Høyoppløselig fluorespirometri for å vurdere dynamiske endringer i mitokondriemembranpotensialet i humane immunceller

Summary

Metoder for å studere mitokondriell bioenergetikk under fysiologisk relevante substratkonsentrasjoner i immunceller er begrenset. Vi gir en detaljert protokoll som bruker høyoppløselig fluorespirometri for å vurdere endringer i responsen til mitokondriemembranpotensialet på energibehov i humane T-celler, monocytter og perifere mononukleære celler.

Abstract

Perifere mononukleære celler (PBMC) viser robuste endringer i mitokondriell respirasjonskapasitet som respons på helse og sykdom. Selv om disse endringene ikke alltid gjenspeiler hva som skjer i andre vev, for eksempel skjelettmuskulatur, er disse cellene en tilgjengelig og verdifull kilde til levedyktige mitokondrier fra mennesker. PBMC-er utsettes for systemiske signaler som påvirker deres bioenergetiske tilstand. Dermed vil utvidelse av verktøyene våre for å undersøke mitokondriell metabolisme i denne populasjonen belyse mekanismer knyttet til sykdomsprogresjon. Funksjonelle analyser av mitokondrier er ofte begrenset til å bruke respirasjonsutganger etter maksimale substrat-, inhibitor- og frakoblingskonsentrasjoner for å bestemme hele spekteret av respirasjonskapasitet, som kanskje ikke er oppnåelig in vivo. Omdannelsen av adenosindifosfat (ADP) til adenosintrifosfat (ATP) av ATP-syntase resulterer i en reduksjon i mitokondrielt membranpotensial (mMP) og en økning i oksygenforbruket. For å gi en mer integrert analyse av mitokondriell dynamikk, beskriver denne artikkelen bruken av høyoppløselig fluorespirometri for å måle den samtidige responsen av oksygenforbruk og mitokondrielt membranpotensial (mMP) til fysiologisk relevante konsentrasjoner av ADP. Denne teknikken bruker tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) for å måle mMP-polarisering som respons på ADP-titreringer etter maksimal hyperpolarisering med komplekse I- og II-substrater. Denne teknikken kan brukes til å kvantifisere hvordan endringer i helsetilstand, som aldring og metabolsk sykdom, påvirker følsomheten til mitokondriell respons på energibehov i PBMC, T-celler og monocytter fra mennesker.

Introduction

En celles evne til å fungere og overleve i en periode med fysiologisk stress er i stor grad avhengig av dens evne til å møte det energetiske kravet for å gjenopprette homeostase ^1,2. Energietterspørselen stiger som svar på en rekke stimuli. For eksempel øker økt muskelsammentrekning under trening utnyttelsen av ATP og glukose av skjelettmuskulaturen, og en økning i proteinsyntese etter infeksjon øker utnyttelsen av ATP av immunceller for cytokinproduksjon og spredning 3,4,5,6. En økning i energibehovet utløser en rekke bioenergetiske prosesser for å gjenopprette ATP/ADP-forholdet. Når ATP konsumeres, stiger ADP-nivåene og stimulerer F₁F₀ ATP-syntase (kompleks V), som krever en protonmotorisk kraft for å drive dens mekaniske rotasjon og katalytiske konvertering av ADP til ATP i mitokondriet⁷. Protonkraften er en elektrokjemisk gradient skapt ved pumping av protoner under overføring av elektroner fra substrater til oksygen gjennom elektrontransportsystemet (ETS) i den indre mitokondriemembranen. Den resulterende forskjellen i protonkonsentrasjon (delta pH) og elektrisk potensial (membranpotensial) skaper protonmotorkraften som driver ATP-syntese og oksygenforbruk som svar på energibehov, reduserer ATP / ADP-forholdet eller øker ADP-nivåene. Affiniteten til mitokondrier til ADP kan bestemmes ved beregning av K_m eller EC₅₀ for ADP-stimulert respirasjon av isolerte mitokondrier eller permeabiliserte celler ^8,9. Denne metoden har vist at permeabiliserte muskelfibre fra eldre mennesker krever en større konsentrasjon av ADP for å stimulere 50 % av deres maksimale oksidative fosforyleringskapasitet enn hos yngre forsøkspersoner⁹. På samme måte krever aldrende museskjelettmuskulatur mer ADP for å senke produksjonen av mitokondrielle reaktive oksygenarter (ROS)^10,11. I tillegg reduseres ADP-følsomheten i permeabiliserte muskelfibre hos mus med diettindusert fedme i forhold til kontroller og forbedres i nærvær av insulin og etter nitratforbruk ^12,13. Dermed varierer mitokondrienes kapasitet til å reagere på energibehov under forskjellige fysiologiske forhold, men dette har ikke tidligere blitt utforsket i sammenheng med immunceller.

Perifere mononukleære blodceller (PBMC) brukes ofte til å undersøke cellulær bioenergetik hos mennesker 14,15,16,17,18,19,20. Dette skyldes i stor grad at celler er lett tilgjengelige fra ukoagulerte blodprøver i kliniske studier, cellenes respons på metabolske forstyrrelser, og metodene utviklet av ulike grupper for å undersøke mitokondriell metabolisme ved å bruke hemmere og frakoblere for å bestemme den maksimale og minimale kapasiteten til mitokondriell respirasjon^21,22. Disse metodene har ført til en forståelse av rollene til bioenergetisk i aldring, metabolsk sykdom og immunfunksjon 14,20,23,24. Mitokondriell respirasjonskapasitet er ofte redusert i skjelettmuskulatur og PBMC under tilstander med hjertesvikt^18,25. PBMC bioenergetikk er også korrelert med kardiometabolske risikofaktorer hos friske voksne¹⁷ og reagerer på behandlinger som nikotinamidribosid¹⁸. PBMC-er inkluderer nøytrofiler, lymfocytter (B-celler og T-celler), monocytter, naturlige drepeceller og dendrittiske celler, som alle bidrar til PBMC-mitokondriell kapasitet 26,27,28. I tillegg spiller cellulær bioenergetikk en avgjørende rolle i immuncelleaktivering, spredning og fornyelse²³. En begrensning ved disse metodene er imidlertid at cellene ikke fungerer under et fysiologisk utvalg av substrater. Ytterligere metoder er derfor nødvendig for å undersøke mitokondriell funksjon i substratkonsentrasjoner som er mer relevante for hva celler opplever in vivo.

Mitokondrielt membranpotensial (mMP) er hovedkomponenten i en protonmotorisk kraft og er avgjørende for en rekke mitokondrielle prosesser utover ATP-produksjon, for eksempel regulering av respirasjonsfluks, reaktiv oksygenartsproduksjon, protein- og ioneimport, autofagi og apoptose. mMP kan vurderes med elektrokjemiske sonder eller fluorescerende fargestoffer som er følsomme for endringer i membranpolarisering som JC-1, Rhod123, DiOC₆, tetrametylrhodamin (TMRE) eller metylester (TMRM) og safranin. De to sistnevnte er lipofile kationiske fargestoffer som har blitt brukt med suksess i høyoppløselig fluorespirometri av vevshomogenater, isolerte mitokondrier og permeabilisert vev 11,29,30,31,32,33. I denne teknikken brukes TMRM i quench-modus, hvor celler utsettes for en høy konsentrasjon av TMRM som akkumuleres i mitokondriematrisen når den polariseres (høy mMP og protonmotorisk kraft), noe som resulterer i slukking av cytosolisk TMRM-fluorescens. Når mitokondrier depolariserer som respons på ADP eller frakoblinger, frigjøres fargestoffet fra matrisen, noe som øker TMRM-fluorescerende signal^34,35. Hensikten med denne metoden er å samtidig måle endringer i mitokondriell respirasjon og mMP som respons på ADP-titreringer i humane avledede PBMC-er, sirkulerende monocytter og T-celler, og den kan også brukes på milt-T-celler fra mus.

Protocol

Innsamlingen av blodprøver for data- og metodeutvikling presentert her ble godkjent av Internal Review Board ved University of Washington. Representative resultater inkluderer også data fra mannlige C57BL/6J-mus (5-7 måneder gamle) kjøpt fra Jackson Laboratories. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av University of Washington Office of Animal Welfare. Protokolloversikten er avbildet i figur 1. Reagensforberedelse for denne protokollen finner du i tilleggsfil 1. Figur 1: Oversikt over protokollen. Arbeidsflyt ved bruk av høyoppløselig fluorespirometri for å vurdere endringer i mitokondriemembranpotensial i isolerte monocytter (CD14+) og T-celler (CD3+) fra ferske humane blodprøver. Forkortelser: TMRM, tetrametylrhodaminmetylester; SUIT, substrate-uncoupler-inhibitor titreringer; ADP, adenosindifosfat; Dig, digitonin; Mal, malat; Pyr, pyruvat; Glut, glutamat; D1-10, 10 påfølgende ADP-titreringer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 1. Separasjon av buffy coat fra fullblod MERK: Celleisolasjon er modifisert fra Kramer et al.27. La RPMI, tetthetsgradient og sentrifuge nå romtemperatur. Steriliser biosikkerhetsskapet og materialene før du starter. Samle venøst blod i tre 10 ml K2EDTA-rør. Snu rørene minst 3 ganger. Sentrifuger rørene ved 500 x g 10 min (22 °C, 9 akselerasjon [acc], 2 retardasjon [des]). Fjern 1 ml plasma fra hvert rør og oppbevar ved -80 °C for fremtidige analyser. Overfør plasmaet og halvparten av laget av røde blodlegemer fra hvert rør til et enkelt 50 ml konisk rør. Legg til RPMI opp til 40 ml-merket. Inverter minst 3 ganger. Legg sakte 10 ml av plasmaløsningen i fire 15 ml koniske rør som inneholder 3 ml av tetthetsgradienten. Sentrifuger ved 700 x g i 30 minutter (22 °C, 5 acc, 2 des). Samle alt plasma og buffy coat som inneholder de perifere mononukleære cellene (PBMC) uten å forstyrre de røde blodcellene. Sentrifuger ved 500 x g i 10 minutter (22 °C, 5 acc, 5 des) og aspirer supernatanten. Vask PBMC-pelleten 1x-2x ved å gjensuspendere den i 10 ml RPMI og sentrifugere ved 500 x g i 10 minutter (22 °C, 5 acc, 5 des). 2. Magnetisk separasjon av CD14+ og CD3+ celler Plasser en søyle i magnetfeltet til en magnetisk celleseparator (se materialfortegnelsen). Vask kolonnen med 3 ml RP-5. Resuspender PBMC-pelleten i 80 μL RP-5 og 20 μL anti-CD14-mikroperler (se materialtabellen). Inkuber i 15 minutter ved 4 °C. Suspender cellene på nytt med 1 ml RP-5 og legg suspensjonen på kolonnen. Samle umerkede celler som strømmer gjennom i et 15 ml konisk rør merket “Gjennomstrømning 1”. Vent til all cellesuspensjon har gått gjennom kolonnen, og fortsett deretter å vaske med 3 ml RP-5 3x, og samle opp all gjennomstrømning. Fjern søylen forsiktig fra magnetfeltet og plasser den på et nytt 15 ml konisk rør. Tilsett 5 ml RP-5 og bruk stempelet umiddelbart til å rense kolonneinnholdet i et oppsamlingsrør merket “CD14+”. Sentrifuger “Gjennomstrømning 1” ved 500 x g i 10 minutter (22 °C, 5 acc, 5 des) og aspirer supernatanten. Bruk celler fra gjennomstrømning 1, gjenta trinn 2.2-2.5 ved å bruke anti-CD3-mikroperler (se materialtabellen) for å isolere T-celler. Sentrifugerør som inneholder T-celler (CD3+) og monocytter (CD14+) ved 300 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og suspender pelleten på nytt i 1 ml RP-5. Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller.NOTAT: Celler kan telles ved å tilsette 10 μL av en cellefortynning på 1:10 eller 1:20 til et hemocytometer. Man kan referere til tidligere publiserte protokoller for å telle celler ved hjelp av et hemocytometer36. Pipetter 2,5 millioner monocytter eller 5 millioner T-celler inn i et nytt sentrifugerør. Sentrifuger i 30 s ved 2000 x g, aspirer supernatanten og resuspender cellene i MiR05 for et totalt volum på 20 μL og sluttkonsentrasjon på 125 millioner monocytter eller 250 millioner T-celler per ml.MERK: Den endelige konsentrasjonen ble valgt for å injisere 2,5 millioner monocytter eller 5 millioner T-celler i et volum på 20 μL. Muse-T-celler isolert fra milten har også blitt testet ved hjelp av denne metoden. Fremgangsmåten finnes i tilleggsfil 1. 3. Høyoppløselig fluorespirometri – Oksygen- og TMRM-fluorescenskalibrering MERK: Denne metoden ble tilpasset fra tidligere arbeid gjort på permeabiliserte fibre av Pharaoh et al.11. En høy, ikke-hemmende konsentrasjon av TMRM brukes til quench-modus, hvor forholdet mellom mMP og TMRM-konsentrasjon i matrisen er invertert. Dermed fører en reduksjon i mMP til frigjøring av TMRM-fargestoff fra matrisen og en økning i fluorescens32. Installer 0.5 ml kamre i O2K-respirometeret i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialtabell). Slå på instrumentet og koble det til programvaren levert av produsenten for datainnsamling. Juster temperaturen til 37 °C og rørehastigheten til 750 rpm. Vask kamrene med destillert vann 3x. Bytt ut vann med 0.54 ml Mir05, lukk proppene helt, og fjern overflødig buffer med det integrerte sugesystemet (ISS). Hev proppene for å la oksygen i rommet komme i likevekt med oksygen i kammeret ved hjelp av et stopper-avstandsstykke. Når oksygenfluksen er stabil, utfør luftoksygenkalibreringen (R1) i henhold til produsentens instruksjoner.NOTAT: Det kan ta >30 minutter før oksygenfluksen stabiliserer seg. Oksygensensorer krever bestemmelse av nullpunktsoksygen (R0) og bakgrunnsoksygenfluks fra 50-200 μM fra separate eksperimenter ved bruk av ditionittitreringer. Spesifikke metoder finner du i produsentens håndbok. Forsegl kammeret ved å lukke proppene.MERK: I motsetning til eksperimenter med permeabiliserte fibre, krever ikke kamrene hyperoksygenering for PBMCs. Forsegling av kammeret etter R1-kalibrering gir tilstrekkelig oksygen til eksperimentet. Oksygennivået bør holdes mellom 50-250 μM. Hvis oksygenkonsentrasjonen faller under terskelen, kan kammeret åpnes delvis slik at kammeroksygen kan komme i likevekt med oksygen i romluft. TMRM-kalibreringBruk de grønne LED-fluosensorene (f.eks. 525 nm) med AmR-filtersettet (se materialtabellen). Sett fluorometerforsterkning til 1000 og intensitet til 1000. Slå på fluo-sensorene og begynn å registrere grunnlinjen. Injiser 2.5 μL 0.05 mM TMRM og la signalet stabilisere seg (~2 min) før neste 2.5 μL injeksjon til totalt 4 injeksjoner er utført for en total TMRM-konsentrasjon på 1 μM TMRM i kammeret. Bruk en Hamilton-sprøyte til alle injeksjoner. Kalibrer fluo-sensoren ved å velge fluorescerende signal (voltage) for hver injeksjon som representerer 0, 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 μM TMRM for en fempunkts kalibrering. 4. Protokoll for substrat-avkobling-inhibitor (SUIT) MERK: Kjør blanke eksperimenter der 20 μL Mir05 injiseres i kammeret i stedet for 20 μL cellesuspensjon, da TMRM-signalet vil endre seg som respons på injeksjoner alene (diskutert i representative resultater). La oksygenflukssignalet stabilisere seg (ca. 2-3 minutter) før neste injeksjon for både blind- og prøveeksperimenter. Følgende titreringsprotokoll og forventede observasjoner er i tabell 1. Når oksygenfluksen er stabil, velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet “pre-cell”. Injiser cellesuspensjonen som inneholder enten 5 millioner T-celler eller 2,5 millioner monocytter i ~20 μL og mål i ca. 10 minutter. Velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet som “Celle”. Permeabiliser celler ved å injisere 2 μL 1 mg/ml digitonin (sluttkonsentrasjon: 4 μg/ml). Vent i 20 min. Velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet som “Dig”.MERK: Det foreslås å optimalisere digitoninkonsentrasjonen i separate eksperimenter. Tilsett 2,5 μL 1 M succinat (endelig konsentrasjon: 5 mM). Velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet som “SUCC”. Når oksygenfluksen er stabil, tilsett 5 μL 100 mM malat (sluttkonsentrasjon: 1,0 mM), 5 μL 1 M glutamat (sluttkonsentrasjon: 10 mM) og 5 μL 500 mM pyruvat (sluttkonsentrasjon: 5 mM). Velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet som “MPG”. Når oksygenfluksen er stabil, titrer ADP. Velg hastigheter for hver titrering og merk dem “D” sekvensielt 1 til 10, avhengig av antall titreringer. Bruk titreringsskjemaet i tabell 2. Når oksygenfluksen er stabil, utfør en serie 1 μL titreringer av 0,25 mM karbonylcyanid p- (tri-flurometoksy) fenylhydrazon (FCCP) til det fluorescerende signalet når sitt maksimum. Velg og merk både oksygenfluksen og TMRM-signalet som representerer minimum membranpotensial og merk det “FCCP”.NOTAT: FCCP-konsentrasjon på 0,5-1,0 μM er vanligvis nødvendig for å tømme mitokondriemembranpotensialet.FORSIKTIG: FCCP er giftig. Se sikkerhetsdatabladet (SDS) for riktig håndtering. VALGFRITT: Når oksygenfluksen er stabil, injiser 1 μL 0,25 mM rotenon for å hemme kompleks I og bestemme respirasjonskapasiteten gjennom kompleks II.MERK: Endringer i membranpotensial er ikke lenger relevante etter titrering med frakobling.FORSIKTIG: Rotenon er giftig. Se sikkerhetsdatabladet for riktig håndtering. Når oksygenfluksen er stabil, injiser 1 μL 1,25 mM (sluttkonsentrasjon: 2,5 μM) Antimycin A for å hemme mitokondriell respirasjon.FORSIKTIG: Antimycin A er giftig. Se sikkerhetsdatabladet for riktig håndtering. 5. Beregning av mitokondriemembranpotensial og analyse Bruk blanke eksperimenter, registrer de kalibrerte TMRM-verdiene (mikromolar TMRM) før injeksjonen av blindprøven (“pre-sample”) og for hver av injeksjonene. Se figur 2. For hvert blankeksperiment beregner du bakgrunnsforholdet ved å sette “pre-sample” TMRM-konsentrasjonen til 1.0. Beregn den påfølgende proporsjonale reduksjonen i TMRM. Beregn gjennomsnittlig bakgrunnsforhold fra alle tomme eksperimenter.MERK: Antall tomme eksperimenter som skal inkluderes kan avhenge av instrumentets presisjon. Se beregningseksemplet i tabell 3 fra fem ulike blankeksperimenter, der standardavviket for gjennomsnittlig bakgrunnsforhold falt mellom 0 og 0,016 for hver titrering. Bakgrunnsberegning: Beregn bakgrunnen for hvert prøveeksperiment ved å multiplisere “pre-sample” TMRM for prøveeksperimentet ganger gjennomsnittlig bakgrunnsforhold for hver injeksjon. Se beregningseksemplet i tabell 3. Bakgrunnskorreksjon: Trekk eksperimentets bakgrunn fra de målte TMRM-verdiene til prøven. Se beregningseksemplet i tabell 4. FCCP-korreksjon: Trekk den FCCP-bakgrunnskorrigerte mMP fra hver injeksjon. Se beregningseksemplet i tabell 4. ADP-følsomhetskurve: Normaliser den ADP-drevne reduksjonen i mMP ved å sette det høyeste og laveste membranpotensialet til henholdsvis 100 % og 0 %, ved å bruke mMP-verdiene samlet inn gjennom ADP-titreringen. Tilpass dataene inn i en ikke-lineær tilpasningsregresjonsmodell ved å bruke den foretrukne statistiske programvaren for å beregne den halvmaksimale hemmende konsentrasjonen (IC50) av ADP på mMP.MERK: Kurven passer til [Inhibitor] vs. normalisert respons – variabel helning i Prisme. Figur 2: Beregning av mitokondrielt membranpotensial (mMP) og ADP-sensitivitet fra TMRM-fluorescens. Trinn for å beregne mitokondrielt membranpotensial (mMP) og ADP-sensitivitet fra målinger av TMRM-fluorescens ved høyoppløselig fluorespirometri av en prøve av T-celler (n = 1). Trinn 1: TMRM-fluorescens måles i blankprøver som gjort i den biologiske prøven. Trinn 2: Bestem forholdet i TMRM-signalet med hver titrering i forhold til signalet før sample for hvert blankeksperiment. Beregn gjennomsnittet for hver titrering av alle blindforsøk. Trinn 3: Beregn bakgrunnen for hvert prøveeksperiment ved å multiplisere “pre-sample”-fluorescensen med gjennomsnittlig bakgrunnsforhold for hver titrering. Trinn 4: Beregn forskjellen mellom bakgrunns- og sample TMRM-fluorescens for hver titrering for å uttrykke data som mMP eller mitokondrielt TMRM-opptak. Trinn 5: Korriger mMP slik at full frakobling med FCCP reflekterer null mMP. Trinn 6: Utfør ikke-lineær regresjon til grafendringer i mMP med økende ADP-konsentrasjoner. Målinger ble utført i 0,5 ml kamre, ett inneholdt 5 millioner T-celler fra en frisk frivillig. Gjennomsnittlige data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. Enkeltdatapunkter for en enkelt replikat uttrykkes uten feilstolper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

For å illustrere forskjellene i optimal cellekonsentrasjon for analysen, ble 5 millioner T-celler lastet inn i ett 0,5 ml kammer (10 millioner celler/ml), og 1,25 millioner celler ble lastet inn i et annet kammer (2,5 millioner celler/ml) som inneholdt 1 μM TMRM (figur 3A-G). Tre blanke eksperimenter ble også inkludert for å beregne TMRM-bakgrunnen. Vi fant at en høyere konsentrasjon av T-celler resulterte i en mer tydelig endring i TMRM-fluorescens i forhold til bakgrunnen (figur 3B,D). I tillegg tillot en høyere cellekonsentrasjon oss å oppdage den forventede økningen i oksygenforbruk og samtidig uttømming av mMP som respons på tilsetning av FCCP (figur 3E,F). Bruk av en lav konsentrasjon av celler ga en svak endring i fluorescens som gikk parallelt med bakgrunnen. Siden beregningen av mMP trekker bakgrunnen fra signalet, tillater ikke en lav cellekonsentrasjon bestemmelse av endringer i mMP som respons på substrater og frakoblinger. I tillegg til å bruke de høyere konsentrasjonene av celler i denne analysen, anbefaler vi å holde cellekonsentrasjonen konstant for hver celletype mellom eksperimentene. For å validere påvirkningen av ATP-syntase i spredningen av mMP med ADP-titreringer, kjørte vi parallelle eksperimenter på PBMC og T-celler der ett kammer mottok oligomycin før ADP-titrering (figur 4). Vi fant ingen spredning av mMP som respons på ADP i celler behandlet med oligomycin, noe som tyder på at den gradvise reduksjonen i mMP med ADP er et resultat av protonfluks gjennom ATP-syntase (figur 4A-F). Vi sammenlignet også ADP-sensitiviteten mellom T-celler og PBMC hos samme deltaker og fant at ADP-sensitiviteten var lavere (høyere EC50) i T-cellefraksjonen (figur 4G,H). Vi gjennomførte en serie blanke eksperimenter for å bestemme påvirkningen av tid eller SUIT-protokollen på TMRM-fluorescens. Vi fant at TMRM-signalet i blanke eksperimenter for det meste er påvirket av SUIT-titreringer (figur 5A) i motsetning til tidspunktet for titreringene (figur 5B). Vi sammenlignet ADP-drevne endringer i oksygenforbruksrater (OCR) og i mMP i T-celler og monocytter fra 11 friske, hjemmeboende frivillige (figur 6A-H). I likhet med resultatene fra tidligere publiserte eksperimenter ved bruk av ekstracellulær fluks og enzymatiske analyser, viste monocytter en større mitokondriell respirasjonskapasitet enn lymfocytter26,27 (figur 6A,H). Vi påviste imidlertid ikke en typisk dose-respons-økning i OCR med ADP i noen av celletypene (figur 6C,D), i motsetning til hva denne metoden viser ved bruk av sterkt metabolsk vev som muselever (figur 7A-H). På den annen side tillot bruken av TMRM oss å oppdage en gradvis nedgang i mMP med ADP i humane immunceller (figur 6E-G) og i milt-T-celler fra mus (figur 7E-H). Selv om vi ikke direkte sammenlignet T-celler fra mennesker og mus ved hjelp av samme titreringsprotokoll, fant vi at IC50 for muse-T-celler var lavere med en faktor på 10 sammenlignet med sirkulerende T-celler fra mennesker. Figur 3: Høyoppløselige fluorespirometrieksperimenter. (A-D) Spor av høyoppløselige fluorespirometrieksperimenter ved bruk av T-cellekonsentrasjoner på 10 millioner celler/ml og 2,5 millioner celler/ml i 0,5 ml kamre. (A) 10 millioner celler/ml i 0,5 ml kamre. (C) 2,5 millioner celler/ml i 0,5 ml kamre. Oksygenfluks (pmol/s/ml) vises i topppanelet (rødt), og det kalibrerte TMRM-signalet vises i bunnpanelet (svart). Endringer i TMRM gjennom hele SUIT for prøven og dens beregnede bakgrunn ble plottet for kamrene som inneholdt (B) 10 millioner celler/ml og (D) 2,5 millioner celler/ml. (E) For hver cellekonsentrasjon ble oksygenfluks (pmol/s/million celler) og (F) mitokondriemembranpotensial beregnet. (G) ADP-følsomhetskurven ble plottet og tilpasset en ikke-lineær regresjonsmodell (heltrukne linjer). Forkortelser: mMP, mitokondrielt membranpotensial; TMRM, tetrametylrhodamin metylester; SUIT, substrate-uncoupler-inhibitor titreringer; ADP, adenosindifosfat; Dig, digitonin; Mal, malat; Pyr, pyruvat; Glut, glutamat; D1-11, 11 påfølgende ADP-titreringer; U, frakobling FCCP på 0,5 og 1,0 μM; AMA, antimycin A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: ATP-syntase driver ADP-drevet reduksjon i membranpotensial i T-celler og PBMC. (AH) Protokollen beskrevet her ble testet i PBMC og T-celler. To O2K-kamre ble injisert med PBMC-er, og to kamre med en ekstra O2K ble injisert med T-celler fra samme deltaker. Etter å ha injisert substrater malat, pyruvat og glutamat i alle kamre, fikk ett kammer med PBMC og T-celler oligomycin. Oligomycin forhindret enhver ADP-drevet økning i respirasjon i (A) PBMC og (D) T-celler eller nedgang i mitokondrielt membranpotensial i (B,C) PBMC og (E,F) T-celler. (G,H) ADP-følsomheten var større i PBMC sammenlignet med T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 5: Blanke eksperimenter viser endringen i TMRM-fluorescens som respons på tid og titreringer av substrater, frakoblinger og hemmere (SUIT). (A) Endring i TMRM-fluorescens som respons på titrering. (B) Endring i TMRM-fluorescens som respons på tid. Eksperimenter ble utført i 0,5 ml kamre fylt med Mir05 inneholdende 1 μM TMRM. Ett kammer mottok ingen SUIT-titreringer (ingen injeksjon); to kamre i to forskjellige instrumenter mottok en standard draktprotokoll (standard injeksjon); ett kammer fikk de samme SUIT-titreringene, men med en forsinkelse mellom hver injeksjon (forsinket injeksjon). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 6: Forskjeller i ADP-følsomhet mellom T-celler og monocytter ved bruk av OCR og mMP. (A) Spor av høyoppløselig fluorespirometrieksperiment fra et forsøkspersons monocytt- og T-celleprøve. (B) Oksygenforbruk i monocytter (n= 11) og T-celler (n= 13) fra blodet til friske frivillige. (C,D) Ikke-lineær regresjonstilpasning av den plottede respirasjonsøkningen med ADP-titreringer for å beregne en EC50. (E) Samtidig måling av mitokondrielt membranpotensial. (F,G) Ikke-lineær regresjonstilpasning av den plottede nedgangen i mitokondrielt membranpotensial med ADP-titreringer for å beregne en IC50. (H) Parametere for respirasjonskapasitet for monocytter og T-celler. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM for linjediagrammer og gjennomsnitt ± SD for søylediagrammer. Statistisk signifikante forskjeller etter t-tester uttrykkes som *p < 0,05. **p < 0,01, og ****p < for 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 7: Sammenligning av ADP-respons i respirasjon og mitokondrielt membranpotensial (mMP) i permeabiliserte T-celler av musemilt og lever. (E-H) Respons i mMP i permeabiliserte milt-T-celler fra mus og lever. Fersk lever og milt ble dissekert fra tre mus etter cervikal luksasjon. Miltpan-T-celler ble isolert ved bruk av antistoffkonjugert magnetisk perleseparasjon. Begge prøvene gjennomgikk samme SUIT-protokoll i nærvær av 1 μM TMRM. (I,J) Sammenligning av EC50 beregnet fra økningen i oksygenforbruk (OCR) og IC50 fra reduksjonen i mMP som respons på ADP. N = 3 per gruppe. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tabell 1: Eksempel på SUIT-protokoll for å vurdere mitokondrielt membranpotensial i nyisolerte T-celler og monocytter ved bruk av 0,5 ml-kamrene. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 2: Anbefalt ADP-titrering for 0,5 ml kammer. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 3: Beregning av gjennomsnittlig bakgrunnsforhold ved hjelp av fem uavhengige blanke eksperimenter. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tabell 4: Beregning av mitokondrielt membranpotensial (mMP) fra prøveeksperiment. Klikk her for å laste ned denne tabellen. Tilleggsfigur 1: Effekt av Mir05 og DMSO på mitokondriell respirasjon og membranpotensial. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfil 1: Reagensforberedelse og protokoll for isolering av T-celler fra musemilten. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne protokollen bruker høyoppløselig fluorespirometri for å måle følsomheten til mitokondriell respons på energibehov ved å måle spredningen av mMP som respons på økende nivåer av ADP i PBMC, monocytter og T-celler. Dette gjøres ved å tilsette komplekse I- og II-substrater for å maksimere mitokondriemembranpotensialet og titrere ADP for gradvis å stimulere ATP-syntase til å bruke protongradienten for ATP-generering.

Kritiske trinn i protokollen inkluderer å sette forsterkningen og intensiteten til fluoroforen til 1000 og sørge for at et TMRM-fluorescerende signal innhentes under TMRM-titreringen. Fordi TMRM-fluorescens avtar etter hver titrering (en begrensning ved denne metoden), er det viktig å kjøre bakgrunnseksperimenter med blankprøver. Vi har også funnet at DMSO har en hemmende effekt på mitokondriell respirasjon og membranpotensial og anbefaler derfor å fortynne arbeidsløsningen av TMRM i Mir05 (tilleggsfigur 1).

Noen modifikasjoner som kan brukes når du prøver denne protokollen, er å justere cellekonsentrasjoner og bruke standard 2 ml-kammeret. Imidlertid foretrekkes 0,5 ml-kammeret for T-celler og monocytter på grunn av den høye konsentrasjonen av celler som trengs for optimal respons i membranpotensial og oksygenfluks. En lavere konsentrasjon av celler kan være optimal når du tester celler med større respirasjonskapasitet, som makrofager.

Ytterligere begrensninger ved metoden som presenteres her inkluderer kravet om minst 5 millioner T-celler og 2,5 millioner monocytter. Vi kan ofte få nok celler fra ~20 ml blod fra friske deltakere, men disse tallene kan variere etter helsetilstand, alder og kjønn²⁶. I tillegg, som i de fleste metoder som vurderer mitokondriell kapasitet, må cellene være nyisolerte. Imidlertid kan denne metoden prøves i kryokonserverte celler i fremtiden. Sammenlignet med utbyttet fra humant blod, er T-celleutbyttet fra milten til friske mus høyt nok til å utføre denne analysen.

Sirkulerende T-celler, spesielt langlivet minne_(TM) og regulatoriske (Treg) celler, er avhengige av oksidativ fosforylering for energi³⁷. Mens deres energibehov og oksygenforbruk er lavt (f.eks. sammenlignet med hvilende muskler), er deres overlevelse avgjørende for en effektiv immunrespons mot reinfeksjon og kreft 38,39,40. En reduksjon i T-celle oksidativ fosforylering resulterer i nedsatt proliferativ kapasitet og fremmer T-celleutmattelse og aldring ^5,41. I tillegg fremmer mitokondriell hyperpolarisering en vedvarende produksjon av cytokiner (IL-4 og IL-21) av effektor CD4 T-celler under aktivering⁴². Ved infeksjon kan energibehovet for aktivering og spredning av immunceller være så høyt som 25%-30% av den basale metabolske hastigheten⁴³. Derfor fungerer immunceller i et bredt og ekstremt spekter av energibehov, og denne protokollen kan teste mitokondrielle responser innenfor dette området.

Kronisk betennelse er et vanlig trekk ved fedme, diabetes og aldring. Dysregulerte nivåer av sirkulerende hormoner, lipider og glukose har systemiske effekter og kan dermed påvirke hvordan mitokondrier reagerer på en energisk utfordring. Her har vi presentert en metode for å vurdere mitokondriell ADP-sensitivitet i sirkulerende PBMC. Ytterligere studier er nødvendig for å finne ut hvordan ADP-følsomhet kan moduleres ved metabolsk sykdom og hvordan det påvirker helsetilstanden.

Materials

Adenosine Diphosphate	Sigma-Aldrich	A5285	Fluorespirometry
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003	Mir05 buffer
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A6003	Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	Fluorespirometry
Cell strainers	Fisher Scientific	22-363-548	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	Cell isolation
CD3 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-101	Cell isolation
DatLab	Oroboros	Version 8
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141	Fluorespirometry
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	84097	Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	Mir05 buffer
Filter Set AmR	Oroboros	44321-01
HBSS (10x)	Gibco	12060-040
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7523	Mir05 buffer
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Cell isolation
K2EDTA blood collection tubes	BD Vacutainer	366643	Cell isolation
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	153516	Mir05 buffer
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1626	Fluorespirometry
L-Malic Acid	Sigma-Aldrich	M1000	Fluorespirometry
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M9272	Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-301	Cell isolation
O2k-Fluo Smart-Module	Oroboros	12100-03
O2k-FluoRespirometer series J	Oroboros	10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber)	Oroboros	11200-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	04876	Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi	130095130	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	221473	Mir05 buffer
Prism	GraphPad	Version 10
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Fluorespirometry
RPMI Buffer	Corning	17-105-CV	Cell isolation
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Fluorespirometry
Succinate disodium salt	Sigma-Aldrich	S2378	Fluorespirometry
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite	Sigma-Aldrich	T5428	Fluorespirometry