAV1 (1:1-forhold) og AAV2 med AAV9 (1:1-forhold) resulterer i generering av mosaikk-rAAV1/2- og rAAV2/9-vektorer, henholdsvis 45,46,48. En stor fordel med genereringen av mosaikk-rAAV-er er kapasiteten til å integrere fordelaktige egenskaper fra forskjellige AAV-serotyper, noe som resulterer i synergistiske forbedringer i transgenuttrykk og tropisme, samtidig som andre egenskaper som er nyttige under rAAV-produksjon, opprettholdes. Interessant nok viser visse mosaikkvarianter til og med nye egenskaper som er forskjellige fra foreldrevirus 46,47,49. Ved å utnytte den heparinbindende evnen til AAV2, kan mosaikk-rAAV-vektorer potensielt genereres og renses ved å blande AAV2 med andre naturlige eller nye AAV-kapsider generert av rettet evolusjon og/eller rasjonell design. Ikke desto mindre har tidligere studier fremhevet viktigheten av kapsidunderenhetskompatibilitet når man forsøker å sette sammen mosaikkvektorer. For eksempel viste Rabinowitz og kolleger at selv om transkapsidasjonen av AAV1, AAV2 og AAV3 førte til en effektiv sammontering av mosaikkkapsider, hindret kryssdressingen av disse serotypene med AAV4 genereringen av stabile virioner 34,45,47. I tillegg viste AAV1, AAV2 og AAV3 lav kompatibilitet med AAV5, gitt de reduserte virale titere oppnådd ved blanding av disse kapsidene i forskjellige forhold. Interessant nok viste mosaikk rAAV2/5 reduserte heparinbindende egenskaper, samtidig som mucinbindingsevnen som foreldrenes AAV5 ble opprettholdt. Imidlertid bevarte rAAV3/5 i forholdet 3:1 den doble bindingen til heparin og mucin. Samlet sett kan genereringen av nye mosaikk-rAAV-er med forbedret transduksjon, spesifikk tropisme eller lav immunogenitet ha stor nytte av vår forståelse av kapsidmontering og reseptorinteraksjoner, med spesifikke kombinasjoner som fortsatt krever grundig undersøkelse og optimalisering.

I dette arbeidet beskriver vi en trinnvis protokoll for produksjon og rensing av rAAVer ved hjelp av en optimalisert heparinaffinitetskromatografimetode. rAAV produseres ved forbigående transfeksjon og renses ved hjelp av et raskt proteinvæskekromatografisystem (FPLC). Etter konsentrasjonen av utvalgte rensede fraksjoner karakteriseres de resulterende virale bestandene i form av titer, renhet, iboende fysiske egenskaper og biologisk aktivitet in vitro og in vivo. Som et bevis på konsept demonstrerer vi forbedringene og anvendeligheten av denne protokollen for generering av mosaikk rAAV1/2 og rAAV2/9 vektorer. Valget av hver serotype var basert på deres påfallende forskjellige tropismer, som potensielt også ga deres unike egenskaper til mosaikkversjonene. AAV serotype 1, med en generell moderat tropisme for sentralnervesystemet (CNS), har evnen til å transdusere nevroner og glia (i mindre grad) og gjennomgår aksonal transport i anterograd og retrograd retning in vivo ^2,7,8. I tillegg ble AAV serotype 9 valgt for sin naturlige evne til å krysse blod-hjernebarrieren og målrette CNS hos både nyfødte og voksne mus^51,52. Til slutt ble AAV serotype 2 valgt på grunn av evnen til å binde seg til heparin, noe som muliggjorde affinitetskromatografi³³. De rensede rAAV1/2- og rAAV2/9-partiklene kombinerer egenskapene til begge foreldrenes AAV-serotyper og utgjør derfor egnede vektorer for transduksjon av CNS 45,46,48,49.

Protocol

MERK: Se figur 1 for en illustrasjon som oppsummerer protokollen. Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og reagenser som brukes i denne protokollen. Alt arbeid som involverer celler og virus skal utføres i dedikerte biosikkerhetsskap og inkubatorer, skilt fra de som regelmessig brukes til vedlikehold av cellelinjer. Utstyr og reagenser som kommer i kontakt med dyrkede celler og virus skal være sterile. Det er avgjørende at destruksjon av farlige reagenser og materialer som er forurenset med virus, utføres i samsvar med sikkerhetsdatabladene og i samsvar med nasjonale lover og retningslinjer gitt av den enkelte institusjons kontor for helse, miljø og sikkerhet. Per april 2019 kategoriserer NIHs retningslinjer for forskning som involverer rekombinante eller syntetiske nukleinsyremolekyler som risikogruppe 1-midler (ikke assosiert med sykdom hos friske voksne mennesker) alle AAV-serotyper, samt rekombinante eller syntetiske AAV-konstruksjoner. Denne klassifiseringen gjelder når transgenet ikke koder for et potensielt tumorigent genprodukt eller et toksin, og konstruksjonene er produsert uten et hjelpervirus. Alle eksperimenter som involverer dyr ble utført i samsvar med EUs fellesskapsdirektiv (2010/63 / EU) for pleie og bruk av forsøksdyr, transponert i portugisisk lov i 2013 (dekret lov 113/2013). I tillegg ble dyreprosedyrer godkjent av den ansvarlige organisasjonen for dyrevelferd ved Det medisinske fakultet og Senter for nevrovitenskap og cellebiologi ved University of Coimbra lisensiert dyreanlegg. Forskerne fikk tilstrekkelig opplæring (FELASA-sertifisert kurs) og sertifisering fra portugisiske myndigheter (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisboa, Portugal) for å utføre eksperimentene. 1. Plasmid konstruksjoner Følg produsentens instruksjoner for et maxiprep endotoksinfritt sett for å isolere og rense betydelige DNA-mengder av følgende plasmider: i) pITR: overføringsvektoren av interesse; ii) pAAV-RC-plasmid: pRV1, som inneholder AAV2 Rep – og Cap-sekvensene 36; iii) pAAV-RC-plasmid: pH21, som inneholder AAV1 Rep – og Cap-sekvensene 36; iv) pAAV-RC-plasmid: pAAV2/9n, som inneholder AAV2 Rep – og AAV9 Cap-sekvensene ; v) pHelper: pFdelta6, Adenovirus-helper plasmid36. Overvåk integriteten til de genererte plasmidene ved å utføre de anbefalte enzymatiske restriksjonene36. Overvåk integriteten til pITR-plasmider ved fordøyelse med SmaI, en restriksjon endonuclease, som kutter to ganger innenfor en ustabil del av ITR53,54.MERK: Siden ITR er svært ustabile og utsatt for slettinger, anbefales bruk av SURE 2 superkompetente celler for å minimere rekombinasjon på disse nettstedene. 2. Cellekultur Dyrkning av human embryonal nyre 293, som stabilt uttrykker SV40 stort T-antigen (HEK293T) cellelinje i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) høy glukose, supplert med 10% fosterbovint serum og 1% penicillin-streptomycin, ved 37 ° C, under en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO2, som utgangspunkt for påfølgende trinn. Subkultur cellene ved hjelp av steril 1x fosfat bufret saltvann (PBS), pH 7,4, for å vaske cellene før tilsetning 0,05% trypsin-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA).MERK: Unngå å bruke celler som har gjennomgått et for stort antall passasjer (maksimalt 20). Test regelmessig cellekulturer for mykoplasmaforurensning. 3. rAAV-produksjon ved forbigående transfeksjon Dag 1: CellebeleggFor hver virusproduksjon, plate HEK293T celler i 10 behandlede kulturretter (15 cm diameter) dagen før transfeksjon, med en tetthet på 10,5 × 106 celler per tallerken i 22 ml tilsatt kulturmedium og inkuber i 24 timer til cellene er 70% -80% konfluente og klare for transfeksjon. Dag 2: Celletransfeksjon ved bruk av polyetylenimin (PEI)For hver virusproduksjon (tilsvarende 10,5 retter), sett opp følgende transfeksjonsblanding i et mikrosentrifugerør: 54,6 μg pITR; 45.675 μg pRV1; 45,675 μg pH21 eller pAAV2/9n; 109,2 μg pFdelta6. Bland ved å trykke. Tilsett blandingen til 4.557 ml ikke-tilsatt DMEM i et 50 ml sentrifugerør. Bland ved å trykke. Tilsett 1,365 ml steril PEI-oppløsning ved 1 mg/ml (pH 7,4), dråpe for dråpe. Bland ved å trykke. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur for å tillate dannelse av DNA-PEI-komplekser. Tilsett denne blandingen til 231 ml forvarmet tilsatt DMEM. Bytt ut hele kulturmediet til hver tallerken med 22 ml av denne transfeksjonsblandingen. Inkuber cellene i 48 timer.MERK: Dette trinnet må utføres med forsiktighet for å unngå celleløsrivelse. Dag 4: CellehøstingNår pITR koder for en fluorescerende reporter, visualiser de transfekterte cellene under et fluorescensmikroskop. Samle mediet fra hver tallerken i 50 ml sentrifugerør og sentrifuge dem ved 800 × g i 10 minutter. Kast supernatanten.MERK: Dette trinnet er valgfritt og tar sikte på å gjenopprette transfekterte celler som kan ha løsnet på grunn av en svært høy konfluens. Tilsett 10 ml forvarmet PBS til hver plate. Fjern cellene forsiktig med en celleskrape og samle suspensjonen i 50 ml sentrifugerør fra trinn 3.3.2. Vask 5 retter om gangen med 10 ml ekstra PBS og overfør suspensjonen til 50 ml sentrifugerør fra trinn 3.3.3. Pellet cellene ved 800 × g i 10 minutter og kast supernatanten. Frys cellepelletsene ved -80 °C.MERK: Cellepellets kan lagres i flere måneder (pausepunkt). 4. rAAV-ekstraksjon og FPLC-rensing Dag 5: Klargjøring av cellelysatTine cellepellets ved romtemperatur. Resuspender cellene samlet fra de 10 rettene i 100 ml av en steril buffer inneholdende 150 mM natriumklorid (NaCl) og 20 mM Tris, pH 8,0, i ultrarent (type I) vann. Bland suspensjonen ved å pipettere opp og ned for å sikre en homogen suspensjon. Tilsett 12,5 ml av en tilberedt steril oppløsning av 10 % natriumdeoksykolat i ultrarent vann for å indusere cellelyse. Bland ved å pipettere opp og ned.MERK: Kast natriumdeoksykolat, samt materialene som er i kontakt med det, i samsvar med sikkerhetsdatabladet og retningslinjene gitt av institusjonens miljøhelse- og sikkerhetskontor. Det anbefales også å bruke ansiktsmaske mens du håndterer dette pulveret. Etter blanding blir løsningen svært viskøs. Tilsett 27 μL benzonasenuklease til den forrige blandingen. Bland godt ved å pipettere opp og ned til prøven ikke lenger er tyktflytende. Inkuber ved 37 °C i 1 time, og utfør en virvel hvert 10. minutt.MERK: Denne endonukleasen er i stand til effektivt å nedbryte alle former for DNA og RNA uten å utvise noen proteolytisk aktivitet. Fjern cellulært rusk ved å sentrifugere blandingen ved 3000 × g i 60 minutter ved 25 °C. Filtrer supernatanten med et 0,45 μm sterilt polyvinylidendifluorid (PVDF) sprøytefilter og overfør det til en ny steril beholder.MERK: Dette viktige trinnet sikrer at det meste av cellulært rusk fjernes, og forhindrer derfor tilstopping av kromatografikolonner. Lagre en liten aliquot av denne blandingen for analyse (valgfritt trinn). Dag 5 (videreført): Rensing av heparinkolonne av rAAVsMERK: Prøvepåføring kan utføres ved hjelp av en prøvepumpe eller en 50 ml eller 150 ml supersløyfe som en del av systemet. Siden mer luft oppløses ved lavere temperaturer, er det viktig å gi tilstrekkelig tid til at bufferne og løsningene (vanligvis lagret ved 4 °C) kan akklimatisere seg til romtemperatur før de brukes i FPLC-systemet.Valgfritt: Hvis systemet har vært lagret i lange perioder, fyll systemet og alle inntak med nylaget lagringsløsning (20 % etanol) ved hjelp av manuelle instruksjoner eller en forhåndsdefinert systemrengjøring på stedet (system CIP)-metode. Vask væskestrømningsbanen fullstendig med sterilt ultrarent vann ved hjelp av manuelle instruksjoner eller en forhåndsdefinert system CIP-metode. Koble til en 1 ml ferdigpakket heparinkolonne, still inn trykkalarmen og vask med fem kolonnevolumer (CV) ultrarent vann med en strømningshastighet på 1 ml / min. Bytt oppløsningene i bufferbrettet fra ultrarent vann til buffer A (steril oppløsning på 100 mM NaCl og 20 mM Tris, pH 8, i ultrarent vann) for innløp A (systempumpe A) og til buffer B (steril oppløsning på 500 mM NaCl og 20 mM Tris, pH 8, i ultrarent vann) for innløp B (systempumpe B). Hvis systemet har en prøvepumpe, plasserer du bufferinnløpet til prøveinnløpsventilen i buffer A. Vask systempumpen B med buffer B og fyll resten av væskestrømningsbanen med buffer A.MERK: Koble om nødvendig kolonnen fra flytbanen og koble den til igjen etterpå. Sett inn et prøveinnløpsrør fra prøveinnløpsventilen, for eksempel S1, i beholderen med viruspreparatet oppnådd i trinn 4.1.4. (fra cellelysatpreparat). Klargjør strømningsbanen fra prøveinnløp S1 til injeksjonsventilen med prøveløsningen. Alternativt kan du fylle en 50 ml eller 150 ml supersløyfe med prøven som inneholder rAAVs ved hjelp av en 50 ml sprøyte. Balansere kolonnen med et totalt volum på fem CVer ved å bruke 12,5 % buffer B med en hastighet på 1 ml/min. Påfør det totale volumet av prøven i kolonnen ved hjelp av prøvepumpen (velg injiser all prøve ved hjelp av luftsensor) eller supersløyfen ved 0,5 ml / min, og samle gjennomstrømningen ved hjelp av utløpsporten i en ny steril beholder.MERK: Når strømningskontrollen for å forhindre overtrykksfunksjon er aktivert, reduseres strømningen automatisk i tilfelle tilstopping av kolonnen. Hvis strømningshastigheten faller betydelig under 0,5 ml/min, må du stoppe prøveapplikasjonen, utføre en vask med 2-5 CV buffer A, og deretter gjenoppta prøveapplikasjonen. Vask kolonnen på 1 ml / min med 20 CV buffer A, samle gjennomstrømningen ved hjelp av utløpsporten. Eluer prøven ved 1 ml / min med følgende skjema: i) lineær gradient med et mål på 50% av buffer B for fem CVer; ii) trinn med et mål på 90 % av buffer B i løpet av fem CV-er; iii) trinn med et mål på 100 % av buffer B i løpet av fem CV-er. Samle den eluerte prøven i 1 ml fraksjoner ved hjelp av en fraksjonskollektor og mikrosentrifugerør med lav retensjon (2 ml) og oppbevar dem ved -20 °C.MERK: rAAV-fraksjonene kan lagres i flere uker (pausepunkt). Re-balansere kolonnen ved 1 ml / min med 12,5% buffer B for fem CVer. Bytt innløpene fra bufferløsningene til ultrarent vann og vask kolonnen på 1 ml/min i fem CV-er. Bytt inntakene fra ultrarent vann til 20 % etanol og vask kolonnen på 1 ml/min i fem CV-er. Koble fra søylen og oppbevar den ved 4 °C.MERK: Kolonner kan gjenbrukes flere ganger uten andre store rengjørings- og desinfiseringsprosedyrer hvis samme rAAV-serotype og transgen brukes. Vask væskestrømningsbanen helt med 20% etanol ved hjelp av manuelle instruksjoner eller en forhåndsdefinert system CIP-metode. 5. Konsentrasjon av rensede rAAVer Dag 6: Konsentrasjon trinn 1Konsentrer rAAVs ved hjelp av en 15 ml sentrifugalfilterenhet med en 100 kDa molekylvektgrense. Legg de ønskede fraksjonene som inneholder rAAV-er (FPLC-fraksjoner 7 til 16) inn i sentrifugalfilterenheten på 15 ml og sentrifuger den ved 2000 × g i 2 minutter ved romtemperatur. Pass på at konsentrert volum i filterenheten er ca. 500 μL. Hvis det konsentrerte volumet stort sett overstiger 500 μL, gjenta sentrifugeringstrinnene i intervaller på 1 minutt til det når ønsket volum. Dag 6 (videreført): BufferutvekslingTilsett 1 ml steril PBS til sentrifugalfilterenheten som inneholder rAAV-ene. Pipetter forsiktig opp og ned for å vaske filteret. Sentrifuge ved 2000 × g i intervaller på 1 minutt til det endelige volumet på 500 μL er nådd. Dag 6 (videreført): Konsentrasjon trinn 2Overfør 500 μL konsentrerte rAAVer oppnådd i forrige trinn til en 0,5 ml sentrifugalfilterenhet med en 100 kDa molekylvektgrense og sentrifuge ved 6000 × g i 1 min. Gjenta om nødvendig sentrifugeringstrinnet til et endelig volum på mindre enn 100 μL er nådd. Dag 6 (fortsatt): RestitusjonFor å gjenopprette den konsentrerte rAAV, plasser filterenheten opp ned i et nytt mikrosentrifugeoppsamlingsrør. Plasser røret i en mikrosentrifuge med hetten mot midten og utfør et langvarig spinn inne i strømningskammeret for å overføre konsentrerte rAAV-er fra enheten til mikrosentrifugerøret. Alternativt sentrifuge ved 1000 × g i 2 min. Suppler med steril Pluronic F-68 0,001% (valgfritt).MERK: Pluronic F-68 er et ikke-ionisk overflateaktivt middel godkjent for menneskelig bruk av Food and Drug Administration som er i stand til å redusere tap av rAAVs ved å forhindre deres interaksjoner med overflatene av materialer (plast) som brukes under fortynningsforberedelse, sprøytelasting og leveringsutstyr55,56. Aliquot rAAVs i mikrosentrifugerør med lav retensjon og oppbevares ved -80 °C (pausepunkt). 6. Kvantifisering av rensede rAAVer Dag 6 (videreført): Bestem titer av rAAV-preparater, uttrykt i virale genomer/μL (vg/μL), ved sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) ved hjelp av et kommersielt sett og i henhold til produsentens instruksjoner.Inkuber rAAV-partikkelløsningen med DNase I ved 37 °C i 20 minutter.MERK: Denne prosedyren fremmer fordøyelsen av fritt genomisk DNA og plasmid-DNA avledet fra vertsceller, og sikrer dermed at bare nukleinsyresekvensen i intakte rAAV-partikler blir bevart. Varmeinaktiver DNase I ved 95 °C i 10 minutter. Tilsett lysisbuffer og inkuber i 10 minutter ved 70 °C for å fremme varmedenaturering av proteinene i rAAV-partikler. Fortynn den oppnådde rAAV-genomoppløsningen i fortynningsbuffer før du går videre til RT-qPCR. Forbered et sett med serielt fortynnede standarder for den positive kontrollen (fra 2 × 107 vg / μL til 2 × 102 vg / μL) som følger med settet. Utfør en reaksjonsblanding som inneholder 12,5 μl Taq II-blanding, 0,5 μl fortynnet primerblanding, 7 mikrol vann og 5 mikrol av fortynnet rAAV DNA (ukjent AAV-prøve og standarder fra trinn 6.1.4.). Utfør RT-qPCR i et sanntids PCR-deteksjonssystem ved å bruke følgende protokoll: 1 syklus ved 95 °C i 2 minutter (innledende denaturering) og 40 sykluser ved 95 °C i 5 s (denaturering) og 60 °C i 30 s (glødning, forlengelse og plateavlesning), etterfulgt av en smeltekurveanalyse. Beregn den absolutte prøvekonsentrasjonen fra standardkurven (lineær regresjonslinje), med tanke på fortynningsfaktoren som følger av rAAV-prøveprepareringen.MERK: Kvantifiseringen av antall virale genomer oppnås gjennom forsterkning av ITR-sekvensen av AAV2 (målsekvens av primerne levert av settet). 7. SDS-PAGE, Coomassie blå farging, og western blot Denaturere 40 μL av hver prøve (hver FPLC-fraksjon, gjennomstrømningen, forkolonneprøvene og totalt 2,3 × 1010 VG av det endelige konsentrerte produktet) ved å tilsette 6x prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl/0,4 % natriumdodecylsulfat (SDS) pH 6,8, 30 % glyserol, 10 % SDS, 0,6 M dithiothreitol (DTT), 0,012 % bromfenolblått) og inkubere prøvene i 5 minutter ved 95 °C. Legg de denaturerte prøvene (48 μL) i en SDS-polyakrylamidgel (4% stabling og 10% oppløsende gel) og utfør den elektroforetiske separasjonen ved 100 V i 70 minutter, ved siden av en proteinstige. Protein analyseMERK: Enten Coomassie blå farging eller vestlig blotting kan utføres.Coomassie blå flekkerFor å visualisere proteinbånd, flekk gelen i 10 minutter med en 0,25% Coomassie blå G250-løsning oppløst i 50% metanol og 10% eddiksyreis. Utfør gelfarging ved å vaske den flere ganger med en løsning som inneholder 25% metanol og 5% eddiksyreisbre til klare bånd med lav bakgrunn blir synlige. Ta bilder ved hjelp av et passende bildesystem. Western blotOverfør proteinene til en PVDF-membran i henhold til standardprotokoller. Blokker membranen ved inkubering i 5% fettfri melk fortynnet i TBS-T (0,1% mellom 20 i Tris-bufret saltvann) i 1 time ved romtemperatur. Bruk følgende primære antistoffer (fortynnet i blokkerende oppløsning) for inkubasjonen over natten ved 4 °C: monoklonalt anti-AAV-derivat, VP1, VP2, VP3-antistoff (B1, 1:1000) eller monoklonalt anti-AAV-, VP1-, VP2-antistoff hos mus (A69, 1:1000). Vask membranene i 3 x 15 minutter i TBS-T og inkuber med et alkalisk fosfatase-bundet geit anti-mus sekundært antistoff (1:10.000), i 2 timer ved romtemperatur. Vask membranene i 3 x 15 min i TBS-T. Legg til forbedret kjemifluorescerende substrat (ECF) og visualiser proteinbånd ved kjemifluorescensavbildning. 8. Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) Plasser et Formvar-karbonbelagt 200-nettinggitter opp ned på toppen av en dråpe av en rAAV-prøve og la den slå seg ned i 1 min. Vask ristene i en dråpe vann og tørk væskeoverskuddet med filterpapir. Negativt flekker ristene med 1% uranylacetatløsning (pH 7) i 1 min for å fikse og kontrastere viruspartiklene. Vask ristene i en dråpe vann og tørk væskeoverskuddet med filterpapir. Undersøk prøvene i et transmisjonselektronmikroskop.MERK: Høye saltkonsentrasjoner kan direkte påvirke bindingen av rAAVs til rutenettet og føre til visualisering av krystalllignende strukturer. 9. Påfølgende ultrafiolett-synlig lysabsorpsjon, statisk lysspredning og dynamisk lysspredningsanalyse På en 96-brønns kvantifiseringsplate, last 2 μL av en rAAV-prøve og 2 μL PBS som skal brukes som bufferemne (utfør dette i duplikater). Bruk applikasjonen AAV Quant i klientanalyseprogrammet, plasser navnene på prøvene på riktig plassering av platen, velg AAV-serotype og klikk på Neste. Last kvantifiseringsplaten med 96 brønner inn i det dedikerte utstyret og fortsett med plateavlesning for datainnsamling. 10. In vitro transduksjonsanalyser Ulike cellelinjer kan brukes til raskt å analysere transduksjonseffektiviteten til rAAV.Jevnt frø HEK293T celler i 24-brønnsplater (ved en tetthet på 137 500 celler / brønn) og en museneuroblastom-2A (Neuro2a) cellelinje i enten 24-brønnsplater (50.000 celler / brønn) eller i et 8-brønns kammerlysbilde (27.000 celler / brønn), ved bruk av DMEM høy glukose, supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin, som beskrevet ovenfor. La cellene feste seg over natten ved 37 °C i en fuktet atmosfære som inneholder 5 % CO2. Samle opp kondisjonert medium fra hver brønn (250 μL fra 24-brønnsplater og 50 μL fra 8-brønns kammerlysbildet) og oppbevar det ved 4 °C for senere bruk. Legg følgende rAAV-preparater til hver brønn og inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære.Tilsett 50 μL av de FPLC-oppsamlede fraksjonene F2-F16 og gjennomstrømning til HEK293T celler belagt med 24-brønnplater. Tilsett totalt 5,5 × 109 vg av de konsentrerte rAAVene fortynnet i 50 μL PBS til Neuro2a-celler belagt i 24-brønnsplater (inkluder en negativ kontrollbrønn ved å tilsette 50 μL PBS til cellene). Legg til totalt 2,75 × 109 vg av de konsentrerte rAAVene fortynnet i 25 μL PBS til Neuro2a-celler belagt i et 8-brønns kammerlysbilde (inkluder den negative kontrollbetingelsen ved å tilsette 50 μL PBS til cellene). Legg til det tidligere lagrede betingede mediet (trinn 10.1.2) til hver brønn og inkuber i 24 timer. Kast mediet og vask cellene 2x med PBS. Tilsett en 4% paraformaldehyd (PFA) løsning, supplert med 4% sukrose i PBS, forvarmet til 37 ° C, til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. Vask 2x med PBS og oppbevares ved 4 °C til avbildning er utført (pausepunkt). Ta bilder på et invertert fluorescensmikroskop utstyrt med et 10x/0.30-mål, eller et invertert konfokalmikroskop utstyrt med et 40x/1.4 olje-DIC-mål. For å få en mer relevant og reflekterende modell av in vivo-miljøet , bruk primære nevrale kulturer som følger:Forbered primære kulturer av kortikale nevroner som tidligere beskrevet av Santos et al.57. Kort sagt, frø 200.000 celler / ml i 12-brønnsplater og hold dem i kultur til dag in vitro 16. Samle opp kondisjonert medium fra hver brønn (100 μL) og oppbevar det ved 4 °C for senere bruk. Legg til rAAV-ene som skal testes til hver brønn: totalt 2,75 × 109 vg av de konsentrerte rAAV-ene fortynnet i 25 μL PBS (inkluderer den negative kontrollen: 25 μL PBS). Inkuber i 24 timer ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære. Tilsett det betingede mediet som tidligere er lagret og inkuber i 24 timer. Kast mediet i hver brønn og vask 2x med PBS. Fest cellene med 4% PFA / 4% sukrose i PBS, som beskrevet i trinn 10.1.6. Vask 2x med PBS. Inkuber hver brønn med 5 μg / ml hvetekimagglutinin (WGA) konjugert med Alexa Fluor 633 i 10 minutter ved romtemperatur (valgfritt trinn: utfør immunocytokjemi i stedet). Vask 2x med PBS. Inkuber i 0,25% Triton X-100 i PBS i 5 minutter ved romtemperatur. Vask med PBS. Inkuber med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 5 minutter ved romtemperatur. Vask 2x med PBS. Ta bilder på et invertert fluorescensmikroskop utstyrt med et 40x/0.95-objektiv, eller et invertert konfokalmikroskop utstyrt med et 40x/1.4 olje-DIC-mål. 11. In vivo eksperimenter MERK: Dyrene ble plassert i et temperaturkontrollert rom, vedlikeholdt på en 12 timers lys / mørk syklus. Mat og vann ble gitt ad libitum. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere dyrs lidelse. Stereotaktisk injeksjon i lillehjernenBedøve 9 uker gamle C57BL/6 dyr ved innånding av 2% isofluran i nærvær av oksygen (0,8 l / min) i et kammer koblet til en fordamper. Plasser det bedøvede dyret i det stereotaktiske apparatet (på en 35 °C varm pute) og plasser isofluran masken i dyrets nese. Skru isoflurannivået ned til 1,3-1,7%.MERK: Forsikre deg om at dyret er riktig bedøvet før du fortsetter (tap av refleks for fleksjon i begge bakre lemmer). Påfør smøremiddel øyesalve for å unngå tørking av hornhinnene og injiser dyret med et godkjent smertestillende middel.MERK: Alle påfølgende trinn må utføres under sterile forhold. Etter barbering av pelsen på dyrets hode og desinfisering av operasjonsområdet, utsett skallen og plasser spissen av en 30 G stump injeksjonsnål, koblet til en 10 μL Hamilton sprøyte, rett over bregma (bruk bregma som null for beregning av stereotaktiske koordinater). Flytt nålen til den tiltenkte koordinaten og bor et hull gjennom skallen der nålen vil komme inn.MERK: I rammen av denne studien ble en enkelt injeksjon utført sentralt i lillehjernen. Injiser 4 μL av en oppløsning av rAAVs inneholdende totalt 8 × 109 vg, fortynnet i PBS, med en infusjonshastighet på 0,5 μL/min ved bruk av en automatisk injektor. Bruk følgende koordinater, beregnet fra bregma, for å utføre en enkelt injeksjon sentralt i lillehjernen til en voksen C57BL/6-mus: antero-posterior: -6,5 mm; lateral: 0 mm; ventral: -2,9 mm.MERK: Disse koordinatene kan variere i henhold til musestamme, kjønn og alder på dyrene som er i bruk. For å minimere tilbakestrømning og tillate viral vektordiffusjon, når infusjonen er fullført, la sprøytenålen være på disse koordinatene i 3 minutter, trekk den sakte inn med 0,3 mm og la den forbli på plass i ytterligere 2 minutter før den fjernes fullstendig fra musehjernen. Lukk snittet og rengjør det med et desinfeksjonsmiddel (f.eks. 10% povidon-jod). La dyrene komme seg fra anestesi før du returnerer dem til hjemmeburene. Vevsinnsamling og forberedelseMERK: I dette eksperimentet ble transduksjonsnivåene observert 12 uker etter injeksjon, men den samme prosedyren kunne evalueres så snart som 4 uker etter injeksjon.Terminalt anestesere dyrene ved intraperitoneal administrering av en overdose xylazin/ketamin (8/160 mg/kg kroppsvekt). Transkardielt perfusere dyrene med iskald PBS i 6 minutter med en hastighet på 2,5 ml / min, etterfulgt av perfusjonen med en nylaget iskald 4% PFA-løsning i 10 minutter i samme hastighet. Postfiks de utskårne hjernene i 4% PFA over natten ved romtemperatur og overfør dem deretter til en 25% sukrose / PBS-løsning for kryobeskyttelse. Når hjernen synker (ca. 48 timer senere), oppbevar dem ved -80 °C. Skjær serielle sagittale seksjoner med en tykkelse på 30 μm ved hjelp av en kryostat ved -21 °C. For hvert dyr, samle 96 sagittale seksjoner av en hjernehalvdel i anatomiske serier som frittflytende seksjoner i PBS supplert med 0,05% natriumazid. Oppbevares ved 4 °C inntil videre behandling. Standard fluorescens immunhistokjemiVelg åtte sagittale seksjoner per dyr, i en avstand på 240 μm fra hverandre. Inkuber de frittflytende seksjonene i blokkerings-/permeabiliseringsløsning (0,1 % Triton X-100 inneholdende 10 % normalt geiteserum (NGS) i PBS) i 1 time ved romtemperatur. Inkuber seksjonene over natten ved 4 °C med kylling polyklonalt anti-GFP primært antistoff (1:1,000). Vask i 3 x 15 min i PBS og inkuber seksjonene i 2 timer ved romtemperatur med det sekundære antistoffet geit polyklonalt anti-kyllingantistoff konjugert til Alexa Fluor 488 fluorofor (1:200). Vask i 3 x 15 min i PBS. Inkuber med DAPI i 5 minutter ved romtemperatur. Vask i 3 x 15 min i PBS. Plasser seksjonene i gelatinbelagte lysbilder og dekkslipp med fluorescensmonteringsmedium. Skaff bilder på et lysbildeskannerfluorescensmikroskop utstyrt med et 20x / 0.8-mål.

Representative Results

I dette arbeidet presenterer vi en detaljert protokoll for produksjon, rensing og karakterisering av mosaikk rAAVs (oppsummert i figur 1), som har potensial til å målrette og transdusere CNS (f.eks. AAV1 og AAV9), som samtidig er egnet for heparinaffinitetskromatografirensing (AAV2). For å oppnå dette ble kapsider fra naturlige AAV-serotyper 1, 2 og 9 brukt til å utvikle mosaikk rAAV1/2 og rAAV2/9 vektorer. Før oppstart ble plasmidpreparater screenet for strukturell integritet. I tillegg til fordøyelsen som er nødvendig for å validere riktig innsetting av kloningsfragmenter, er det viktig å konsekvent screene pITR-plasmider for å oppdage potensielle ITR-slettinger/innsettinger. Som et eksempel ble integriteten til ITR i forskjellige kloner av et pITR-plasmid overvåket etter plasmidfordøyelsen med restriksjonsenzymet SmaI (tilleggsfigur S1). Begge typer mosaikkvektorer ble generert ved ko-transfeksjon av de respektive AAV-kapsidplasmidene i forholdet 1:1, i henhold til standard transfeksjonsmetoder6. Kort fortalt ble HEK293T celler transfeksjonert med i) et plasmid som inneholdt transgenet av interesse pakket mellom ITR (pITR) -sekvensene, ii) et plasmid som inneholdt villtype AAV-genomet Rep og Cap ORFs av AAV2 og AAV1 eller AAV9 (pAAV-RC-plasmider) og iii) et plasmid som kodifiserer adenovirale proteiner (E1A, E1B, E4 og E2A) samt adenovirusvirusassosierte RNA som er essensielle for hjelperfunksjoner (pHelper). Førtiåtte timer senere ble cellene høstet 6,36, og rAAVs ble renset fra cellehomogenatet ved affinitetskromatografi ved hjelp av et FPLC-system. Som vist i figur 2A, etter kolonnelikevekt (likevektstrinn), ble cellelysatet som inneholdt rAAVene påført kolonnen (prøvebelastning). På grunn av den naturlige affiniteten til rAAV2 for heparin33, ble rAAVer bundet til kolonnens harpiks, mens andre komponenter ble utført i løpebufferen og detektert av UV-monitoren (gjennomstrømning), noe som resulterte i en økning i absorbansen. Kolonnen ble deretter vasket (vasketrinn) og rAAVs ble til slutt eluert av en økning av NaCl-konsentrasjonen (elueringstrinn). De eluerte virusene ble detektert av UV-monitoren og samlet i 1 ml fraksjoner. En representativ elusjonstoppprofil av rAAV1/2 og rAAV2/9 er vist i henholdsvis figur 2B og tilleggsfigur S2A, med forskjellige viruspartier som konsekvent presenterer en enkelt topp som starter ved fraksjon F7 opp til F16. Topphøyden er variabel blant rAAV-produksjoner, med høyere topper som vanligvis fører til høyere rAAV-utbytter. Hver fraksjon av de produserte rAAV1/2 og rAAV2/9 ble deretter karakterisert ved RT-qPCR for å vurdere virustitere (figur 2C og tilleggsfigur S2B). For å karakterisere renheten til det eluerte materialet ble 40 μL av hver fraksjon og av det respektive gjennomstrømningsmaterialet undersøkt ved 10% SDS-polyakrylamidgelelektroforese (figur 2D for rAAV1/2 og tilleggsfigur S2C for rAAV2/9). Coomassie blå farging avslørte tre hovedbånd i fraksjoner F7-F16, med molekylvekter tilsvarende VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) og VP3 (62 kDa) kapsidproteiner av AAVs i passende forhold 1: 1: 10, som tidligere beskrevet av Van Vliet og kolleger14. I begge tilfeller, og basert på UV-absorbans, RT-qPCR og gelbåndintensitet, er det klart at flertallet av mosaikk-rAAV-er er tilstede i fraksjonene F7 og F8 og begynner gradvis å avta i fraksjonene F9-F16. I tillegg til de tre virale kapsidproteinene ble et annet protein (eller proteiner) på ca. 17 kDa i størrelse påvist i fraksjoner F8-F16. For å eliminere dette samrensende proteinet (e) ble fraksjonene F7-16 deretter filtrert og konsentrert ved hjelp av 100 KDa sentrifugalfilterenheter, og den endelige rAAV-titeren ble bestemt av RT-qPCR (som vist i figur 3A,B for rAAV1/2). Det endelige utbyttet av en rAAV-produksjon er avhengig av lengden og kompleksiteten til pITR, integriteten til ITR-sekvenser, cellekulturforhold (f.eks. antall cellepassasjer) og transfeksjonseffektivitet 24,58,59,60,61. Ikke desto mindre kan den endelige titeren justeres ved å utføre flere sentrifugeringer av rAAV-preparatet ved bruk av 0,5 ml sentrifugalfilterenheter (konsentrasjonstrinn 2). I henhold til denne protokollen, for et endelig volum i området 50 til 100 μL, består konsentrasjonene vanligvis mellom 2 × 109 og 5 × 1010 vg/μL (kvantifisering utført ved bruk av det refererte titreringssettet). Renheten til den endelige rAAV-preps ble deretter evaluert på en 10 % SDS-polyakrylamidgel. Som vist i figur 3C ble det kun observert tre bånd som representerte rAAVs kapsidproteiner for rAAV1/2-preparatet, og ingen påviselige samrensende proteiner ble identifisert. Disse resultatene var konsistente med de som ble oppnådd for rAAV2/9 (tilleggsfigur S2C). For å bekrefte identiteten og videre karakterisere renheten til rAAV1/2- og rAAV2/9-vektorer, ble virusfraksjoner og konsentrerte bestander analysert av western blot, med de spesifikke antistoffene B1 (tilleggsfigur S3A og tilleggsfigur S4A) og A69 (tilleggsfigur S3B og tilleggsfigur S4B). Mens antistoffet B1 gjenkjenner en C-terminal epitop som er felles for alle VP-proteiner av de fleste AAV-serotyper62, gjenkjenner klonen A69 bare epitoper av VP1 og VP263. Ikke desto mindre kan noen svake bånd med molekylvekter lavere enn VP3 (<62 kDa) også detekteres ved B1- og A69-merking. For å karakterisere den strukturelle morfologien og videre evaluere renheten til rAAV, ble viruspartiklene direkte visualisert av TEM. Denne teknikken har vært standardprosedyren for å vurdere prøveintegritet og renhet i virusprøver, da den tillater kvantifisering av tomme og fulle rAAV-partikler, samt vurdering av forurensning i en prøve 29,64,65,66,67. Som vist i figur 3D kunne store mengder rAAV-partikler, ~25 nm i diameter, observeres på ren bakgrunn. Tomme partikler (svart pil) med et elektrontett senter, samt fulle vektorer (hvit pil) kunne også observeres i hele prøvefeltet. Vi utførte også kvalitetskontroll av de rensede rAAV-ene ved hjelp av Stunner, en plattform som kombinerer ultrafiolett-synlig (UV-Vis) spektroskopi, statisk lysspredning (SLS) og dynamisk lysspredning (DLS)68. For hver prøve ble den totale mengden protein, ssDNA, samt absorberende urenheter og bakgrunnsturbiditet, målt ved UV-Vis-spektroskopi (figur 3E og tilleggsfigur S5A). SLS og DLS ble deretter brukt for å vurdere lysspredningsoppførselen til rAAV-kapsider. Gitt at AAV-er har en middeldiameter på 25 nm, anses partikler innenfor et diameterområde på 15-45 nm som intakte. Større partikler representerer vanligvis virale aggregater, og alt mindre består mest sannsynlig av små partikler, inkludert umonterte kapsidproteiner68. For rAAV1/2 ble det observert en enkelt topp tilsvarende intakte kapsidpartikler ved 30 nm (figur 3F), med 0 % av samlet intensitet og 0 % av liten partikkelintensitet. For rAAV2/9-preparatet ble det også påvist en topp ved 30 nm som representerte en kapsidintensitet på 78 % (tilleggsfigur S5B). Selv om den lille partikkelintensiteten var 0%, ble det for denne prøven målt en samlet intensitet på 22% (avbildet i grått), med hovedbidraget (19,9%) fra store aggregater med en gjennomsnittlig diameter på 620 nm (tilleggsfigur S5B). Gjennom kombinasjonen av UV-Vis-spektroskopi med SLS- og DLS-informasjon avslørte Stunner det totale kapsidtiteret, full kapsidtiter, fritt og aggregert protein, samt fritt og aggregert ssDNA for de to virale preparatene, vist i figur 3G og tilleggsfigur S5C (spesifikke verdier angitt i hver figurforklaring). Parallelt, for å evaluere den biologiske aktiviteten til de utviklede mosaikk-AAV-vektorene, ble HEK293T celler infisert med 50 μL av hver FPLC-oppnådd fraksjon (F2-F16) av enten rAAV1/2- eller rAAV2/9-preparatet. Siden rAAV1/2-vektoren koder for et enkeltstrenget grønt fluorescerende protein (GFP), under kontroll av en CMV-promotor (pAAV-CMV-ssGFP), og rAAV2/9-vektoren koder for en selvkomplementær GFP, under kontroll av CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP53), ble direkte GFP-fluorescens undersøkt i disse cellene 48 timer etter infeksjon (tilleggsfigur S6 og tilleggsfigur S7). I samsvar med tidligere observasjoner for RT-qPCR, Coomassie blå og western blot, ble det høyeste smittsomhetsnivået oppnådd for virale fraksjoner F7 og F8, gradvis avtagende i fraksjonene F9 til F16. For å bekrefte om den biologiske aktiviteten til rAAVs ble opprettholdt etter ultrafiltrerings- og konsentrasjonstrinn, ble Neuro2A-celler, belagt i både 24-brønnsplater og et 8-brønns kammerlysbilde, infisert med den konsentrerte rAAV1/2-vektoren, som koder for scGFP under kontroll av CMV-promotor (pAAV-CMV-scGFP53). Brightfield- og fluorescensbilder ble tatt 48 timer etter infeksjon (figur 4A,B for bilder med høyere oppløsning). Med sikte på å utforske den smittsomme kapasiteten til de produserte rAAVene i en mer relevant og reflekterende cellemodell, ble halvtette primære nevronkulturer fra cortex sådd på en 12-brønnsplate og infisert med den tidligere brukte rAAV1/2 – CMV-scGFP. Førtiåtte timer etter infeksjon ble celler fiksert og merket med DAPI og WGA konjugert med Alexa Fluor 633, et mye brukt lektin for å merke faste celler. Bildene vist i figur 4C,D ble tatt med en Zeiss Axio Observer Z1 og på en Zeiss konfokal LSM 710. Som avbildet i disse figurene ved direkte GFP-fluorescens, bevarer konsentrerte mosaikkvirus sine genoverføringsegenskaper for nevronceller. Etter å ha karakterisert mosaikk-rAAV-er med hensyn til renhet, fysiske egenskaper og funksjonalitet in vitro, vurderte vi deretter muligheten for å bruke de rensede rAAV1/2-mosaikkvektorene til å transdusere lillehjernen til C57BL/6-mus. For det ble en stereotaktisk injeksjon utført i 9 uker gamle mus og GFP-uttrykket ble evaluert 12 uker senere. Som forventet viste dyr injisert med PBS ingen fluorescens ved GFP-immunmerking. Epifluorescensbilder fra mus injisert med rAAV1/2-vektorer som koder for GFP under kontroll av synapsin 1-promotor (rAAV1/2 – Syn-ssGFP) viste at rAAV1/2-vektorer vellykket transduserte flere regioner i lillehjernen, nemlig de dype cerebellarkjernene (DCN) -regionen, samt de forskjellige lobulene i cerebellum (figur 5). Disse resultatene viser langvarig ekspresjon av transgenet i pattedyrhjernen (12 uker). Figur 1: Skjematisk fremstilling av rAAVs produksjons- og renseprotokoll. rAAV produseres ved forbigående transfeksjon av HEK293T celler ved bruk av polyetylenimin (PEI). Deretter høstes og lyseres celler, og rAAV-er renses fra cellehomogenatet via affinitetskromatografi. De innsamlede fraksjonene som inneholder rAAVer konsentreres deretter, og de endelige virale bestandene karakteriseres i form av titer, renhet, morfologiske egenskaper og biologisk aktivitet. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; PEI = polyetylenimin; RT-qPCR = sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: FPLC renseprotokoll og representativ elueringsprofil for rAAV1/2. (A) Skjematisk fremstilling av en komplett kromatogramprofil, som viser de forskjellige stadiene i rAAV-renseprosessen. Etter et kolonnelikevektstrinn brukes prøven. Kolonnen vaskes deretter, og elueringen utføres med økende konsentrasjoner av NaCl. Det ubundne materialet (gjennomstrømning) og 1 ml fraksjoner av de eluerte virusene samles for analyse. Absorbansen ved 280 nm uttrykkes i mAU og x-aksen indikerer volumet i ml. (B) Forstørret partielt kromatogram som viser en rAAV1/2 eluitopp (i svart), med tilsvarende brøknummer (F2-F16) og avfall (angitt med rødt). Den publiserte konsentrasjonen av buffer B og konduktivitet (uttrykt i mS/cm) er også vist i henholdsvis grønt og lilla. (C) RT-qPCR for hver fraksjon samlet under affinitetsrensing (F2-F16) og gjennomstrømning. Titeren i vg/μL er representert på en logaritmisk skala. (D) SDS-PAGE analyse av de innsamlede virale fraksjonene. Like volumer (40 μL) av hver fraksjon fra elueringstrinnet (F2-F16), og respektive gjennomstrømning ble lastet og løst på en 10% SDS-polyakrylamidgel. Proteinbånd ble visualisert ved Coomassie blå farging. Bånd tilsvarende AAV-kapsidproteinene VP1, VP2 og VP3 er indisert. Standard proteinstørrelsesstige er betegnet som (L) og de tilsvarende molekylvektene er også indikert. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; RT-qPCR = sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Karakterisering av de konsentrerte rAAV1/2-vektorene. (A) Forsterkningskurver for en konsentrert rAAV1/2-prøve (i blå), serielt fortynnede standarder fra 2 × 107 vg/μL til 2 × 102 vg/μL (i svart) og en no-template-kontroll (i grønt), oppnådd under RT-qPCR. (B) Standardkurve (lineær regresjon) for bestemmelse av titer av en rAAV-prøve i vg/μL. (C) SDS-PAGE analyse av konsentrerte viruspartikler. Totalt 2,3 × 1010 vg av den konsentrerte bestanden ble samlet på gelen. (D) Transmisjonselektronmikroskopibilde av rAAV1/2 partikler med ~25-30 nm i diameter. Tomme partikler med et elektrontett senter (dokumentert av svarte piler) kan skille seg fra fulle kapsider (dokumentert av hvite piler). Skala bar = 100 nm. (E) Absorbansspektrum til et rAAV1/2-preparat målt med Stunner (i svart). Bidraget fra proteiner (i blått), ssDNA (i grønt), andre UV-absorberende forbindelser eller urenheter (i lilla) og bakgrunnsturbiditet (i grått) er også vist. (F) DLS-intensitetsfordeling av rAAV1/2 med en enkelt topp ved 30 nm, målt ved Stunner. En kapsidspredningsintensitet på 100% ble bestemt ved å måle området under kurven fra 15 til 45 nm (skyggelagt grønt). (G) Bedøvelsesanalyse av et rAAV1/2 vektorpreparat som viser en total kapsidtiter på 1,19 × 1014 cp/ml (mørk blå) og en full kapsidtiter på 1,73 × 1013 vg/ml (mørkegrønn). Et fritt og aggregert protein på 7,16 × 1012 cp/ml ekvivalenter (lyseblå), samt et fritt og aggregert ssDNA på 1,04 × 1012 vg/ml ekvivalenter (lysegrønn), ble også målt. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; RT-qPCR = sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese; ssDNA = enkeltstrenget DNA; DLS = dynamisk lysspredning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: In vitro infektivitetsvurdering av konsentrert rAAV1/2-prøve. (A) Neuro2A-celler ble infisert med rAAV1/2 – CMV-scGFP eller inkubert med et ekvivalent volum PBS, som en negativ kontroll. Brightfield- og fluorescensbilder av celler avbildet 48 timer etter infeksjon. Bildene ble tatt i en Zeiss Axio Observer Z1 (10x objektiv). Skalastenger = 100 μm. (B) Detaljerte bilder av Neuro2A-celler 48 timer etter infeksjon med rAAV1/2 – CMV-scGFP. Bilder ble tatt i en Zeiss LSM 710 (40x objektiv). Skalastenger = 20 μm. (C) Semi-tette primære nevronkulturer infisert med rAAV1/2 – CMV-scGFP eller inkubert med et ekvivalent volum PBS, som tjener som en negativ kontroll. Cellene ble merket med en kjernefysisk flekk (DAPI i blått) og en membranflekk (WGA i hvitt). Bildene ble tatt i en Zeiss Axio Observer Z1 (40x objektiv). Skalastenger = 20 μm. (D) Detaljerte bilder av semi-tette primære nevronkulturer 48 timer etter infeksjon med rAAV1/2 – CMV-scGFP. Bilder ble tatt i en Zeiss LSM 710 (40x objektiv). Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; CMV = cytomegalovirus; scGFP = selvkomplementært grønt fluorescerende protein; PBS = fosfatbufret saltvann; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; WGA = hvetekimagglutinin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: In vivo transduksjonseffektivitet av rAAV1/2 etter intraparenkymal injeksjon. Representative immunfluorescensbilder som viser det utbredte GFP-uttrykket (i grønt) gjennom lillehjernen ved en sentral injeksjon av rAAV1/2 – Syn-ssGFP i lillehjernen. Kjerner ble farget med DAPI (i blått). Skalastenger = 500 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; Syn = Synapsin 1; ssGFP = enkeltstrenget grønt fluorescerende protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; PBS = fosfatbufret saltvann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tilleggsfigur S1: Agarosegelanalyse av et rAAV-vektorplasmid fordøyd med SmaI. Seks kloner (C1-C6) av en pITR ble fordøyd med SmaI-restriksjonsenzym (bane 2, 4, 6, 8, 10 og 12), som kutter to ganger innenfor hver inverterte terminalrepetisjon. I dette tilfellet forventes en fullstendig fordøyelse av denne pITR å generere to bånd (3,796 bp og 3,013 bp). I vellykkede preparater (C1, C3, C4 og C5) er et bånd på 6809 bp, som følge av delvis fordøyelse, fortsatt synlig (~ 5% av totalen). I preparater med ITR-rekombinasjon reverseres proporsjonene (C2), eller fordøyelsen oppsto ikke (C6). De respektive ikke-fordøyde klonene presenteres også (banene 3, 5, 7, 9, 11, 13). Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; ITR = invertert terminal repetisjon. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S2: rAAV2/9 rensing ved heparinbasert affinitetskromatografi. (A) Elusjonsprofil for rAAV2/9 som viser en enkelt topp (i svart), etter en økning i konsentrasjonen av NaCl. De oppsamlede fraksjonene er indikert med tall (2-16) i rødt nederst i grafen, absorbansen ved 280 nm uttrykkes i mAU, konduktiviteten uttrykkes i mS / cm, og x-aksen indikerer volumet i ml. (B) rAAV-titere kvantifisert av RT-qPCR for hver samlede fraksjon (F2-F16) og gjennomstrømning. Verdier er representert på en logaritmisk skala. (C) Renhetsanalyse av SDS-PAGE og Coomassie blå farging. Like volumer (40 μL) av hver fraksjon (F2-F16) og den respektive gjennomstrømningen ble lastet og løst på en 10% SDS-SIDE. Konsentrert bestand ble kvantifisert av RT-qPCR og 2,3 × 1010 vg ble fortynnet i 40 μL PBS og samlet på gelen. Proteinbånd ble visualisert ved Coomassie blå farging. AAV-kapsidproteinene (VP1, VP2 og VP3) er indisert. Standard proteinstørrelsesstige er betegnet med (L) og de tilsvarende molekylvektene er også indikert. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; RT-qPCR = sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S3: Western blot analyse av rAAV1/2 vektorer renset av FPLC. (A) De oppsamlede fraksjonene og konsentrerte rAAV1/2-vektorene ble løst på en SDS-PAGE gel og undersøkt med monoklonalt anti-AAV-antistoff (B1) fra mus som gjenkjenner VP1-, VP2- og VP3-kapsidproteiner. (B) De oppsamlede fraksjonene og konsentrerte rAAV1/2-vektorene ble løst på en SDS-PAGE-gel og undersøkt med monoklonalt anti-AAV-antistoff (A69) fra mus som gjenkjenner VP1- og VP2-kapsidproteiner. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; FPLC = rask protein væskekromatografi; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese; L = standard proteinstørrelse stige. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S4: Western blot analyse av rAAV2/9 vektorer renset av FPLC. (A) De oppsamlede fraksjonene og konsentrerte rAAV2/9-vektorene ble løst på en SDS-PAGE-gel og undersøkt med monoklonalt anti-AAV-antistoff (B1) fra mus som gjenkjenner VP1-, VP2- og VP3-kapsidproteiner. (B) De oppsamlede fraksjonene og konsentrerte rAAV2/9-vektorene ble løst på en SDS-PAGE-gel og undersøkt med monoklonalt anti-AAV-antistoff (A69) fra mus som gjenkjenner VP1- og VP2-kapsidproteiner. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; FPLC = rask protein væskekromatografi; SDS-PAGE = natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese; L = standard proteinstørrelse stige. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S5: rAAV2/9 vektorkvantifisering og karakterisering via Stunner. (A) Absorbansspektrum (svart) av en rAAV2/9-vektor målt med Stunner. Bidraget fra proteiner (blå), ssDNA (grønn), andre UV-absorberende forbindelser eller urenheter (lilla) og bakgrunnsturbiditet (grå) er også avbildet. (B) DLS-intensitetsfordeling av rAAV2/9 med en stor topp ved 30 nm som tilsvarer en kapsidspredningsintensitet på 78%, som bestemt ved å måle arealet under kurven fra 15 til 45 nm (skyggelagt grønt). En total aggregert intensitet på 22 % (skyggelagt i grått) ble også målt med et hovedbidrag fra store aggregater (19,9 %) med en gjennomsnittlig diameter på 620 nm. (C) Bedøvelsesanalyse av et rAAV2/9 vektorpreparat som viser en total kapsidtiter på 2,18 × 1014 cp/ml (mørk blå) og en full kapsidtiter på 2,35 × 1013 vg/ml (mørkegrønn). Et fritt og aggregert protein på 2,92 × 1013 cp/ml ekvivalenter (lyseblå), samt et fritt og aggregert ssDNA på 3,14 × 1012 vg/ml ekvivalenter (lysegrønn), ble også målt i dette preparatet. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; ssDNA = enkeltstrenget DNA; DLS = dynamisk lysspredning. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S6: In vitro transduksjonseffektivitet og levedyktighet av de rensede fraksjonene av rAAV1/2. HEK293T celler som uttrykker GFP (direkte fluorescens) 48 timer etter transduksjonen med 50 μL FPLC-fraksjoner av en rAAV1/2 vektorsom koder for ssGFP (rAAV1/2 – CMV-ssGFP). Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; FPLC = rask protein væskekromatografi; ssGFP = enkeltstrenget grønt fluorescerende protein. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S7: In vitro transduksjonseffektivitet og levedyktighet for de rensede fraksjonene av rAAV2/9. HEK293T celler ble infisert med 50 μL av hver FPLC-fraksjon (F2-F16) eller gjennomstrømning av en rAAV2/9-vektorsom koder for scGFP under kontroll av CMV-promotoren. GFP-uttrykkende celler ble visualisert 48 timer etter infeksjon. Skalastenger = 100 μm. Forkortelser: rAAV = rekombinant adenoassosiert virus; FPLC = rask protein væskekromatografi; scGFP = selvkomplementært grønt fluorescerende protein; CMV = cytomegalovirus. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Det raskt voksende AAV-vektorverktøyet har blitt et av de mest lovende genleveringssystemene for et bredt spekter av celletyper gjennom ulike administrasjonsveier. I dette arbeidet hadde vi som mål å utvikle en forbedret protokoll for produksjon, rensing og karakterisering av mosaikk-rAAV-vektorer som kunne bevise sin verdi i prekliniske studier. For dette formålet er genereringen av rAAV1/2 og rAAV2/9 mosaikkvektorer beskrevet her, men prosedyren kan også brukes til å rense standard rAAV2-vektorer (data ikke vist).

Mosaic rAAVs ble produsert etter en optimalisert transfeksjonsmetode ved bruk av PEI som transfeksjonsreagens. En forbigående transfeksjonsmetode ble valgt på grunn av større fleksibilitet og hastighet, betydelige fordeler i prekliniske studier på tidlig stadium. Når et bestemt transgen og serotype er validert, kan produksjonssystemet finjusteres for å oppnå bedre skalerbarhet og kostnadseffektivitet ved å etablere en stabil transfeksjonert cellelinje som uttrykker en delmengde av de spesifikke Rep / Cap-gener , med ytterligere gener levert av en infeksjonsprosess²⁴. Sammenlignet med kalsiumfosfattransfeksjon presenterer PEI flere fordeler. Det er et stabilt og kostnadseffektivt transfeksjonsreagens som fungerer effektivt innenfor et bredere pH-område. I tillegg eliminerer det kravet om å endre cellemediet etter transfeksjon, noe som resulterer i en betydelig reduksjon i både kostnad og arbeidsbelastning⁶⁹.

I et forsøk på å omgå noen av begrensningene som ble pålagt av CsCl eller jodixanolgradienter, ble de produserte rAAVene høstet og renset ved affinitetskromatografi. Denne strategien tilbyr en forenklet og skalerbar tilnærming som kan utføres uten behov for ultrasentrifugering og gradienter, noe som gir rene og høye virale titer. Faktisk kan kromatografiteknikker ved hjelp av et FPLC-system automatiseres og skaleres opp ved å pakke mer harpiksvolum i en kolonne med høyere sengehøyde. Protokollen beskrevet her kan enkelt tilpasses for å inkludere 5 ml HiTrap Heparin HP-kolonner (data ikke vist). I tillegg kan heparinkolonner gjenbrukes flere ganger, og dermed bidra til kostnadseffektiviteten til denne metoden.

De rensede rAAV-ene ble deretter karakterisert i form av titer, renhet, morfologiske egenskaper og biologisk aktivitet. Interessant, i Coomassie blå farging ble et bånd med ca. 17 kDa detektert i fraksjoner F8-F16 i tillegg til de tre typiske virale kapsidproteinene. Dette båndet er imidlertid ikke lenger til stede etter konsentrasjonstrinnet til rAAV. Videre kan noen svake bånd med molekylvekter lavere enn VP3 (<62 kDa) også detekteres ved B1- og A69-merking, noe som tyder på at disse kan være fragmenter av VP1-, VP2- og VP3-kapsidproteinene⁷⁰. En annen mulighet er at dette faktisk er andre samrensende proteiner som ferritin eller andre cellulære proteiner med polypeptider som deler lignende proteinfingeravtrykk med AAV-kapsidproteinene og kan være involvert i AAV-biologien, som tidligere antydet 26,71,72.

TEM og stunner analyse avslørte også tilstedeværelsen av tomme partikler på variable nivåer på tvers av forskjellige produksjoner. Tilsvarende rapporterte andre studier tidligere generering av variable og høye nivåer (>65%) av tomme kapsider for rAAVs fremstilt ved transfeksjon eller infeksjonsmetoder^24,73. Mekanismen bak rAAV-generering starter med den raske dannelsen av tomme kapsider fra nylig syntetiserte VP-proteiner, etterfulgt av et langsomt hastighetsbegrensende trinn av genomemballasje i de preformerte kapsidene mediert av Rep-proteiner ^74,75. Derfor genereres tomme kapsider i rAAV-produksjoner, selv om andelen tomme og fulle kapsider kan variere avhengig av størrelsen og sekvensen av transgenet av interesse og cellekulturforhold^58,73. Tomme kapsider gir noen bekymringer siden de, ved å mangle genomet av interesse, ikke er i stand til å gi en terapeutisk effekt og kan også potensielt øke en medfødt eller adaptiv immunrespons. Noen rapporter har imidlertid også vist at tomme AAV-kapsider ved å justere forholdet kan tjene som svært effektive lokkeduer for AAV-spesifikke nøytraliserende antistoffer og dermed øke transduksjonseffektiviteten 60,76,77. Hvis tilstedeværelsen av tomme kapsider er kritisk skadelig og gitt den litt mindre anioniske karakteren til tomme partikler sammenlignet med fulle vektorer, kan en potensiell løsning innebære å gjennomføre et andre poleringsrensingstrinn ved hjelp av anionbyttekromatografiteknikker⁶⁴.

Denne studien gir også overbevisende bevis på at de genererte mosaikk-rAAVene er i stand til effektivt å transdusere ikke bare in vitro nevronkulturer, men også CNS ved intrakraniell injeksjon av rAAV1/2. Samlet sett antyder disse resultatene at den beskrevne produksjons- og renseprotokollen gjør svært rene og biologisk aktive rAAV-er klare til bruk på 6 dager, og presenterer seg som en allsidig og kostnadseffektiv metode for generering av rAAVs i prekliniske studier.

Materials

10% povidone-iodine	Medline	MDS093943
12-well plates	Thermo Scientific	11889684
24-well plates	VWR	734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
96-well Stunner plate	Unchained Labs	701-2025	96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2	Takara	6233	For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial	Fisher Chemical	A/0360/PB17
ÄKTA pure 25	Cytiva	29018224	FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse	Invitrogen	31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC9100
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	E1014
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System	Bio-Rad Laboratories	1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody	Abcam	ab13970
Coomassie Blue G250	Fisher Chemical	C/P541/46
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Bioreagents	BP17225
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
ECF Substrate for Western Blotting	Cytiva	RPN5785
FastDigest SmaI	Thermo Scientific	FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin	FEI	Biotwin	Transmission electron microscope
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
Fluorescence mounting medium	Dako	S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid	TAAB Laboratories Equipment	F077/025
Gas evacuation apparatus	RWD	R546W
Glycerol	Fisher BioReagents	10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3	Hamilton	7803-07
Hamilton syringe (10 µL)	Hamilton	7653-01
HEK293T	American Type Culture Collection	CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL	Cytiva	17040701	Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva	17040601	Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Isoflurane	Braun	469860
Ketamine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL)	Fisher Scientific	11906965
Lunatic & Stunner Client software	Unchained Labs	N/A	Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol	Fisher Chemical	M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69)	American Research Products	03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1)	American Research Products	03-61058
Neuro2a	American Type Culture Collection	CCL-131
Normal goat serum	Gibco	16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	12738422
NZYColour Protein Marker II	NZYtech	MB09002
pAAV-CMV-scGFP	Addgene	32396	Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP	Addgene	105530	Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n	Addgene	112865	Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde	Acros Organics	10342243
PBS	Fisher BioReagents	BP2438
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x)	Gibco	24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000	Polysciences Europe	24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane	RWD	N/A
Sample Inlet Valve V9-IS	Cytiva	29027746
Sample pump P9-S	Cytiva	29027745
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	Fisher Scientific	10428420
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Bioreagents	BP166
Sterile PVDF syringe filter	Fisher Scientific	15191499
Stunner Platform	Unchained Labs	700-2002	Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL	Cytiva	18-1023-85
Superloop 50 mL	Cytiva	18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells	Stratagene, Agilent Technologies	HPA200152
Treated culture dishes	Corning	734-1711
Tris base	Fisher BioReagents	BP152
Tris hydrochloride	Fisher BioReagents	BP153
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633	Invitrogen	W21404
Xylazine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi	Ibidi	80826	8-well chamber slide