Isolamento di vettori virali adeno-associati attraverso un protocollo cromatografico di affinità con eparina a passaggio singolo e semiautomatico

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la generazione e la purificazione di vettori virali adeno-associati utilizzando un metodo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina. Presenta un approccio semplice, scalabile ed economico, eliminando la necessità di ultracentrifugazione. I vettori risultanti mostrano un’elevata purezza e attività biologica, dimostrando il loro valore negli studi preclinici.

Abstract

Il virus adeno-associato (AAV) è diventato un vettore sempre più prezioso per la consegna genica in vivo ed è attualmente in fase di sperimentazione clinica sull’uomo. Tuttavia, i metodi comunemente usati per purificare gli AAV utilizzano l’ultracentrifugazione a gradiente di densità di cloruro di cesio o iodixanolo. Nonostante i loro vantaggi, questi metodi richiedono molto tempo, hanno una scalabilità limitata e spesso producono vettori con bassa purezza. Per superare questi vincoli, i ricercatori stanno rivolgendo la loro attenzione alle tecniche cromatografiche. Qui presentiamo un protocollo cromatografico di affinità ottimizzato a base di eparina che funge da fase di cattura universale per la purificazione degli AAV.

Questo metodo si basa sull’affinità intrinseca del sierotipo 2 di AAV (AAV2) per i proteoglicani dell’eparan solfato. In particolare, il protocollo comporta la co-trasfezione di plasmidi che codificano per le proteine del capside AAV desiderate con quelle di AAV2, producendo vettori AAV a mosaico che combinano le proprietà di entrambi i sierotipi parentali. In breve, dopo la lisi delle cellule produttrici, una miscela contenente particelle AAV viene purificata direttamente seguendo un protocollo di cromatografia di affinità con eparina a fase singola ottimizzato utilizzando un sistema standard di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC). Le particelle di AAV purificate vengono successivamente concentrate e sottoposte a una caratterizzazione completa in termini di purezza e attività biologica. Questo protocollo offre un approccio semplificato e scalabile che può essere eseguito senza la necessità di ultracentrifugazione e gradienti, producendo titoli virali puliti e elevati.

Introduction

Il vettore del virus adeno-associato (AAV) si sta affermando come uno dei sistemi di somministrazione più promettenti negli attuali studi di terapia genica. Inizialmente identificato nel 1965¹, AAV è un piccolo virus senza involucro, con un capside proteico icosaedrico di circa 25 nm di diametro, che ospita un genoma di DNA a singolo filamento. Gli AAV appartengono alla famiglia Parvoviridae e al genere Dependoparvovirus a causa della loro dipendenza unica dalla co-infezione con un virus helper, come il virus dell’herpes simplex o, più frequentemente, l’adenovirus, per completare il loro ciclo litico ^2,3.

Il genoma di 4,7 kilobasi degli AAV è costituito da due telai di lettura aperti (ORF) affiancati da due ripetizioni terminali invertite (ITR) che formano caratteristiche estremità a forcina a forma di T⁴. Gli ITR sono gli unici elementi ad azione cis critici per l’impacchettamento, la replicazione e l’integrazione di AAV, essendo quindi le uniche sequenze AAV mantenute nei vettori AAV ricombinanti (rAAV). In questo sistema, i geni necessari per la produzione del vettore sono forniti separatamente, in trans, consentendo al gene di interesse di essere impacchettato all’interno del capside virale ^5,6.

Ogni gene virale codifica proteine diverse attraverso splicing alternativo e codoni di avvio. All’interno dell’ORF Rep, sono codificate quattro proteine non strutturali (Rep40, Rep52, Rep68 e Rep78), che svolgono ruoli cruciali nella replicazione, nell’integrazione sito-specifica e nell’incapsidazione del DNA virale ^7,8. L’ORF del Cap funge da stampo per l’espressione di tre proteine strutturali diverse tra loro al loro N-terminale, (VP1, VP2 e VP3), che si assemblano per formare un capside virale da 60 mer in un rapporto di 1:1:10 ^4,9. Inoltre, un ORF alternativo annidato nel gene Cap con un codone di inizio CUG non convenzionale codifica per una proteina attivante l’assemblaggio (AAP). È stato dimostrato che questa proteina nucleare interagisce con le proteine del capside VP1-3 di nuova sintesi e promuove l’assemblaggio del capside^10,11.

Le differenze nella sequenza aminoacidica del capside spiegano gli 11 sierotipi di AAV presenti in natura e oltre 100 varianti isolate da esseri umani e tessuti di primati non umani ^7,12,13. Le variazioni nella conformazione delle regioni strutturalmente variabili governano le distinte proprietà antigeniche e le specificità di legame con i recettori dei capsidi di diversi ceppi. Ciò si traduce in distinti tropismi tissutali ed efficienze di trasduzione tra diversi organi di mammifero¹⁴.

I primi metodi di produzione di rAAV si basavano sull’infezione da adenovirus per scopi di aiuto 15,16,17,18,19. Nonostante sia efficiente e di solito facile da produrre su larga scala, da questa infezione derivano diversi problemi. Anche dopo la purificazione e una fase di denaturazione del calore per l’inattivazione, le particelle adenovirali possono essere ancora presenti nei preparati AAV, costituendo un problema di sicurezza indesiderato²⁰. Inoltre, la presenza di proteine adenovirali denaturate è inaccettabile per l’uso clinico. Altre strategie di produzione sfruttano i ceppi di virus dell’herpes simplex ricombinanti ingegnerizzati per portare il Rep/Cap e il transgene nelle cellule bersaglio²¹ o del sistema di cellule baculovirus-insetto²². Sebbene questi sistemi offrano vantaggi in termini di scalabilità e compatibilità GMP, devono ancora affrontare problemi simili.

Il metodo della tripla trasfezione per la produzione di rAAV è stato comunemente adottato per superare facilmente questi problemi. In breve, l’assemblaggio di rAAV si basa sulla trasfezione transitoria di cellule con tre plasmidi codificanti per: 1) la cassetta di espressione transgenica impacchettata tra gli ITR dal genoma AAV2 wild-type (pITR); 2) le sequenze Rep/Cap necessarie per la replicazione e l’assemblaggio del virione (pAAV-RC); e 3) le proteine adenovirali minime (E1A, E1B, E4 ed E2A) insieme agli RNA associati al virus adenovirale necessari per l’effetto helper (pHelper)^6,20,23. Sebbene i metodi di trasfezione plasmidica forniscano semplicità e flessibilità per la produzione di rAAV negli studi preclinici, queste procedure presentano limitazioni in termini di scalabilità e riproducibilità se applicate alla produzione su larga scala. Come approccio alternativo, la produzione di rAAV può essere ottenuta attraverso l’uso di linee cellulari produttrici di AAV (sia di crescita aderente che in sospensione), esprimendo stabilmente i geni AAV Rep/Cap o Rep/Cap in combinazione con costrutti vettoriali. In questi sistemi, i geni helper adenovirali vengono introdotti attraverso la trasfezione plasmidica. Anche se questa strategia migliora la scalabilità del processo di coltura cellulare, è tecnicamente complessa e richiede tempo 21,24,25.

In entrambi i casi, le cellule produttrici vengono quindi lisate e sottoposte a una o più fasi di purificazione. Attualmente, i metodi principali per purificare i rAAV includono l’uso di cloruro di cesio (CsCl) o la centrifugazione in gradiente di densità ad altissima velocità di iodixanolo seguita, o meno, da tecniche cromatografiche²⁶. Lo schema di purificazione originale per la precipitazione virale utilizzava solfato di ammonio, seguito da due o tre cicli di ultracentrifugazione attraverso un gradiente di CsCl. I principali vantaggi di questo processo includono la possibilità di purificare tutti i sierotipi e la capacità di separare fisicamente le particelle piene dai capsidi vuoti in base alle loro diverse densità. Questo metodo, tuttavia, è elaborato, richiede tempo e ha una scalabilità limitata, spesso con conseguente scarsa resa e bassa qualità del campione 27,28,29,30. Inoltre, la dialisi contro un tampone fisiologico è spesso necessaria prima degli studi in vivo a causa degli effetti tossici che CsCl può esercitare sui mammiferi.

Lo iodixanolo è stato anche utilizzato come mezzo alternativo a gradiente iso-osmotico per purificare i vettori rAAV, con vantaggi rispetto al CsCl sia dal punto di vista della sicurezza che della potenza del vettore. Tuttavia, come il CsCl, il metodo dello iodixanolo presenta alcuni inconvenienti legati alla capacità di carico del lisato di coltura cellulare (e quindi alla scalabilità della purificazione di rAAV) e rimane un metodo lungo e costoso^30,31.

Per superare questi vincoli, i ricercatori hanno rivolto la loro attenzione alle tecniche cromatografiche. A questo proposito, sono stati sviluppati diversi approcci di purificazione che incorporano metodi di cromatografia di affinità, idrofobica o a scambio ionico. Questi metodi si basano sulle proprietà biochimiche di un particolare sierotipo, compresi i loro recettori naturali, o sulle caratteristiche di carica della particella virale³². Ad esempio, la scoperta che AAV2, AAV3, AAV6 e AAV13 si legano preferibilmente ai proteoglicani dell’eparan solfato (HSPG), ha aperto la possibilità di utilizzare l’eparina strettamente correlata nella purificazione cromatografica di affinità. Tuttavia, i siti di legame all’HSPG possono differire tra i sierotipi, mediando l’attaccamento dell’AAV e l’infezione delle cellule bersaglio in modi diversi 2,33,34,35,36. D’altra parte, AAV1, AAV5 e AAV6 si legano all’acido sialico N-legato (SA), mentre AAV4 utilizza SA 2,14,34 legato all’O. Seguendo lo stesso razionale, è stato sviluppato anche un protocollo cromatografico di affinità a singolo step per la purificazione di rAAV5 basato sull’uso della mucina, una proteina di mammifero altamente arricchita in SA³⁷. Come le tecniche a base di eparina, anche questa purificazione dipende dal sierotipo specifico generato. Oltre all’eparina e alla mucina, altri ligandi sono stati esplorati per la cromatografia di affinità, come l’anticorpo monoclonale A20 e gli anticorpi a dominio singolo camelide (AVB Sepharose e POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Altre strategie innovative per migliorare i metodi di purificazione precedentemente esistenti prevedono l’introduzione di piccole modifiche nel capside rAAV per presentare specifici epitopi leganti. Ad esempio, i rAAV marcati con esa-istidina o biotinilati possono essere purificati utilizzando ligandi che hanno come bersaglio quegli epitopi (rispettivamente acido nitrilotriacetico di nichel e resine avidina)42,43,44.

Nel tentativo di ampliare le caratteristiche desiderate dei rAAV, i ricercatori hanno travestito i virioni mescolando i loro capsidi. Ciò si ottiene fornendo il gene del capside da due distinti sierotipi AAV in rapporti equimolari o diversi durante la produzione, dando origine a una struttura del capside composta da una miscela di subunità del capside di diversi sierotipi 34,45,46,47,48,49,50. Studi precedenti forniscono prove fisiche che co-esprimono proteine del capside da AAV2 con AAV1 (rapporto 1:1) e AAV2 con AAV9 (rapporto 1:1) si traduce nella generazione di vettori a mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9, rispettivamente 45,46,48. Uno dei principali vantaggi della generazione di rAAV a mosaico è la capacità di integrare tratti vantaggiosi da diversi sierotipi di AAV, con conseguenti miglioramenti sinergici nell’espressione e nel tropismo dei transgeni, pur mantenendo altre proprietà utili durante la produzione di rAAV. È interessante notare che alcune varianti del mosaico mostrano persino nuove proprietà diverse da entrambi i virus parentali 46,47,49. Sfruttando la capacità di legare l’eparina di AAV2, i vettori rAAV a mosaico potrebbero potenzialmente essere generati e purificati mescolando AAV2 con altri capsidi AAV naturali o nuovi generati dall’evoluzione diretta e/o dal disegno razionale. Tuttavia, studi precedenti hanno evidenziato l’importanza della compatibilità delle subunità del capside quando si tenta di assemblare vettori di mosaico. Ad esempio, Rabinowitz e colleghi hanno dimostrato che, sebbene la transcapsidazione di AAV1, AAV2 e AAV3 abbia portato a un efficiente co-assemblaggio di capsidi a mosaico, il travestimento di questi sierotipi con AAV4 ha ostacolato la generazione di virioni stabili 34,45,47. Inoltre, AAV1, AAV2 e AAV3 hanno mostrato una bassa compatibilità con AAV5, dati i titoli virali ridotti ottenuti mescolando questi capsidi a rapporti diversi. È interessante notare che il mosaico rAAV2/5 ha mostrato una diminuzione delle proprietà leganti l’eparina, pur mantenendo la capacità di legare la mucina come l’AAV5 parentale. Tuttavia, rAAV3/5 in un rapporto 3:1 ha preservato il doppio legame con eparina e mucina. Nel complesso, la generazione di nuovi rAAV a mosaico con trasduzione migliorata, tropismo specifico o bassa immunogenicità potrebbe trarre grande beneficio dalla nostra comprensione dell’assemblaggio del capside e delle interazioni recettoriali, con combinazioni specifiche che richiedono ancora indagini approfondite e ottimizzazione.

Nel presente lavoro, descriviamo un protocollo passo-passo per la produzione e la purificazione di rAAV utilizzando un metodo cromatografico di affinità con eparina ottimizzato. Gli rAAV sono prodotti per trasfezione transitoria e vengono purificati utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce (FPLC). Dopo la concentrazione di frazioni purificate selezionate, gli stock virali risultanti vengono caratterizzati in termini di titolo, purezza, proprietà fisiche intrinseche e attività biologica in vitro e in vivo. Come prova di concetto, dimostriamo i miglioramenti e l’applicabilità di questo protocollo per la generazione di vettori a mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9. La scelta di ciascun sierotipo si è basata sui loro tropismi sorprendentemente diversi, conferendo potenzialmente le loro caratteristiche uniche anche alle versioni a mosaico. AAV sierotipo 1, con un tropismo complessivamente moderato per il sistema nervoso centrale (SNC), ha la capacità di trasdurre neuroni e glia (in misura minore) e subisce trasporto assonale in direzione anterograda e retrograda in vivo ^2,7,8. Inoltre, il sierotipo 9 di AAV è stato scelto per la sua naturale capacità di attraversare la barriera emato-encefalica e colpire il SNC sia nei topi neonatali che in quelli adulti^51,52. Infine, è stato selezionato il sierotipo 2 di AAV data la sua capacità di legarsi all’eparina, consentendo la cromatografia di affinità³³. Le particelle purificate di rAAV1/2 e rAAV2/9 combinano le proprietà di entrambi i sierotipi AAV parentali e, pertanto, costituiscono vettori adatti per la trasduzione del SNC 45,46,48,49.

Protocol

NOTA: Vedere la Figura 1 per un’illustrazione che riassume il protocollo. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo. Tutti i lavori che coinvolgono cellule e virus devono essere eseguiti in apposite cappe di biosicurezza e incubatori, separati da quelli regolarmente utilizzati per la manutenzione delle linee cellulari. Le apparecchiature e i reagenti che entrano in contatto con le cellule in coltura e i virus devono essere sterili. È essenziale che lo smaltimento dei reagenti pericolosi e dei materiali contaminati da virus sia eseguito in conformità con le schede di sicurezza dei materiali e in conformità con le leggi e le linee guida nazionali fornite dall’ufficio per la salute e la sicurezza ambientale di ciascuna istituzione. A partire da aprile 2019, le linee guida NIH per la ricerca che coinvolge molecole di acido nucleico ricombinanti o sintetiche classificano come agenti del gruppo di rischio 1 (non associati alla malattia negli esseri umani adulti sani) tutti i sierotipi di AAV, nonché i costrutti AAV ricombinanti o sintetici. Questa classificazione si applica quando il transgene non codifica per un prodotto genico potenzialmente tumorigenico o una tossina e i costrutti sono prodotti senza un virus helper. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità alla direttiva comunitaria dell’Unione Europea (2010/63/UE) per la cura e l’uso degli animali da laboratorio, recepita nella legge portoghese nel 2013 (D.Lgs. 113/2013). Inoltre, le procedure per animali sono state approvate dall’Organizzazione responsabile per il benessere degli animali della Facoltà di Medicina e dal Centro di Neuroscienze e Biologia Cellulare dell’Università di Coimbra con licenza per animali. I ricercatori hanno ricevuto una formazione adeguata (corso certificato FELASA) e una certificazione dalle autorità portoghesi (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbona, Portogallo) per eseguire gli esperimenti. 1. Costrutti plasmidici Seguire le istruzioni del produttore di un kit maxiprep privo di endotossine per isolare e purificare quantità sostanziali di DNA dei seguenti plasmidi: i) pITR: il vettore di trasferimento di interesse; ii) plasmide pAAV-RC: pRV1, contenente le sequenze AAV2 Rep e Cap 36; iii) plasmide pAAV-RC: pH21, contenente le sequenze AAV1 Rep e Cap 36; iv) plasmide pAAV-RC: pAAV2/9n, contenente le sequenze AAV2 Rep e AAV9 Cap ; v) pHelper: pFdelta6, plasmide36 adenovirus-helper. Esaminare l’integrità dei plasmidi generati eseguendo le restrizioni enzimatiche raccomandate36. Monitorare l’integrità dei plasmidi pITR mediante digestione con SmaI, un’endonucleasi di restrizione, che taglia due volte all’interno di una porzione instabile degli ITR53,54.NOTA: Poiché gli ITR sono altamente instabili e suscettibili di delezioni, si raccomanda l’uso di cellule supercompetenti SURE 2 per ridurre al minimo la ricombinazione in questi siti. 2. Coltura cellulare Coltura del rene embrionale umano 293, che esprime stabilmente la linea cellulare SV40 dell’antigene T grande (HEK293T) nell’alto glucosio Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l’1% di penicillina-streptomicina, a 37 °C, in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2, come punto di partenza per le fasi successive. Subcoltura delle cellule utilizzando 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sterile, pH 7,4, per lavare le cellule prima di aggiungere acido tripsina-etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (EDTA).NOTA: Evitare di utilizzare cellule che hanno subito un numero eccessivo di passaggi (massimo 20). Testare regolarmente le colture cellulari per la contaminazione da micoplasma. 3. Produzione di rAAV per trasfezione transitoria Giorno 1: Placcatura cellularePer ogni produzione virale, le cellule HEK293T vengono distribuite in 10 piastre di coltura trattate (15 cm di diametro) il giorno prima della trasfezione, a una densità di 10,5 × 106 cellule per piastra in 22 mL di terreno di coltura integrato e incubano per 24 ore fino a quando le cellule sono confluenti al 70%-80% e pronte per la trasfezione. Giorno 2: Trasfezione cellulare mediante polietilenimmina (PEI)Per ogni produzione virale (equivalente a 10,5 piatti), preparare la seguente miscela di trasfezione in una provetta da microcentrifuga: 54,6 μg di pITR; 45,675 μg di pRV1; 45,675 μg di pH21 o pAAV2/9n; 109,2 μg di pFdelta6. Mescolare picchiettando. Aggiungere la miscela a 4,557 mL di DMEM non integrato in una provetta da centrifuga da 50 mL. Mescolare picchiettando. Aggiungere 1,365 mL di soluzione sterile di PEI a 1 mg/mL (pH 7,4), goccia a goccia. Mescolare picchiettando. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione di complessi DNA-PEI. Aggiungere questa miscela a 231 ml di DMEM integrato preriscaldato. Sostituire l’intero terreno di coltura di ciascuna piastra con 22 mL di questa miscela di trasfezione. Incubare le cellule per 48 ore.NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito con cura per evitare il distacco delle cellule. Giorno 4: Raccolta delle celluleQuando il pITR codifica un reporter fluorescente, visualizzare le cellule trasfettate al microscopio a fluorescenza. Raccogliere il terreno da ogni piatto in provette da centrifuga da 50 ml e centrifugarle a 800 × g per 10 minuti. Scartare il surnatante.NOTA: Questo passaggio è facoltativo e mira a recuperare le cellule trasfettate che potrebbero essersi staccate a causa di una confluenza molto elevata. Aggiungere 10 ml di PBS preriscaldato a ciascuna piastra. Rimuovere delicatamente le cellule con un raschietto cellulare e raccogliere la sospensione nelle provette da centrifuga da 50 mL del passaggio 3.3.2. Lavare 5 piatti alla volta con altri 10 mL di PBS e trasferire la sospensione nelle provette da centrifuga da 50 mL del passaggio 3.3.3. Pellettare le cellule a 800 × g per 10 minuti e scartare il surnatante. Congelare i pellet cellulari a -80 °C.NOTA: I pellet cellulari possono essere conservati per diversi mesi (punto di pausa). 4. Estrazione rAAV e purificazione FPLC Giorno 5: preparazione del lisato cellulareScongelare i pellet cellulari a temperatura ambiente. Risospendere le cellule raccolte dalle 10 piastre in 100 mL di un tampone sterile contenente 150 mM di cloruro di sodio (NaCl) e 20 mM di Tris, pH 8,0, in acqua ultrapura (tipo I). Miscelare la sospensione pipettando su e giù, per garantire una sospensione omogenea. Aggiungere 12,5 ml di una soluzione sterile appena preparata di sodio desossicolato al 10% in acqua ultrapura per indurre la lisi cellulare. Mescolare pipettando su e giù.NOTA: Smaltire il desossicolato di sodio, nonché i materiali a contatto con esso, in conformità con la scheda di sicurezza dei materiali e le linee guida fornite dall’ufficio per la salute e la sicurezza ambientale dell’istituto. Si consiglia inoltre di indossare una maschera facciale durante la manipolazione di questa polvere. Dopo la miscelazione, la soluzione diventa altamente viscosa. Aggiungere 27 μl di nucleasi benzonasi alla miscela precedente. Miscelare accuratamente pipettando su e giù fino a quando il campione non è più viscoso. Incubare a 37 °C per 1 ora, eseguendo un vortice ogni 10 min.NOTA: Questa endonucleasi è in grado di degradare efficacemente tutte le forme di DNA e RNA senza mostrare alcuna attività proteolitica. Rimuovere i detriti cellulari centrifugando la miscela a 3.000 × g per 60 minuti a 25 °C. Filtrare il surnatante con un filtro per siringa sterile in polivinilidene difluoruro (PVDF) da 0,45 μm e trasferirlo in un nuovo contenitore sterile.NOTA: Questo importante passaggio garantisce che la maggior parte dei detriti cellulari venga rimossa, prevenendo così l’intasamento delle colonne cromatografiche. Conservare una piccola aliquota di questa miscela per l’analisi (passaggio facoltativo). Giorno 5 (continua): Purificazione della colonna di eparina dei rAAVNOTA: L’applicazione del campione può essere eseguita utilizzando una pompa del campione o un superloop da 50 mL o 150 mL come parte del sistema. Poiché a temperature più basse viene disciolta più aria, è importante lasciare un tempo sufficiente affinché i tamponi e le soluzioni (solitamente conservati a 4 °C) si acclimatino a temperatura ambiente prima del loro utilizzo nel sistema FPLC.Opzionale: se il sistema è stato immagazzinato per lunghi periodi, riempire il sistema e tutti gli ingressi con una soluzione di conservazione appena preparata (etanolo al 20%) utilizzando istruzioni manuali o un metodo predefinito di pulizia del sistema in loco (CIP del sistema). Lavare completamente il percorso del flusso del liquido con acqua ultrapura sterile utilizzando istruzioni manuali o un metodo CIP di sistema predefinito. Collegare una colonna di eparina preconfezionata da 1 mL, impostare l’allarme di pressione e lavare con cinque volumi di colonna (CV) di acqua ultrapura a una portata di 1 mL/min. Commutare le soluzioni nel vassoio tampone da acqua ultrapura a tampone A (soluzione sterile di 100 mM NaCl e 20 mM Tris, pH 8, in acqua ultrapura) per l’ingresso A (pompa del sistema A) e al tampone B (soluzione sterile di 500 mM di NaCl e 20 mM Tris, pH 8, in acqua ultrapura) per l’ingresso B (pompa del sistema B). Se il sistema dispone di una pompa di campionamento, posizionare l’ingresso del tampone della valvola di ingresso del campione nel tampone A. Lavare la pompa del sistema B con il tampone B e riempire il resto del percorso del flusso del liquido con il tampone A.NOTA: Se necessario, scollegare la colonna dal percorso di flusso e ricollegarla successivamente. Inserire un tubo di ingresso del campione dalla valvola di ingresso del campione, ad esempio S1, nel contenitore con la preparazione virale ottenuta al punto 4.1.4. (da preparazione di lisato cellulare). Adescare il percorso del flusso dall’ingresso del campione S1 alla valvola di iniezione con la soluzione del campione. In alternativa, riempire un superloop da 50 mL o 150 mL con il campione contenente rAAV utilizzando una siringa da 50 mL. Equilibrare la colonna con un volume totale di cinque CV utilizzando il 12,5% del tampone B a una velocità di 1 mL/min. Applicare il volume totale del campione nella colonna utilizzando la pompa del campione (selezionare iniettare tutto il campione utilizzando il sensore dell’aria) o il superloop a 0,5 mL/min e raccogliere il flusso utilizzando la porta di uscita in un nuovo contenitore sterile.NOTA: Quando la funzione di controllo del flusso per prevenire la sovrapressione è abilitata, il flusso diminuirà automaticamente in caso di intasamento della colonna. Se la portata scende significativamente al di sotto di 0,5 ml/min, interrompere l’applicazione del campione, eseguire un lavaggio con 2-5 CV del tampone A, quindi riprendere l’applicazione del campione. Lavare la colonna a 1 mL/min con 20 CV di tampone A, raccogliendo il flusso utilizzando la porta di uscita. Eluire il campione a 1 mL/min con il seguente schema: i) gradiente lineare con un target del 50% del tampone B per cinque CV; ii) passo con un obiettivo del 90% del buffer B durante cinque CV; iii) passo con un obiettivo del 100% del buffer B durante cinque CV. Raccogliere il campione eluito in frazioni da 1 mL utilizzando un collettore di frazioni e provette per microcentrifuga a bassa ritenzione (2 mL) e conservarle a -20 °C.NOTA: Le frazioni rAAV possono essere conservate per diverse settimane (punto di pausa). Riequilibrare la colonna a 1 mL/min con il 12,5% del tampone B per cinque CV. Passare gli ingressi dalle soluzioni tampone all’acqua ultrapura e lavare la colonna a 1 mL/min per cinque CV. Commutare gli ingressi da acqua ultrapura a etanolo al 20% e lavare la colonna a 1 mL/min per cinque CV. Scollegare la colonna e conservarla a 4 °C.NOTA: Le colonne possono essere riutilizzate più volte senza altre importanti procedure di pulizia e sanificazione se vengono utilizzati lo stesso sierotipo rAAV e lo stesso transgene. Lavare completamente il percorso del flusso del liquido con etanolo al 20% utilizzando istruzioni manuali o un metodo CIP di sistema predefinito. 5. Concentrazione di rAAV purificati Giorno 6: Fase di concentrazione 1Concentrare gli rAAV utilizzando un’unità filtrante centrifuga da 15 mL con un cutoff del peso molecolare di 100 kDa. Caricare le frazioni desiderate contenenti rAAV (frazioni FPLC da 7 a 16) nell’unità filtro centrifugo da 15 mL e centrifugarla a 2.000 × g per 2 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che il volume concentrato nell’unità filtro sia di circa 500 μl. Se il volume concentrato supera ampiamente i 500 μl, ripetere le fasi di centrifugazione a intervalli di 1 minuto fino a raggiungere il volume desiderato. Giorno 6 (continua): Scambio di bufferAggiungere 1 mL di PBS sterile all’unità filtro centrifugo contenente gli rAAV. Pipettare con cura su e giù per lavare il filtro. Centrifugare a 2.000 × g a intervalli di 1 minuto fino a raggiungere il volume finale di 500 μl. Giorno 6 (continua): Fase di concentrazione 2Trasferire i 500 μL di rAAV concentrati ottenuti nella fase precedente in un’unità filtrante centrifuga da 0,5 mL con un cutoff di peso molecolare di 100 kDa e centrifugare a 6.000 × g per 1 min. Se necessario, ripetere la fase di centrifugazione fino a raggiungere un volume finale inferiore a 100 μl. Giorno 6 (continua): RecuperoPer recuperare l’rAAV concentrato, posizionare il dispositivo filtrante capovolto in una nuova provetta di raccolta per microcentrifuga. Posizionare la provetta in una microcentrifuga con il tappo rivolto verso il centro ed eseguire una rotazione prolungata all’interno della camera di flusso per trasferire i rAAV concentrati dal dispositivo alla provetta della microcentrifuga. In alternativa, centrifugare a 1.000 × g per 2 min. Integrare con Pluronic F-68 sterile 0,001% (opzionale).NOTA: Pluronic F-68 è un tensioattivo non ionico approvato per uso umano dalla Food and Drug Administration che è in grado di mitigare le perdite di rAAV prevenendo le loro interazioni con le superfici dei materiali (plastica) utilizzati durante la preparazione della diluizione, il caricamento della siringa e l’attrezzatura di somministrazione55,56. Aliquotare gli rAAV in provette per microcentrifuga a bassa ritenzione e conservarli a -80 °C (punto di pausa). 6. Quantificazione di rAAV purificati Giorno 6 (continua): determinare il titolo dei preparati di rAAV, espressi in genomi virali/μL (vg/μL), mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore.Incubare la soluzione di particelle di rAAV con DNasi I a 37 °C per 20 minuti.NOTA: Questa procedura promuove la digestione del DNA genomico libero e del DNA plasmidico derivato dalle cellule ospiti, garantendo così che venga preservata solo la sequenza di acido nucleico all’interno delle particelle di rAAV intatte. Inattivare a caldo la DNasi I a 95 °C per 10 min. Aggiungere il tampone di lisi e incubare per 10 minuti a 70 °C per favorire la denaturazione termica delle proteine delle particelle rAAV. Diluire la soluzione del genoma rAAV ottenuta in tampone di diluizione prima di procedere alla RT-qPCR. Preparare una serie di standard diluiti in serie del controllo positivo (da 2 × 107 vg/μL a 2 × 102 vg/μL) forniti con il kit. Eseguire una miscela di reazione contenente 12,5 μl di miscela Taq II, 0,5 μl di miscela di primer diluita, 7 μl di acqua e 5 μl di DNA rAAV diluito (campione AAV sconosciuto e standard del passaggio 6.1.4.). Eseguire la RT-qPCR in un sistema di rilevamento PCR in tempo reale, utilizzando il seguente protocollo: 1 ciclo a 95 °C per 2 min (denaturazione iniziale) e 40 cicli a 95 °C per 5 s (denaturazione) e 60 °C per 30 s (ricottura, estensione e lettura della piastra), seguiti da un’analisi della curva di fusione. Calcolare la concentrazione assoluta del campione dalla curva standard (linea di regressione lineare), considerando il fattore di diluizione risultante dalla preparazione del campione rAAV.NOTA: La quantificazione del numero di genomi virali si ottiene attraverso l’amplificazione della sequenza ITR di AAV2 (sequenza target dei primer forniti dal kit). 7. SDS-PAGE, colorazione blu di Coomassie e western blot Denaturare 40 μl di ciascun campione (ogni frazione FPLC, il flusso continuo, i campioni precolonna e un totale di 2,3 × 1010 vg del prodotto concentrato finale) aggiungendo 6 tamponi campione (0,5 M Tris-HCl/0,4% di sodio dodecil solfato (SDS) pH 6,8, 30% di glicerolo, 10% di SDS, 0,6 M di ditiotreitolo (DTT), 0,012% di blu di bromofenolo) e incubando i campioni per 5 minuti a 95 °C. Caricare i campioni denaturati (48 μL) in un gel di poliacrilammide SDS (4% di impilamento e 10% di gel risolutivo) ed eseguire la separazione elettroforetica a 100 V per 70 minuti, adiacente a una scala proteica. Analisi delle proteineNOTA: È possibile eseguire la colorazione blu di Coomassie o il western blotting.Colorazione blu CoomassiePer visualizzare le bande proteiche, colorare il gel per 10 minuti con una soluzione di blu Coomassie G250 allo 0,25% disciolta in metanolo al 50% e acido acetico glaciale al 10%. Eseguire la decolorazione in gel lavandolo più volte con una soluzione contenente il 25% di metanolo e il 5% di acido acetico glaciale fino a quando non diventano visibili bande chiare con fondo basso. Acquisire immagini utilizzando un sistema di imaging appropriato. Western blotTrasferire le proteine su una membrana in PVDF secondo protocolli standard. Bloccare la membrana mediante incubazione in latte scremato al 5% diluito in TBS-T (0,1% Tween 20 in soluzione salina tamponata con Tris) per 1 ora a temperatura ambiente. Utilizzare i seguenti anticorpi primari (diluiti in soluzione bloccante) per l’incubazione notturna a 4 °C: anticorpi monoclonali di topo anti-AAV, anticorpi VP1, VP2, VP3 (B1, 1:1.000) o anticorpi monoclonali di topo anti-AAV, VP1, VP2 (A69, 1:1.000). Lavare le membrane per 3 x 15 minuti in TBS-T e incubare con un anticorpo secondario di capra anti-topo legato alla fosfatasi alcalina (1:10.000), per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare le membrane per 3 x 15 minuti in TBS-T. Aggiungi un substrato chemifluorescente potenziato (ECF) e visualizza le bande proteiche mediante imaging a chemifluorescenza. 8. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) Posizionare una griglia da 200 mesh rivestita in carbonio Formvar capovolta sopra una goccia di un campione rAAV e lasciarla riposare per 1 minuto. Lavare le griglie in una goccia d’acqua e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro. Colorare negativamente le griglie con una soluzione di acetato di uranile all’1% (pH 7) per 1 minuto per fissare e contrastare le particelle virali. Lavare le griglie in una goccia d’acqua e asciugare il liquido in eccesso con carta da filtro. Esaminare i campioni in un microscopio elettronico a trasmissione.NOTA: Alte concentrazioni di sale possono avere un impatto diretto sul legame degli rAAV alla griglia e portare alla visualizzazione di strutture cristalline. 9. Analisi consecutiva dell’assorbimento della luce ultravioletto-visibile, della diffusione statica della luce e della diffusione dinamica della luce Su una piastra di quantificazione a 96 pozzetti, caricare 2 μL di un campione rAAV e 2 μL di PBS da utilizzare come bianco tampone (eseguire questa operazione in duplicati). Utilizzare l’applicazione AAV Quant nel software di analisi del cliente, posizionare i nomi dei campioni nella posizione corretta della piastra, selezionare il sierotipo AAV e fare clic su Avanti. Caricare la piastra di quantificazione a 96 pozzetti nell’apparecchiatura dedicata e procedere con la lettura della piastra per l’acquisizione dei dati. 10. Saggi di trasduzione in vitro Diverse linee cellulari possono essere utilizzate per analizzare rapidamente l’efficienza di trasduzione degli rAAV.Seminare uniformemente HEK293T cellule in piastre a 24 pozzetti (a una densità di 137.500 cellule/pozzetto) e una linea cellulare di neuroblastoma-2A (Neuro2a) di topo in piastre a 24 pozzetti (50.000 cellule/pozzetto) o in un vetrino a 8 pozzetti (27.000 cellule/pozzetto), utilizzando DMEM ad alto glucosio, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l’1% di penicillina-streptomicina, come descritto sopra. Lasciare aderire le celle per una notte a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Raccogliere il terreno condizionato da ciascun pozzetto (250 μl da piastre a 24 pozzetti e 50 μl dal vetrino della camera a 8 pozzetti) e conservarlo a 4 °C per un uso successivo. Aggiungere i seguenti preparati rAAV a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in un’atmosfera di CO2 al 5%.Aggiungere 50 μl delle frazioni F2-F16 raccolte da FPLC e fluire in HEK293T le cellule piastrate in piastre a 24 pozzetti. Aggiungere un totale di 5,5 × 109 vg di rAAV concentrati diluiti in 50 μL di PBS alle cellule Neuro2a piastrate in piastre a 24 pozzetti (includere un pozzetto di controllo negativo, aggiungendo 50 μL di PBS alle cellule). Aggiungere un totale di 2,75 × 109 vg di rAAV concentrati diluiti in 25 μL di PBS alle cellule Neuro2a piastrate in un vetrino a 8 pozzetti (includere la condizione di controllo negativo, aggiungendo 50 μL di PBS alle cellule). Aggiungere il terreno condizionato precedentemente conservato (fase 10.1.2) in ciascun pozzetto e incubare per 24 ore. Scartare il terreno e lavare le celle 2 volte con PBS. Aggiungere una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4%, integrata con saccarosio al 4% in PBS, preriscaldata a 37 °C, in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Lavare 2 volte con PBS e conservare a 4 °C fino all’esecuzione dell’imaging (punto di pausa). Acquisizione di immagini su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 10x/0,30 o su un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo DIC a olio 40x/1,4. Per avere un modello più rilevante e riflessivo dell’ambiente in vivo , utilizzare colture neuronali primarie come segue:Preparare colture primarie di neuroni corticali come precedentemente descritto da Santos et al.57. In breve, seminare 200.000 cellule/mL in piastre a 12 pozzetti e mantenerle in coltura fino al giorno in vitro 16. Raccogliere il terreno condizionato da ciascun pozzetto (100 μL) e conservarlo a 4 °C per un uso successivo. Aggiungere i rAAV da testare a ciascun pozzetto: un totale di 2,75 × 109 vg di rAAV concentrati diluiti in 25 μL di PBS (includere il controllo negativo: 25 μL di PBS). Incubare per 24 ore a 37 °C in atmosfera di CO2 al 5%. Aggiungere il terreno condizionato precedentemente conservato e incubare per 24 ore. Scartare il terreno in ogni pozzetto e lavare 2 volte con PBS. Fissare le celle con il 4% di PFA/4% di saccarosio nel PBS, come descritto al punto 10.1.6. Lavare 2 volte con PBS. Incubare ogni pozzetto con 5 μg/mL di agglutinina di germe di grano (WGA) coniugata con Alexa Fluor 633 per 10 minuti a temperatura ambiente (passaggio opzionale: eseguire invece l’immunocitochimica). Lavare 2 volte con PBS. Incubare in Triton X-100 allo 0,25% in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare con PBS. Incubare con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare 2 volte con PBS. Acquisisci immagini su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un obiettivo 40x/0,95 o su un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo 40x/1,4 Oil DIC. 11. Esperimenti in vivo NOTA: Gli animali sono stati alloggiati in una stanza a temperatura controllata, mantenuta su un ciclo luce/buio di 12 ore. Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali. Iniezione stereotassica nel cervellettoAnestetizzare animali C57BL/6 di 9 settimane mediante inalazione di isoflurano al 2% in presenza di ossigeno (0,8 L/min) in una camera collegata a un vaporizzatore. Posizionare l’animale anestetizzato nell’apparato stereotassico (su un tampone riscaldato a 35 °C) e posizionare la maschera di isoflurano nel naso dell’animale. Abbassa il livello di isoflurano all’1,3-1,7%.NOTA: Assicurarsi che l’animale sia correttamente anestetizzato prima di procedere (perdita del riflesso per flessione in entrambi gli arti posteriori). Applicare un unguento lubrificante per gli occhi per evitare l’essiccazione delle cornee e iniettare all’animale un analgesico approvato.NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in condizioni sterili. Dopo aver rasato il pelo della testa dell’animale e disinfettato l’area chirurgica, esporre il cranio e posizionare la punta di un ago per iniezione a punta smussata da 30 G, collegato a una siringa Hamilton da 10 μL, direttamente sopra il bregma (utilizzare il bregma come zero per il calcolo delle coordinate stereotassiche). Sposta l’ago nella coordinata prevista e pratica un foro attraverso il cranio dove entrerà l’ago.NOTA: Nell’ambito di questo studio, una singola iniezione è stata eseguita centralmente nel cervelletto. Iniettare 4 μL di una soluzione di rAAV contenente un totale di 8 × 109 vg, diluita in PBS, ad una velocità di infusione di 0,5 μL/min utilizzando un iniettore automatico. Utilizzare le seguenti coordinate, calcolate da bregma, per eseguire una singola iniezione centralmente nel cervelletto di un topo adulto C57BL/6: antero-posteriore: -6,5 mm; laterale: 0 mm; ventrale: -2,9 mm.NOTA: Queste coordinate possono variare in base al ceppo del topo, al sesso e all’età degli animali in uso. Per ridurre al minimo il riflusso e consentire la diffusione del vettore virale, una volta completata l’infusione, lasciare l’ago della siringa a queste coordinate per 3 minuti, quindi ritrarlo lentamente di 0,3 mm e lasciarlo rimanere in posizione per altri 2 minuti prima della sua completa rimozione dal cervello del topo. Chiudere l’incisione e pulirla con un agente disinfettante (ad es. 10% di iodio povidone). Consenti agli animali di riprendersi dall’anestesia prima di riportarli nelle gabbie di casa. Raccolta e preparazione dei tessutiNOTA: In questo esperimento, i livelli di trasduzione sono stati osservati 12 settimane dopo l’iniezione, ma la stessa procedura potrebbe essere valutata già 4 settimane dopo l’iniezione.Anestetizzare terminalmente gli animali mediante somministrazione intraperitoneale di un sovradosaggio di xilazina/ketamina (8/160 mg/kg di peso corporeo). Perfondere transcardicamente gli animali con PBS ghiacciato per 6 minuti a una velocità di 2,5 ml/min, seguito dalla perfusione con una soluzione di PFA al 4% ghiacciata appena preparata per 10 minuti alla stessa velocità. Postfissare i cervelli asportati in PFA al 4% per una notte a temperatura ambiente e poi trasferirli in una soluzione di saccarosio/PBS al 25% per la crioprotezione. Una volta che il cervello affonda (circa 48 ore dopo), conservalo a -80 °C. Tagliare sezioni sagittali seriali con uno spessore di 30 μm utilizzando un criostato a -21 °C. Per ogni animale, raccogliere 96 sezioni sagittali di un emisfero cerebrale in serie anatomiche come sezioni flottanti in PBS integrate con azoturo di sodio allo 0,05%. Conservare a 4 °C fino a nuova lavorazione. Immunoistochimica a fluorescenza standardSelezionare otto sezioni sagittali per animale, a una distanza di 240 μm l’una dall’altra. Incubare le sezioni flottanti in una soluzione bloccante/permeabilizzante (0,1% Triton X-100 contenente il 10% di siero normale di capra (NGS) in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente. Incubare le sezioni per una notte a 4 °C con anticorpo primario policlonale anti-GFP di pollo (1:1.000). Lavare per 3 x 15 minuti in PBS e incubare le sezioni per 2 ore a temperatura ambiente con l’anticorpo policlonale secondario capra anticorpo anti-pollo coniugato al fluoroforo Alexa Fluor 488 (1:200). Lavare per 3 x 15 min in PBS. Incubare con DAPI per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare per 3 x 15 min in PBS. Posizionare le sezioni in vetrini rivestiti di gelatina e vetrino coprioggetti con mezzo di montaggio a fluorescenza. Acquisizione di immagini su un microscopio a fluorescenza con scanner per vetrini dotato di obiettivo 20x/0,8.

Representative Results

In questo lavoro, presentiamo un protocollo dettagliato per la produzione, la purificazione e la caratterizzazione di rAAV a mosaico (riassunti in Figura 1), che hanno il potenziale per colpire e trasdurre il SNC (ad es. AAV1 e AAV9), essendo contemporaneamente adatti per la purificazione cromatografica di affinità dell’eparina (AAV2). Per raggiungere questo obiettivo, sono stati utilizzati capsidi dei sierotipi 1, 2 e 9 di AAV naturale per sviluppare vettori a mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9. Prima di iniziare, le preparazioni plasmidiche sono state sottoposte a screening per l’integrità strutturale. Oltre alle digestioni necessarie per convalidare il corretto inserimento dei frammenti di clonazione, è essenziale eseguire costantemente lo screening dei plasmidi pITR per rilevare potenziali delezioni/inserzioni ITR. Ad esempio, l’integrità degli ITR in diversi cloni di un plasmide pITR è stata monitorata dopo la digestione del plasmide con l’enzima di restrizione SmaI (Figura supplementare S1). Entrambi i tipi di vettori a mosaico sono stati generati dalla co-trasfezione dei rispettivi plasmidi del capside AAV in un rapporto 1:1, secondo i metodi di trasfezione standard6. In breve, HEK293T cellule sono state trasfettate con i) un plasmide contenente il transgene di interesse impacchettato tra le sequenze ITR (pITR), ii) un plasmide contenente il genoma AAV wild-type Rep e Cap ORF di AAV2 e AAV1 o AAV9 (plasmidi pAAV-RC) e iii) un plasmide codificante le proteine adenovirali (E1A, E1B, E4 ed E2A) e gli RNA associati al virus adenovirus essenziali per le funzioni helper (pHelper). Quarantotto ore dopo, le cellule sono state raccolte 6,36 e gli rAAV sono stati purificati dall’omogenato cellulare mediante cromatografia di affinità utilizzando un sistema FPLC. Come illustrato nella Figura 2A, dopo l’equilibrio della colonna (fase di equilibrio), il lisato cellulare contenente gli rAAV è stato applicato alla colonna (caricamento del campione). A causa della naturale affinità di rAAV2 per l’eparina33, gli rAAV si sono legati alla resina della colonna, mentre altri componenti sono stati trasportati nel buffer di corsa e rilevati dal monitor UV (flowthrough), con conseguente aumento dell’assorbanza. La colonna è stata successivamente lavata (fase di lavaggio) e gli rAAV sono stati infine eluiti mediante un aumento della concentrazione di NaCl (fase di eluizione). I virus eluiti sono stati rilevati dal monitor UV e raccolti in frazioni di 1 mL. Un profilo rappresentativo del picco di eluizione di rAAV1/2 e rAAV2/9 è mostrato rispettivamente nella Figura 2B e nella Figura S2A supplementare, con diversi lotti virali che presentano costantemente un singolo picco a partire dalla frazione F7 fino a F16. L’altezza del picco è variabile tra le produzioni di rAAV, con picchi più alti che di solito portano a rese rAAV più elevate. Ogni frazione dei rAAV1/2 e rAAV2/9 prodotti è stata successivamente caratterizzata mediante RT-qPCR per valutare i titoli virali (Figura 2C e Figura supplementare S2B). Per caratterizzare la purezza del materiale eluito, 40 μL di ciascuna frazione e del rispettivo flusso sono stati esaminati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS al 10% (Figura 2D per rAAV1/2 e Figura supplementare S2C per rAAV2/9). La colorazione blu di Coomassie ha rivelato tre bande principali nelle frazioni F7-F16, con pesi molecolari corrispondenti alle proteine del capside VP1 (87 kDa), VP2 (72 kDa) e VP3 (62 kDa) degli AAV nei rapporti appropriati 1:1:10, come precedentemente descritto da Van Vliet e colleghi14. In entrambi i casi, e in base all’assorbanza UV, alla RT-qPCR e all’intensità della banda di gel, è chiaro che la maggior parte dei rAAV a mosaico è presente nelle frazioni F7 e F8 e inizia a diminuire gradualmente nelle frazioni F9-F16. Oltre alle tre proteine del capside virale, un’altra proteina (o proteine) di circa 17 kDa è stata rilevata nelle frazioni F8-F16. Per eliminare questa proteina co-purificante, le frazioni F7-16 sono state successivamente filtrate e concentrate utilizzando unità filtranti centrifughe da 100 KDa e il titolo finale di rAAV è stato determinato mediante RT-qPCR (come mostrato nella Figura 3A, B per rAAV1/2). La resa finale di una produzione di rAAV dipende dalla lunghezza e dalla complessità del pITR, dall’integrità delle sequenze ITR, dalle condizioni di coltura cellulare (ad esempio, numero di passaggi cellulari) e dall’efficienza di trasfezione 24,58,59,60,61. Tuttavia, il titolo finale può essere regolato eseguendo più centrifugazioni della preparazione rAAV utilizzando unità filtranti centrifughe da 0,5 mL (fase di concentrazione 2). Seguendo questo protocollo, per un volume finale compreso tra 50 e 100 μL, le concentrazioni sono generalmente comprese tra 2 × 109 e 5 × 1010 vg/μL (quantificazione eseguita utilizzando il kit di titolazione di riferimento). La purezza delle preparazioni finali di rAAV è stata quindi valutata su un gel di poliacrilammide SDS al 10%. Come illustrato nella Figura 3C, sono state osservate solo tre bande che rappresentano le proteine del capside rAAV per la preparazione di rAAV1/2 e non sono state identificate proteine co-purificanti rilevabili. Questi risultati sono stati coerenti con quelli ottenuti per rAAV2/9 (Figura supplementare S2C). Per confermare l’identità e caratterizzare ulteriormente la purezza dei vettori rAAV1/2 e rAAV2/9, le frazioni virali e gli stock concentrati sono stati analizzati mediante western blot, con gli anticorpi specifici B1 (Figura supplementare S3A e Figura supplementare S4A) e A69 (Figura supplementare S3B e Figura supplementare S4B). Mentre l’anticorpo B1 riconosce un epitopo C-terminale comune a tutte le proteine VP della maggior parte dei sierotipi AAV62, il clone A69 riconosce solo gli epitopi di VP1 e VP263. Tuttavia, alcune bande deboli con pesi molecolari inferiori a VP3 (<62 kDa) possono essere rilevate anche dopo la marcatura di B1 e A69. Per caratterizzare la morfologia strutturale e valutare ulteriormente la purezza degli rAAV, le particelle virali sono state visualizzate direttamente mediante TEM. Questa tecnica è stata la procedura standard per valutare l’integrità e la purezza del campione nei campioni virali, in quanto consente la quantificazione delle particelle rAAV vuote e piene, nonché la valutazione della contaminazione in un campione 29,64,65,66,67. Come mostrato nella Figura 3D, grandi quantità di particelle rAAV, ~25 nm di diametro, potrebbero essere osservate su uno sfondo pulito. In tutto il campo campione si possono osservare anche particelle vuote (freccia nera) con un centro denso di elettroni, così come vettori pieni (freccia bianca). Abbiamo anche eseguito il controllo di qualità degli rAAV purificati utilizzando Stunner, una piattaforma che combina spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), diffusione statica della luce (SLS) e diffusione dinamica della luce (DLS)68. Per ogni campione, la quantità totale di proteine, ssDNA, nonché l’assorbimento delle impurità e la torbidità di fondo, sono stati misurati mediante spettroscopia UV-Vis (Figura 3E e Figura supplementare S5A). SLS e DLS sono stati quindi applicati per valutare il comportamento di diffusione della luce dei capsidi rAAV. Dato che gli AAV hanno un diametro medio di 25 nm, le particelle entro un intervallo di diametro 15-45 nm sono considerate intatte. Le particelle più grandi rappresentano tipicamente aggregati virali e tutto ciò che è più piccolo comprende molto probabilmente particelle piccole, comprese le proteine del capside non assemblate68. Per rAAV1/2, è stato osservato un singolo picco corrispondente a particelle di capside intatte a 30 nm (Figura 3F), con 0% di intensità aggregata e 0% di intensità di piccole particelle. Per la preparazione di rAAV2/9, è stato rilevato anche un picco a 30 nm che rappresenta un’intensità del capside del 78% (Figura supplementare S5B). Anche se l’intensità delle piccole particelle era dello 0%, per questo campione è stata misurata un’intensità aggregata del 22% (raffigurata in grigio), con il contributo maggiore (19,9%) dei grandi aggregati con un diametro medio di 620 nm (Figura supplementare S5B). Attraverso la combinazione della spettroscopia UV-Vis con le informazioni SLS e DLS, Stunner ha rivelato il titolo totale complessivo del capside, il titolo completo del capside, la proteina libera e aggregata, nonché l’ssDNA libero e aggregato per le due preparazioni virali, mostrate nella Figura 3G e nella Figura S5C supplementare (valori specifici indicati nella legenda di ciascuna figura). Parallelamente, per valutare l’attività biologica dei vettori AAV a mosaico sviluppati, HEK293T cellule sono state infettate con 50 μL di ciascuna frazione ottenuta da FPLC (F2-F16) della preparazione rAAV1/2 o rAAV2/9. Poiché il vettore rAAV1/2 codifica per una proteina fluorescente verde a singolo filamento (GFP), sotto il controllo di un promotore del CMV (pAAV-CMV-ssGFP), e il vettore rAAV2/9 codifica per una GFP autocomplementare, sotto il controllo del promotore del CMV (PAAV-CMV-SCGFP53), LA FLUORESCENZA DIRETTA DELLA GFP È STATA ESAMINATA IN QUESTE CELLULE 48 ORE DOPO L’INFEZIONE (Figura S6 e Figura S7). Coerentemente con le precedenti osservazioni per RT-qPCR, blu di Coomassie e western blot, il livello di infettività più alto è stato raggiunto per le frazioni virali F7 e F8, diminuendo gradualmente nelle frazioni da F9 a F16. Per confermare se l’attività biologica degli rAAV fosse mantenuta dopo l’ultrafiltrazione e le fasi di concentrazione, le cellule Neuro2A, piastrate sia in piastre a 24 pozzetti che in un vetrino a 8 pozzetti, sono state infettate con il vettore rAAV1/2 concentrato, codificante scGFP sotto il controllo del promotore del CMV (pAAV-CMV-scGFP53). Le immagini in campo chiaro e in fluorescenza sono state acquisite 48 ore dopo l’infezione (Figura 4A, B per immagini a risoluzione più elevata). Con l’obiettivo di esplorare la capacità infettiva dei rAAV prodotti in un modello cellulare più rilevante e riflettente, colture neuronali primarie semi-dense della corteccia sono state seminate su una piastra a 12 pozzetti e infettate con rAAV1/2 – CMV-scGFP precedentemente utilizzato. Quarantotto ore dopo l’infezione, le cellule sono state fissate e marcate con DAPI e WGA coniugate con Alexa Fluor 633, una lectina ampiamente utilizzata per marcare le cellule fisse. Le immagini mostrate in Figura 4C,D sono state acquisite con uno Zeiss Axio Observer Z1 e su un LSM 710 confocale Zeiss. Come raffigurato in queste figure dalla fluorescenza diretta della GFP, i virus a mosaico concentrati conservano le loro proprietà di trasferimento genico per le cellule neuronali. Dopo aver caratterizzato i rAAV a mosaico in termini di purezza, proprietà fisiche e funzionalità in vitro, abbiamo successivamente valutato la possibilità di utilizzare i vettori a mosaico rAAV1/2 purificati per trasdurre il cervelletto di topi C57BL/6. Per questo, è stata eseguita un’iniezione stereotassica in topi di 9 settimane e l’espressione di GFP è stata valutata 12 settimane dopo. Come anticipato, gli animali iniettati con PBS non hanno mostrato fluorescenza all’immunomarcatura GFP. Le immagini di epifluorescenza di topi iniettati con vettori rAAV1/2 che codificano per GFP sotto il controllo del promotore della sinapsina 1 (rAAV1/2 – Syn-ssGFP) hanno rivelato che i vettori rAAV1/2 hanno trasdotto con successo diverse regioni del cervelletto, vale a dire la regione dei nuclei cerebellari profondi (DCN), nonché i diversi lobuli del cervelletto (Figura 5). Questi risultati dimostrano l’espressione prolungata del transgene nel cervello dei mammiferi (12 settimane). Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo di produzione e purificazione di rAAV. Gli rAAV sono prodotti dalla trasfezione transitoria di cellule HEK293T utilizzando polietilenimmina (PEI). Successivamente, le cellule vengono raccolte e lisate e gli rAAV vengono purificati dall’omogenato cellulare tramite cromatografia di affinità. Le frazioni raccolte contenenti rAAV vengono quindi concentrate e gli stock virali finali vengono caratterizzati in termini di titolo, purezza, caratteristiche morfologiche e attività biologica. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; PEI = polietilenimmina; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Protocollo di purificazione FPLC e profilo di eluizione rappresentativo di rAAV1/2. (A) Rappresentazione schematica di un profilo cromatografico completo, che mostra le diverse fasi del processo di purificazione di rAAV. Dopo una fase di equilibrio della colonna, viene applicato il campione. La colonna viene quindi lavata e l’eluizione viene eseguita con concentrazioni crescenti di NaCl. Il materiale non legato (flowthrough) e le frazioni da 1 mL dei virus eluiti vengono raccolti per l’analisi. L’assorbanza a 280 nm è espressa in mAU e l’asse x indica il volume in mL. (B) Cromatogramma parziale ingrandito che mostra un picco di eluizione rAAV1/2 (in nero), con i corrispondenti numeri di frazione (F2-F16) e rifiuti (indicati in rosso). La concentrazione emessa del tampone B e la conducibilità (espressa in mS/cm) sono mostrate rispettivamente in verde e viola. (C) RT-qPCR di ciascuna frazione raccolta durante la purificazione per affinità (F2-F16) e il flowthrough. Il titolo in vg/μL è rappresentato su una scala logaritmica. (D) Analisi SDS-PAGE delle frazioni virali raccolte. Volumi uguali (40 μL) di ciascuna frazione dalla fase di eluizione (F2-F16) e il rispettivo flusso sono stati caricati e risolti su un gel di poliacrilammide SDS al 10%. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante colorazione blu di Coomassie. Sono indicate le bande corrispondenti alle proteine del capside AAV VP1, VP2 e VP3. La scala delle dimensioni standard delle proteine è designata come (L) e sono indicati anche i pesi molecolari corrispondenti. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Caratterizzazione dei vettori rAAV1/2 concentrati. (A) Curve di amplificazione di un campione concentrato di rAAV1/2 (in blu), standard diluiti in serie da 2 × 107 vg/μL a 2 × 102 vg/μL (in nero) e un controllo senza stampo (in verde), ottenuti durante RT-qPCR. (B) Curva standard (regressione lineare) per la determinazione del titolo di un campione di rAAV in vg/μL. (C) Analisi SDS-PAGE delle particelle virali concentrate. Un totale di 2,3 × 1010 vg dello stock concentrato sono stati raggruppati sul gel. (D) Immagine al microscopio elettronico a trasmissione di particelle rAAV1/2 con ~25-30 nm di diametro. Le particelle vuote con un centro denso di elettroni (evidenziato da frecce nere) possono essere distinte dai capsidi pieni (evidenziati da frecce bianche). Barra di scala = 100 nm. (E) Spettro di assorbanza di un preparato rAAV1/2 misurato mediante stordimento (in nero). Vengono inoltre mostrati il contributo di proteine (in blu), ssDNA (in verde), altri composti o impurità che assorbono i raggi UV (in viola) e torbidità di fondo (in grigio). (F) Distribuzione dell’intensità DLS di rAAV1/2 con un singolo picco a 30 nm, misurata mediante Stunner. Un’intensità di scattering del capside del 100% è stata determinata misurando l’area sotto la curva da 15 a 45 nm (ombreggiata in verde). (G) Analisi dello stordimento di una preparazione di vettore rAAV1/2 che mostra un titolo totale del capside di 1,19 × 1014 cp/mL (blu scuro) e un titolo completo del capside di 1,73 × 1013 vg/mL (verde scuro). Sono state misurate anche una proteina libera e aggregata di 7,16 × 1012 cp/mL equivalenti (azzurro), nonché un ssDNA libero e aggregato di 1,04 × 1012 vg/mL equivalenti (verde chiaro). Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; ssDNA = DNA a filamento singolo; DLS = diffusione dinamica della luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Valutazione dell’infettività in vitro di un campione concentrato di rAAV1/2. (A) Le cellule Neuro2A sono state infettate con rAAV1/2 – CMV-scGFP o incubate con un volume equivalente di PBS, come controllo negativo. Immagini in campo chiaro e a fluorescenza di cellule visualizzate 48 ore dopo l’infezione. Le immagini sono state acquisite in uno Zeiss Axio Observer Z1 (obiettivo 10x). Barre della scala = 100 μm. (B) Immagini dettagliate delle cellule Neuro2A 48 ore dopo l’infezione con rAAV1/2 – CMV-scGFP. Le immagini sono state acquisite in uno Zeiss LSM 710 (obiettivo 40x). Barre della scala = 20 μm. (C) Colture neuronali primarie semidense infettate con rAAV1/2 – CMV-scGFP o incubate con un volume equivalente di PBS, che fungono da controllo negativo. Le cellule sono state etichettate con una colorazione nucleare (DAPI in blu) e una colorazione di membrana (WGA in bianco). Le immagini sono state acquisite in uno Zeiss Axio Observer Z1 (obiettivo 40x). Barre della scala = 20 μm. (D) Immagini dettagliate di colture neuronali primarie semidense 48 ore dopo l’infezione con rAAV1/2 – CMV-scGFP. Le immagini sono state acquisite in uno Zeiss LSM 710 (obiettivo 40x). Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; CMV = citomegalovirus; scGFP = proteina fluorescente verde autocomplementare; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindo; WGA = agglutinina del germe di grano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Efficienza di trasduzione in vivo di rAAV1/2 dopo un’iniezione intraparenchimale. Immagini rappresentative in immunofluorescenza che mostrano l’espressione diffusa di GFP (in verde) in tutto il cervelletto dopo un’iniezione centrale di rAAV1/2 – Syn-ssGFP nel cervelletto. I nuclei sono stati colorati con DAPI (in blu). Barre di scala = 500 μm. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; Syn = sinapsina 1; ssGFP = proteina fluorescente verde a singolo filamento; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindo; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura S1 supplementare: Analisi su gel di agarosio di un plasmide vettore rAAV digerito con SmaI. Sei cloni (C1-C6) di un pITR sono stati digeriti con l’enzima di restrizione SmaI (corsie 2, 4, 6, 8, 10 e 12), che taglia due volte all’interno di ciascuna ripetizione terminale invertita. In questo caso, una digestione completa di questo pITR dovrebbe generare due bande (3.796 pb e 3.013 pb). Nelle preparazioni di successo (C1, C3, C4 e C5) è ancora visibile una banda di 6809 bp, derivante dalla digestione parziale (~5% del totale). Nelle preparazioni con ricombinazione ITR, le proporzioni sono invertite (C2) o la digestione non è avvenuta (C6). Vengono presentati anche i rispettivi cloni non digeriti (corsie 3, 5, 7, 9, 11, 13). Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; ITR = ripetizione terminale invertita. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura S2 supplementare: purificazione di rAAV2/9 mediante cromatografia di affinità a base di eparina. (A) Profilo di eluizione di rAAV2/9 che mostra un singolo picco (in nero), a seguito di un aumento della concentrazione di NaCl. Le frazioni raccolte sono indicate dai numeri (2-16) in rosso nella parte inferiore del grafico, l’assorbanza a 280 nm è espressa in mAU, la conducibilità è espressa in mS/cm e l’asse x indica il volume in mL. (B) titoli rAAV quantificati mediante RT-qPCR per ciascuna frazione aggregata (F2-F16) e flowthrough. I valori sono rappresentati su una scala logaritmica. (C) Saggio di purezza mediante SDS-PAGE e colorazione blu di Coomassie. Volumi uguali (40 μL) di ciascuna frazione (F2-F16) e il rispettivo flusso sono stati caricati e risolti su una SDS-PAGE al 10%. Lo stock concentrato è stato quantificato mediante RT-qPCR e 2,3 × 1010 vg sono stati diluiti in 40 μL di PBS e raggruppati sul gel. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante colorazione blu di Coomassie. Sono indicate le proteine del capside AAV (VP1, VP2 e VP3). La scala delle dimensioni standard delle proteine è designata con (L) e sono indicati anche i pesi molecolari corrispondenti. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; RT-qPCR = reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura S3 supplementare: Analisi Western blot di vettori rAAV1/2 purificati mediante FPLC. (A) Le frazioni raccolte e i vettori concentrati di rAAV1/2 sono stati risolti su un gel SDS-PAGE e sondati con anticorpo monoclonale anti-AAV di topo (B1) che riconosce le proteine del capside VP1, VP2 e VP3. (B) Le frazioni raccolte e i vettori concentrati di rAAV1/2 sono stati risolti su un gel SDS-PAGE e sondati con anticorpo monoclonale di topo anti-AAV (A69) che riconosce le proteine del capside VP1 e VP2. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; FPLC = cromatografia liquida di proteine veloci; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; L = scala delle dimensioni standard delle proteine. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura S4 supplementare: Analisi Western blot di vettori rAAV2/9 purificati mediante FPLC. (A) Le frazioni raccolte e i vettori rAAV2/9 concentrati sono stati risolti su un gel SDS-PAGE e sondati con anticorpo monoclonale anti-AAV (B1) di topo che riconosce le proteine del capside VP1, VP2 e VP3. (B) Le frazioni raccolte e i vettori concentrati di rAAV2/9 sono stati risolti su un gel SDS-PAGE e sondati con anticorpo monoclonale di topo anti-AAV (A69) che riconosce le proteine del capside VP1 e VP2. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; FPLC = cromatografia liquida di proteine veloci; SDS-PAGE = elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide; L = scala delle dimensioni standard delle proteine. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura S5 supplementare: quantificazione e caratterizzazione del vettore rAAV2/9 tramite Stunner. (A) Spettro di assorbanza (nero) di un vettore rAAV2/9 misurato mediante Stunner. Sono inoltre raffigurati il contributo di proteine (blu), ssDNA (verde), altri composti o impurità che assorbono i raggi UV (viola) e torbidità di fondo (grigio). (B) Distribuzione dell’intensità DLS di rAAV2/9 con un picco maggiore a 30 nm corrispondente a un’intensità di scattering del capside del 78%, determinata misurando l’area sotto la curva da 15 a 45 nm (ombreggiata in verde). È stata misurata anche un’intensità totale dell’aggregato del 22% (ombreggiata in grigio) con un contributo principale di aggregati di grandi dimensioni (19,9%) con un diametro medio di 620 nm. (C) Analisi dello stordimento di una preparazione di vettore rAAV2/9 che mostra un titolo totale del capside di 2,18 × 1014 cp/mL (blu scuro) e un titolo completo del capside di 2,35 × 1013 vg/mL (verde scuro). In questa preparazione sono stati misurati anche una proteina libera e aggregata di 2,92 × 1013 cp/mL equivalenti (azzurro), nonché un ssDNA libero e aggregato di 3,14 × 1012 vg/mL equivalenti (verde chiaro). Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; ssDNA = DNA a filamento singolo; DLS = diffusione dinamica della luce. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura supplementare S6: Efficienza di trasduzione in vitro e vitalità delle frazioni purificate di rAAV1/2. HEK293T cellule che esprimono GFP (fluorescenza diretta) 48 ore dopo la trasduzione con 50 μL di frazioni FPLC di un vettore rAAV1/2 che codifica per ssGFP (rAAV1/2 – CMV-ssGFP). Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; FPLC = cromatografia liquida di proteine veloci; ssGFP = proteina fluorescente verde a filamento singolo. Fare clic qui per scaricare questo file. Figura supplementare S7: Efficienza di trasduzione in vitro e vitalità delle frazioni purificate di rAAV2/9. HEK293T cellule sono state infettate con 50 μL di ciascuna frazione FPLC (F2-F16) o flowthrough di un vettore rAAV2/9 che codifica scGFP sotto il controllo del promotore del CMV. Le cellule che esprimono GFP sono state visualizzate 48 ore dopo l’infezione. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: rAAV = virus adeno-associato ricombinante; FPLC = cromatografia liquida di proteine veloci; scGFP = proteina fluorescente verde autocomplementare; CMV = citomegalovirus. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Il toolkit di vettori AAV in rapida espansione è diventato uno dei sistemi di consegna genica più promettenti per un’ampia gamma di tipi di cellule attraverso diverse vie di somministrazione. In questo lavoro, abbiamo mirato a sviluppare un protocollo migliorato per la produzione, la purificazione e la caratterizzazione di vettori rAAV a mosaico che potessero dimostrare il loro valore negli studi preclinici. A tale scopo, la generazione di vettori mosaico rAAV1/2 e rAAV2/9 è descritta qui, ma la procedura può essere applicata anche per purificare i vettori rAAV2 standard (dati non mostrati).

I rAAV a mosaico sono stati prodotti seguendo un metodo di trasfezione ottimizzato utilizzando PEI come reagente di trasfezione. È stato scelto un metodo di trasfezione transitoria per la sua maggiore flessibilità e velocità, notevoli vantaggi negli studi preclinici in fase iniziale. Una volta che un particolare transgene e sierotipo sono stati convalidati, il sistema di produzione può essere messo a punto per ottenere una migliore scalabilità ed economicità stabilendo una linea cellulare trasfettata stabile che esprime un sottoinsieme dei geni specifici Rep/Cap , con geni aggiuntivi forniti da un processo di infezione²⁴. Rispetto alla trasfezione calcio-fosfato, il PEI presenta diversi vantaggi. È un reagente di trasfezione stabile ed economico che funziona efficacemente all’interno di un intervallo di pH più ampio. Inoltre, elimina la necessità di cambiare il mezzo cellulare dopo la trasfezione, con conseguente riduzione significativa sia dei costi che del carico di lavoro⁶⁹.

Nel tentativo di aggirare alcune delle limitazioni imposte dai gradienti di CsCl o iodixanolo, gli rAAV prodotti sono stati raccolti e purificati mediante cromatografia di affinità. Questa strategia offre un approccio semplificato e scalabile che può essere eseguito senza la necessità di ultracentrifugazione e gradienti, producendo titoli virali puliti e elevati. In effetti, le tecniche cromatografiche che utilizzano un sistema FPLC possono essere automatizzate e scalate impacchettando più volume di resina in una colonna con un’altezza del letto maggiore. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per incorporare colonne HiTrap Heparin HP da 5 ml (dati non mostrati). Inoltre, le colonne di eparina possono essere riutilizzate più volte, contribuendo così all’economicità di questo metodo.

Gli rAAV purificati sono stati quindi caratterizzati in termini di titolo, purezza, caratteristiche morfologiche e attività biologica. È interessante notare che, nella colorazione blu di Coomassie, è stata rilevata una banda con circa 17 kDa nelle frazioni F8-F16 oltre alle tre tipiche proteine del capside virale. Tuttavia, questa banda non è più presente dopo la fase di concentrazione dei rAAV. Inoltre, alcune bande deboli con pesi molecolari inferiori a VP3 (<62 kDa) possono essere rilevate anche dopo la marcatura di B1 e A69, suggerendo che potrebbero essere frammenti delle proteine del capside VP1, VP2 e VP3⁷⁰. Un’altra possibilità è che si tratti in realtà di altre proteine co-purificanti come la ferritina o altre proteine cellulari con polipeptidi che condividono impronte proteiche simili alle proteine del capside AAV e potrebbero essere coinvolte nella biologia dell’AAV, come precedentemente suggerito 26,71,72.

L’analisi TEM e dello storditore ha anche rivelato la presenza di particelle vuote a livelli variabili tra le diverse produzioni. Allo stesso modo, altri studi hanno precedentemente riportato la generazione di livelli variabili e alti (>65%) di capsidi vuoti per rAAV preparati con metodi di trasfezione o infezione^24,73. Il meccanismo alla base della generazione di rAAV inizia con la rapida formazione di capsidi vuoti da proteine VP di nuova sintesi, seguita da una lenta fase di limitazione della velocità di impacchettamento del genoma nei capsidi preformati mediata dalle proteine Rep^74,75. Pertanto, i capsidi vuoti vengono generati nelle produzioni di rAAV, sebbene la proporzione di capsidi vuoti e pieni possa variare a seconda delle dimensioni e della sequenza del transgene di interesse e delle condizioni di coltura cellulare^58,73. I capsidi vuoti sollevano alcune preoccupazioni poiché, mancando del genoma di interesse, non sono in grado di fornire un effetto terapeutico e possono anche potenzialmente aumentare una risposta immunitaria innata o adattativa. Tuttavia, alcuni rapporti hanno anche dimostrato che, regolando il loro rapporto, i capsidi AAV vuoti possono fungere da esche altamente efficaci per gli anticorpi neutralizzanti specifici per AAV e, quindi, aumentare l’efficienza di trasduzione 60,76,77. Se la presenza di capsidi vuoti è criticamente dannosa e dato il carattere leggermente meno anionico delle particelle vuote rispetto ai vettori pieni, una potenziale soluzione potrebbe comportare l’esecuzione di una seconda fase di purificazione di lucidatura utilizzando tecniche di cromatografia a scambio anionico⁶⁴.

Questo studio fornisce anche prove convincenti che gli rAAV a mosaico generati sono in grado di trasdurre in modo efficiente non solo le colture neuronali in vitro, ma anche il sistema nervoso centrale dopo l’iniezione intracranica di rAAV1/2. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che il protocollo di produzione e purificazione descritto rende rAAV altamente puri e biologicamente attivi pronti all’uso in 6 giorni, presentandosi come un metodo versatile ed economico per la generazione di rAAV negli studi preclinici.

Materials

10% povidone-iodine	Medline	MDS093943
12-well plates	Thermo Scientific	11889684
24-well plates	VWR	734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
96-well Stunner plate	Unchained Labs	701-2025	96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2	Takara	6233	For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial	Fisher Chemical	A/0360/PB17
ÄKTA pure 25	Cytiva	29018224	FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse	Invitrogen	31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC9100
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	E1014
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System	Bio-Rad Laboratories	1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody	Abcam	ab13970
Coomassie Blue G250	Fisher Chemical	C/P541/46
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Bioreagents	BP17225
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
ECF Substrate for Western Blotting	Cytiva	RPN5785
FastDigest SmaI	Thermo Scientific	FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin	FEI	Biotwin	Transmission electron microscope
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
Fluorescence mounting medium	Dako	S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid	TAAB Laboratories Equipment	F077/025
Gas evacuation apparatus	RWD	R546W
Glycerol	Fisher BioReagents	10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3	Hamilton	7803-07
Hamilton syringe (10 µL)	Hamilton	7653-01
HEK293T	American Type Culture Collection	CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL	Cytiva	17040701	Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva	17040601	Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Isoflurane	Braun	469860
Ketamine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL)	Fisher Scientific	11906965
Lunatic & Stunner Client software	Unchained Labs	N/A	Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol	Fisher Chemical	M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69)	American Research Products	03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1)	American Research Products	03-61058
Neuro2a	American Type Culture Collection	CCL-131
Normal goat serum	Gibco	16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	12738422
NZYColour Protein Marker II	NZYtech	MB09002
pAAV-CMV-scGFP	Addgene	32396	Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP	Addgene	105530	Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n	Addgene	112865	Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde	Acros Organics	10342243
PBS	Fisher BioReagents	BP2438
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x)	Gibco	24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000	Polysciences Europe	24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine – Isoflurane	RWD	N/A
Sample Inlet Valve V9-IS	Cytiva	29027746
Sample pump P9-S	Cytiva	29027745
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	Fisher Scientific	10428420
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Bioreagents	BP166
Sterile PVDF syringe filter	Fisher Scientific	15191499
Stunner Platform	Unchained Labs	700-2002	Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL	Cytiva	18-1023-85
Superloop 50 mL	Cytiva	18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells	Stratagene, Agilent Technologies	HPA200152
Treated culture dishes	Corning	734-1711
Tris base	Fisher BioReagents	BP152
Tris hydrochloride	Fisher BioReagents	BP153
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633	Invitrogen	W21404
Xylazine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi	Ibidi	80826	8-well chamber slide