本文描述了一种在完整卵膜内利用光片显微镜对早期斑马鱼胚胎进行成像的样品制备策略。该方法分析了胚胎在原肠胚形成70%期和胚芽期时于卵膜内所采取的不同方位，并详细阐述了如何利用光片显微系统在整个胚胎范围内获得细胞尺度分辨率的成像策略。
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本文内容
摘要
摘要
光片显微镜已成为对斑马鱼胚胎进行长时间活体成像的首选方法，具有极低的光毒性。特别是多视角系统，可通过旋转样品实现从不同角度对整个胚胎进行成像。然而，在大多数多视角系统的成像过程中，样品固定是一个繁琐的步骤，因为样品通常制备在聚合物管中。为协助完成这一过程，本实验方案描述了在70%外包层期至早期体节阶段之间对斑马鱼早期发育进行成像的基本固定策略。具体而言，本研究提供了胚胎在卵膜内处于70%外包层期和芽期时默认位置的统计信息。此外，本文讨论了在斑马鱼胚胎发育早期阶段进行全胚胎成像所需的最优角度数量及角度间隔，以便通过融合不同视角图像获取细胞尺度的信息。最后，由于胚胎占据了相机的整个视场（这是获得细胞尺度分辨率所必需的），本方案详细说明了如何利用位于胚胎上方或下方的微珠信息来实现不同视角图像之间的精确配准。
引言
在长时间对活体胚胎进行高时空分辨率成像时，确保光毒性最小化是一个主要要求。在过去十年中，光片显微镜技术已成为满足这一要求的首选方法1,2,3,4,5,6,7。简而言之，该技术最早于2004年被用于捕捉发育过程8，其原理是两束对准的薄层激光从相对两端穿过胚胎，仅照亮目标平面。检测物镜被置于正交方向，从而同时收集样品中所有被照亮点发出的荧光。通过将胚胎逐层穿过静止的光片，即可获得三维图像。
此外，在该方法的一种特定形式——多视角光片显微镜技术中，样品可悬浮于聚合物管内，并通过转子旋转，从而实现从多个角度对同一胚胎进行成像9,10,11。成像完成后，基于配准标记物将来自不同角度的图像进行融合....
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方案
本研究中使用的斑马鱼饲养和实验程序已获得机构动物伦理委员会批准，批准文号为 TIFR/IAEC/2023-1 和 TIFR/IAEC/2023-5。通过交配携带杂合基因型并表达特定标记的斑马鱼获得胚胎 Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19 在单细胞阶段注射了 H2A-mCherry mRNA（30 pg）。H2A-mCherry mRNA 使用 pCS2+ H2A-mCherry 质粒（由 EPFL 的 Oates 实验室惠赠）合成 体外 转录。在本方案其余部分中，分别将表达这两种标记物的胚胎称为 Utr-GFP 和 H2A-mCherry，并在原肠胚形成70%包被期和胚芽期进行成像。本研究中所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 多视角成像的样品制备
- 氟化乙烯丙烯/聚四氟乙烯（FEP/PTFE）管的制备
- 按照先前描述的步骤清洗FEP/PTFE管14。
- 清洗后，根据需要将管子切成2-2.5 cm的长度，并将其储存于含有双蒸水的2 mL微量离心管中。此类储存方式可维持约一个月。
- 在样品制备前，将管子在70-75 °C下加热约25分钟以使其伸直。每个微量离心管中....
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结果
以精确的方式对样本进行定位是高效使用显微成像系统的关键环节。然而，在使用多视角光片显微系统时，由于需要将样本置于管状容器中制备，通常无法手动调整样本方向。因此，为了检测胚胎在卵膜内是否存在典型的空间取向，本研究在原肠胚形成期至早期体节阶段的时间序列成像背景下，选择在原肠形成70%阶段（约受精后7小时，hpf）对斑马鱼胚胎进行成像。当在70%原肠阶段成像前立即制备样本时，胚胎在不同样本间未表现出特定的常见取向。由于这种情况通常并不理想，因此样本在原肠胚形成前较早时间即完成制备，并在适当温度下保存于微量离心管中，直至成像开始。在此条件下，在70%原肠阶段（N = 3；n = 87个胚胎），胚胎的取向可分为三类：（1）水平方向，即胚胎的动-植极（AV）轴与聚合物管的长轴垂直；（2）垂直方向，即AV轴与聚合物管的长轴平行；（3）倾斜方向，即AV轴与管长轴呈锐角（图3A）。其中，水平方向出现频率最低，而垂直方向与倾斜方向的出现频率相当（图4）。
当胚胎保留在管中时，它们在各.......
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讨论
将胚胎调整至合适的方向以观察目标区域，是成像过程中的限速步骤之一，常导致用户显微成像失败。在多视角光片显微镜中，这一问题尤为突出，因为样本被包埋在管状结构中，难以手动调整其方向。为辅助该过程，本研究报道了当含有胚胎的聚合物管直立放置于微量离心管中时，斑马鱼胚胎在卵膜内从70%外包期至早期体节阶段所呈现的各种位置的统计结果。
在70%下包阶段，垂直或水平方向的胚胎可提供整个胚胎发育事件的互补信息。水平方向便于从植物极观察动物极的细胞动态以及正在进行下包的细胞动态，而垂直方向则便于观察胚胎的背侧和腹侧，包括背侧组织中心的细胞动态、原肠作用期间细胞的内陷以及汇聚延伸流。本研究表明，如果在成像前数小时制备样品，仅凭偶然即可较大概率获得垂直方向的胚胎；然而，在这些阶段，水平方向的胚胎似乎较为少见。对于70%下包阶段之前的时期，建议用户在进行延时成像前，先记录胚胎在卵膜内的类似方向分布统计数据，因为提前掌握这些信息可从长远上节省时间。
从芽胚期开始，成像的最佳方向是将胚胎水平放置，因为这样可以沿胚胎的整个前后体轴观察细胞动态
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢Kalidas Kohale博士及其团队对鱼类养殖设施的维护，以及KV Boby对光片显微镜的维护。SRN感谢印度原子能部（DAE）政府提供的经费支持（项目编号：RTI4003，DAE文件号：1303/2/2019/R&D-II/DAE/2079，日期：2020年2月11日）、马克斯·普朗克学会伙伴小组项目（M.PG.A MOZG0010）以及科学与工程研究委员会启动研究基金（SRG/2023/001716）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低凝胶温度琼脂糖 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| 氯化钙二水合物 | Sigma-Aldrich | 12022 | |
| FIJI | 版本：ImageJ 1.54f | ||
| 荧光红色羧基化改性聚苯乙烯乳胶微球，平均粒径 0.5 μm，水悬浮液 | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| 七水合硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒 | ThermoFischer Scientific | AM1340 | 用于 H2A-mCherry 质粒的体外转录 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| PTFE 套管 AWG 15L - 内径 1.58 mm × 壁厚 0.15 mm，公差 ±0.05 | Adtech Innovations in Fluoroplastics | STW15 | PTFE 管 |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | 71640 | |
| 超声波清洗机 | Labman | LMUC3 | 超声波破碎仪 |
| Zeiss LightSheet 7 系统 | Zeiss |
参考文献
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of....
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重印与许可
