Выделение костного мозга мышей у новорожденных и получение макрофагов костного мозга
Summary
Этот протокол описывает неферментативный и простой метод выделения 7-9-дневных клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов с использованием надосадочной жидкости клеток L929 в качестве источника гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Макрофаги, полученные из костного мозга, были дополнительно проанализированы на поверхностные антигены F4/80, CD206, CD11b и функциональную компетентность.
Abstract
Хорошо известны различные методы выделения костного мозга от взрослых мышей. Тем не менее, выделение костного мозга у неонатальных мышей является сложной и трудоемкой задачей, но для некоторых моделей это является трансляционно актуальным и необходимым. Этот протокол описывает эффективный и простой метод получения клеток костного мозга у 7-9-дневных щенков. Затем эти клетки могут быть дополнительно выделены или дифференцированы в конкретные типы клеток, представляющие интерес. Макрофаги являются важнейшими иммунными клетками, которые играют важную роль в воспалении и инфекции. Во время развития неонатальные макрофаги вносят значительный вклад в ремоделирование тканей. Более того, фенотип и функции неонатальных макрофагов отличаются от таковых у их взрослых собратьев. В этом протоколе также описана дифференцировка неонатальных макрофагов из выделенных клеток костного мозга в присутствии среды, кондиционированной L929. Поверхностные маркеры дифференцированных неонатальных макрофагов оценивали с помощью проточного цитометрического анализа. Для демонстрации функциональности фагоцитарная эффективность также была проверена с использованием pH-чувствительной красителя, конъюгированной с Escherichia coli.
Introduction
Костный мозг включает в себя как гемопоэтические, так и мезенхимальные популяции стволовых клеток, которые являются самовозобновляемыми и могут дифференцироваться в различные клеточные линии. Гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге дают начало миелоидным и лимфоидным линиям1. Мезенхимальные стволовые клетки продуцируют остеобласты (кости), адипоциты (жир) или хондроциты (хрящи)2. Эти клетки имеют множество применений в области клеточной биологии и тканевой инженерии, включая генную терапию 3,4. Клетки-предшественники, присутствующие в костном мозге, дифференцируются в определенные типы клеток в присутствии факторов, специфичных для линии. Эритропоэтин способствует пролиферации эритроидных клеток-предшественников, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) стимулирует рост колоний нейтрофилов, а тромбопоэтин регулирует выработку тромбоцитов в качестве нескольких примеров линейно-специфических факторов роста5. FACS, меченный антигеном на клеточной поверхности, и магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) являются хорошо зарекомендовавшими себя методами выделения и очистки специфических типов клеток, полученных из костного мозга6.
Несмотря на то, что неонатальные исследования продвигаются вперед в направлении поиска причин неонатальной смертности и устранения осложнений при преждевременных родах, прямая терапевтическая разработка остается неудовлетворенной медицинской потребностью. Смит и Дэвис утверждали: «Педиатрические пациенты остаются терапевтическими сиротами»7. Существует несколько проблем, таких как небольшие выборки, пожизненные последствия исхода и этические проблемы при получении согласия в клинических исследованиях новорожденных8. Следовательно, существует высокий спрос на модели исследований in vivo и in vitro , специфичные для новорожденных, для достижения трансляционной релевантности. Из-за сходства между анатомическим и тканевым уровнями, коротких периодов беременности и размеров помета, грызуны являются наиболее изученной модельной системой млекопитающих.
В этой статье мы опишем подробную, вполне осуществимую и воспроизводимую процедуру выделения костного мозга у 7-9-дневных детенышей мышей и их способность дифференцироваться в макрофаги. Тем не менее, разнообразие клеточных линий может быть достигнуто с помощью различных сигналов дифференцировки. Мы также демонстрируем наличие маркеров клеточной поверхности и наличие фагоцитарной активности in vitro , ожидаемой для макрофагов, полученных из костного мозга (МПМД).
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования с использованием неонатальных мышиных моделей могут быть сопряжены с рядом проблем. Новорожденные имеют развивающуюся иммунную систему, которая уникальна по сравнению со взрослыми8. Таким образом, данные, полученные на моделях взрослых животных, не должны пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01 AI163333] для CMR. Мы выражаем признательность за дополнительную финансовую поддержку, предоставленную Центру проточной цитометрии и ядра одиночных клеток Университета Западной Вирджинии в виде следующих грантов: грант WV CTSI GM104942, грант CoBRE для микроокружения опухолей GM121322 и грант NIH OD016165.
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
References
- Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
- Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
- Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
- Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
- Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
- Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
- Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), lsa.202000957 (2021).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecida de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. 196, e64566 (2023).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
- Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654 (2012).
- Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792 (2019).
- Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931 (2022).
- Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077 (2018).
- Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
- Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).
- Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages. Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
- de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).
.