Lipid hidroperoksit içeriği, ferroptotik hücre ölümünün en yaygın kullanılan göstergesini temsil eder. Bu makale, ferroptoz indüksiyonu üzerine hücrelerdeki lipid hidroperoksit içeriğinin adım adım akış sitometrisi analizini göstermektedir.
Demir ve oksijenin etkileşimi, Dünya’daki yaşamın gelişiminin ayrılmaz bir parçasıdır. Bununla birlikte, bu eşsiz kimya büyülemeye ve şaşırtmaya devam ederek yeni biyolojik girişimlere yol açıyor. 2012 yılında, bir Columbia Üniversitesi grubu, bu etkileşimi “ferroptoz” adı verilen yeni bir tür düzenlenmiş hücre ölümüne yol açan merkezi bir olay olarak kabul etti. Ferroptozun en önemli özelliği, (1) işlevsiz antioksidan savunma ve/veya (2) hücrede serbest kararsız demir içeriğinin artmasıyla çakışan ezici oksidatif strese bağlı lipid hidroperoksitlerin birikmesidir. Bu normalde sistin taşıyıcı xCT, glutatyon (GSH) ve GSH peroksidaz 4’ü (GPx4) içeren kanonik anti-ferroptotik eksen tarafından önlenir. Ferroptoz, programlanmış bir hücre ölümü türü olmadığından, apoptozun karakteristik sinyal yollarını içermez. Bu tip hücre ölümünü kanıtlamanın en yaygın yolu, bunu önlemek için lipofilik antioksidanlar (E vitamini, ferrostatin-1 vb.) kullanmaktır. Bu moleküller plazma zarındaki oksidatif hasara yaklaşabilir ve detoksifiye edebilir. Ferroptotik fenotipin ortaya çıkarılmasında bir diğer önemli husus, spesifik BODIPY C11 boyasının kullanıldığı önceki lipid hidroperoksit birikimini tespit etmektir. Bu el yazması, vahşi tip medulloblastom hücrelerinde farklı indükleyiciler kullanılarak ferroptozun nasıl indüklenebileceğini gösterecektir: erastin, RSL3 ve demir verici. Benzer şekilde, NAC varlığında büyüyen ve NAC çıkarıldıktan sonra ferroptoza uğrayan xCT-KO hücreleri kullanılacaktır. Karakteristik “köpüren” fenotip, ferroptozun tetiklendiği andan itibaren 12-16 saat içinde ışık mikroskobu altında görülebilir. Ayrıca, BODIPY C11 boyaması ve ardından PI boyama yöntemi kullanılarak lipid hidroperoksit birikimini ve bunun sonucunda hücre ölümünü göstermek için FACS analizi kullanılacaktır. Hücre ölümünün ferroptotik doğasını kanıtlamak için, ferrostatin-1 spesifik bir ferroptoz önleyici ajan olarak kullanılacaktır.
Ferroptoz, yeni bağlamsallaştırılmış, reaktif oksijen türüne (ROS) bağımlı bir hücre ölümü türüdür1. ROS’un yanı sıra, demir bu tip hücre ölümünde çok önemli bir rol oynar, bu nedenle2 adı verilir. Ferroptozun son ve yürütücü adımı, plazma zarındaki lipitlerin oksidatif hasarının demir katalizli birikimidir ve bu da sonunda zar bütünlüğünün ve seçici geçirgenliğin bozulmasına ve son olarak köpürme yoluyla hücre ölümüne yol açar. Lipid hidroperoksidasyon olayı doğal olarak meydana gelen bir olgudur; Bununla birlikte, hücre zarı boyunca yayılması, hücrenin antioksidan savunması tarafından engellenir. Bu bağlamdaki ana oyuncu, zara yaklaşabilen ve lipid hidroperoksitleri daha az toksik alkol türevlerinedönüştürebilen Se-protein glutatyon peroksidaz 4’tür (GPx4). GPx4 için indirgeme gücü, esas olarak, ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, esansiyel olmayan amino asitlerden oluşan bir tripeptit olan glutatyon (GSH) tarafından sağlanır: glisin, glutamat ve sistein. GSH’nin biyosentezi için hız sınırlayıcı amino asit sistein4’tür. Sistein, esansiyel olmayan bir amino asit olarak sınıflandırılmasına rağmen, gereksinimleri, yüksek oranda proliferatif hücrelerde (kanser hücreleri gibi) iç üretimini kolayca aşabilir. Bu nedenle yarı esansiyel amino asitler grubunda yeniden sınıflandırılmıştır. Gerekli sistein ithalatı, esas olarak, glutamat ihracatı pahasına oksitlenmiş (baskın) sistein (diğer adıyla sistin) formunun ithalatına izin veren Xc- sistemi yoluyla gerçekleşir5. Xc- sistemi, xCT olarak bilinen Na+’dan bağımsız, Cl’ye bağımlı bir taşıma alt biriminden ve CD98 olarak bilinen bir şaperon alt biriminden oluşur. Yakın zamana kadar, xCT-GSH-GPx4 ekseninin anti-ferroptotik özellikleri benzersiz ve kopyalanamaz olarak görülüyordu6. Bununla birlikte, 2019 yılında, ubikinol (Koenzim Q10) ve rejeneratif enzimi – ferroptoz baskılayıcı protein 1’den (FSP1) oluşan alternatif bir anti-ferroptotik yol tanımlanmıştır 7,8. Kısa bir süre sonra, GTP siklohidrolaz-1 / tetrahidrobiopterin (GCH1 / BH4) içeren başka bir lipid hidroperoksit detoksifiye edici sistem bildirilmiştir9. Bununla birlikte, xCT-GSH-GPx4 ekseninin ferroptozun önlenmesindeki merkezi rolü sorgulanmamış gibi görünmektedir.
Son on yılda, ferroptoz, çeşitli tümör tiplerinde kapsamlı bir şekilde incelenmiş ve bir anti-kanser stratejisi olarak büyük potansiyel göstermiştir (Lei ve ark.10 tarafından gözden geçirilmiştir). Ayrıca, konvansiyonel kemoterapötiklere karşı yüksek direnç sergileyen ve/veya metastaz yapma eğilimi gösteren kanser hücrelerinin, GPx4 11,12,13 inhibitörleri gibi ferroptoz indükleyicilerine şaşırtıcı derecede duyarlı olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, beyin tümörleri bağlamında, ferroptotik indükleyicilerin potansiyeli büyük ölçüde yeterince çalışılmamıştır. Bu tip hücre ölümü serebral iskemi-reperfüzyon hasarı14ve nörodejeneratif hastalıklar15 ile yakından ilişkili olsa da, beyin tümörleri bağlamındaki potansiyeli esas olarak en sık görülen malign kraniyoserebral tümör olan glioblastoma ile sınırlıdır (Zhuo ve ark.16 tarafından gözden geçirilmiştir). Öte yandan, en sık görülen malign pediatrik beyin tümörü ve çocukluk çağı mortalitesinin önde gelen nedenlerinden biri olan medulloblastomun ferroptoz indükleyicilerine duyarlılığı büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bildiğimiz kadarıyla, ferroptoz ve medulloblastomu birbirine bağlayan hakemli literatür azdır. Bununla birlikte, bazı çalışmalar, demirin hem medulloblastoma hem de glioblastoma kanseri kök hücrelerinin (CSC’ler) hayatta kalmasında, çoğalmasında ve tümörjenik potansiyelinde çok önemli bir rol oynadığını ortaya koymuştur17,18 ve potansiyel olarak onları ferroptoz indüksiyonuna karşı daha savunmasız hale getirir. Bu özellikle önemlidir, çünkü medulloblastom, tümör kemorezistansı, yayılması ve nüksünden büyük ölçüde sorumlu gibi görünen CSC’lerin alt popülasyonu veya tümör başlatan/yayılan hücreler ile ünlüdür19.
Ferroptoz indüksiyonuna duyarlılık tipik olarak hücre ölümüne yol açabilecek veya yol açmayacak lipid hidroperoksit içeriği/birikimi ölçülerek araştırılır. En yaygın olarak kullanılan ferroptoz indükleyicileri (1) xCT taşıyıcı20’nin bir inhibitörü olan erastin, (2) GPx4 enzimi2’nin bir inhibitörü olan RSL3 ve/veya (3) ferro-amonyum sitrat (FAC) gibi demir donörleridir.21. Lipid hidroperoksit içeriği, indirgenmiş durumda 581/591 nm’de uyarma ve emisyon maksimumlarına sahip seçici prob BODIPY 581/591 C1122 kullanılarak değerlendirilir. Lipid hidroperoksitlerle etkileşim ve oksidasyon üzerine, prob uyarma ve emisyon maksimumlarını 488/510 nm’ye kaydırır. Tipik olarak, lipid hidroperoksit içeriğinde önemli bir artış ferroptotik hücre ölümünden önce gelir. Ferroptoz programlanmış bir hücre ölümü olmadığından, yürütülmesine yol açan moleküler bir sinyal kaskadı yoktur. Bu nedenle, bunu doğrulamanın tek yolu, lipid hidroperoksit içeriğini izlemek ve bu tip hücre ölümü için ferrostatin 123 gibi spesifik inhibitörler kullanmaktır. Ferrostatin 1, hücrenin lipit bölmesine nüfuz edebilen ve lipit hidroperoksitleri detoksifiye edebilen ve böylece ferroptotik olayları önleyen lipofilik bir antioksidandır.
Ferroptotik hücre ölümünün birincil ayırt edici özelliği, plazma zarında kontrolsüz lipid hidroperoksit birikimidir. Bu oksidatif hasar, enzimatik veya enzimatik olmayan bir şekilde ortaya çıkabilir, ancak her iki durumda da reaksiyon demire bağımlı / katalizlidir, bu da bu tip hücre ölümünün adını açıklar. Lipid hidroperoksidasyonu genellikle 4-hidroksi-2,3-trans-nonenal (4-HNE) veya malonaldehit (MDA) gibi lipid hidroperoksidasyonunun bozunma ürünlerinin ölçülmesiyle dolaylı olarak tahmin…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Monako Prensliği hükümetinin yanı sıra ‘Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer’ (GEMLUC) ve BD FACS Melody satın alımı için gerekli araçları sağlayan Flavien Vakfı tarafından desteklendi.
BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
Cell counter | Beckman | Coulter Z1 | |
DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
Ferroamminium citrate | Acros Organics | 211842500 | |
Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
Fetal bovin serum (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Melody | |
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher | 11599686 | |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit | InvivoGen | rep-pt1 | |
propidium iodide | Invitrogen | P3566 | |
RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
Trypsin – EDTA 10X – 100 mL | Dominique Dutcher | X0930-100 |
.