Fluorespirometrie met hoge resolutie om dynamische veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke immuuncellen te beoordelen

Summary

Methoden voor het bestuderen van mitochondriale bio-energetica onder fysiologisch relevante substraatconcentraties in immuuncellen zijn beperkt. We bieden een gedetailleerd protocol dat gebruik maakt van fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in de reactie van het mitochondriale membraanpotentieel op de energievraag in menselijke T-cellen, monocyten en perifere mononucleaire cellen te beoordelen.

Abstract

Perifere mononucleaire cellen (PBMC’s) vertonen robuuste veranderingen in de mitochondriale ademhalingscapaciteit als reactie op gezondheid en ziekte. Hoewel deze veranderingen niet altijd weerspiegelen wat er in andere weefsels gebeurt, zoals skeletspieren, zijn deze cellen een toegankelijke en waardevolle bron van levensvatbare mitochondriën van menselijke proefpersonen. PBMC’s worden blootgesteld aan systemische signalen die hun bio-energetische toestand beïnvloeden. Het uitbreiden van onze instrumenten om het mitochondriale metabolisme in deze populatie te ondervragen, zal dus mechanismen ophelderen die verband houden met ziekteprogressie. Functionele tests van mitochondriën zijn vaak beperkt tot het gebruik van ademhalingsoutput volgens maximale substraat-, remmer- en ontkoppelingsconcentraties om het volledige bereik van de ademhalingscapaciteit te bepalen, wat mogelijk niet haalbaar is in vivo. De omzetting van adenosinedifosfaat (ADP) naar adenosinetrifosfaat (ATP) door ATP-synthase resulteert in een afname van het mitochondriale membraanpotentiaal (mMP) en een toename van het zuurstofverbruik. Om een meer geïntegreerde analyse van de mitochondriale dynamiek te bieden, beschrijft dit artikel het gebruik van fluorespirometrie met hoge resolutie om de gelijktijdige respons van zuurstofverbruik en mitochondriaal membraanpotentiaal (mMP) op fysiologisch relevante concentraties van ADP te meten. Deze techniek maakt gebruik van tetramethylrhodaminemethylester (TMRM) om mMP-polarisatie te meten als reactie op ADP-titraties na maximale hyperpolarisatie met complexe I- en II-substraten. Deze techniek kan worden gebruikt om te kwantificeren hoe veranderingen in de gezondheidstoestand, zoals veroudering en stofwisselingsziekten, de gevoeligheid van de mitochondriale respons op de energievraag in PBMC’s, T-cellen en monocyten van menselijke proefpersonen beïnvloeden.

Introduction

Het vermogen van een cel om te functioneren en te overleven in een periode van fysiologische stress is grotendeels afhankelijk van zijn vermogen om te voldoen aan de energetische behoefte om de homeostase te herstellen ^1,2. De vraag naar energie stijgt als reactie op een verscheidenheid aan stimuli. Bijvoorbeeld, verhoogde spiercontractie tijdens inspanning verhoogt het gebruik van ATP en glucose door skeletspieren, en een toename van de eiwitsynthese na infectie verhoogt het gebruik van ATP door immuuncellen voor de productie en proliferatie van cytokines 3,4,5,6. Een piek in de vraag naar energie zet een reeks bio-energetische processen in gang om de ATP/ADP-verhouding te herstellen. Naarmate ATP wordt verbruikt, stijgen de ADP-niveaus en stimuleren F₁F₀ ATP-synthase (complex V), waarvoor een protonaandrijfkracht nodig is om de mechanische rotatie en katalytische omzetting van ADP naar ATP binnen het mitochondrion⁷ aan te drijven. De protonaandrijfkracht is een elektrochemische gradiënt die ontstaat door het pompen van protonen tijdens de overdracht van elektronen van substraten naar zuurstof via het elektronentransportsysteem (ETS) in het binnenste mitochondriale membraan. Het resulterende verschil in protonenconcentratie (delta-pH) en elektrisch potentiaal (membraanpotentiaal) creëert de protonaandrijfkracht die de ATP-synthese en het zuurstofverbruik aandrijft als reactie op de energievraag, waardoor de ATP/ADP-verhouding wordt verlaagd of de ADP-niveaus worden verhoogd. De affiniteit van mitochondriën voor ADP kan worden bepaald door de berekening van de K_m of EC₅₀ van ADP-gestimuleerde ademhaling van geïsoleerde mitochondriën of gepermeabiliseerde cellen ^8,9. Deze methode heeft aangetoond dat gepermeabiliseerde spiervezels van oudere mensen een grotere concentratie ADP nodig hebben om 50% van hun maximale oxidatieve fosforyleringscapaciteit te stimuleren dan die van jongere proefpersonen⁹. Evenzo vereist veroudering van de skeletspier van muizen meer ADP om de productie van mitochondriale reactieve zuurstofsoorten (ROS) te ^{verlagen10,11}. Bovendien is de ADP-gevoeligheid verminderd in gepermeabiliseerde spiervezels van muizen met door voeding geïnduceerde obesitas in vergelijking met controles en wordt deze versterkt in aanwezigheid van insuline en na nitraatconsumptie^12,13. Het vermogen van mitochondriën om te reageren op de energievraag varieert dus onder verschillende fysiologische omstandigheden, maar dit is nog niet eerder onderzocht in de context van immuuncellen.

Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) worden vaak gebruikt om cellulaire bio-energetica bij menselijke proefpersonen te onderzoeken 14,15,16,17,18,19,20. Dit is grotendeels te danken aan het feit dat cellen gemakkelijk kunnen worden verkregen uit niet-gecoaguleerde bloedmonsters in klinische onderzoeken, de responsiviteit van cellen op metabole verstoringen en de methoden die door verschillende groepen zijn ontwikkeld om het mitochondriale metabolisme te ondervragen door remmers en ontkoppelaars te gebruiken om de maximale en minimale capaciteit van mitochondriale ademhaling te bepalen^21,22. Deze methoden hebben geleid tot een waardering van de rol van bio-energetica bij veroudering, stofwisselingsziekten en immuunfunctie 14,20,23,24. De mitochondriale ademhalingscapaciteit is vaak verminderd in skeletspieren en PBMC’s onder omstandigheden van hartfalen^18,25. PBMC bio-energetica zijn ook gecorreleerd met cardiometabole risicofactoren bij gezonde volwassenen¹⁷ en reageren op behandelingen zoals nicotinamide, riboside¹⁸. PBMC’s omvatten neutrofielen, lymfocyten (B-cellen en T-cellen), monocyten, natural killer-cellen en dendritische cellen, die allemaal bijdragen aan de mitochondriale capaciteit van PBMC 26,27,28. Bovendien speelt cellulaire bio-energetica een cruciale rol bij de activering, proliferatie en vernieuwing van^{immuuncellen23}. Een beperking van deze methoden is echter dat de cellen niet functioneren onder een fysiologisch bereik van substraten. Er zijn daarom aanvullende methoden nodig om de mitochondriale functie te ondervragen in substraatconcentraties die relevanter zijn voor wat cellen in vivo ervaren.

Mitochondriale membraanpotentiaal (mMP) is de belangrijkste component van een protonaandrijfkracht en is essentieel voor een verscheidenheid aan mitochondriale processen buiten de ATP-productie, zoals regulatie van respiratoire flux, productie van reactieve zuurstofsoorten, eiwit- en ionenimport, autofagie en apoptose. mMP kan worden beoordeeld met elektrochemische sondes of fluorescerende kleurstoffen die gevoelig zijn voor veranderingen in membraanpolarisatie zoals JC-1, Rhod123, DiOC₆, tetramethylrhodamine (TMRE) of methylester (TMRM) en safranine. De laatste twee zijn lipofiele kationische kleurstoffen die met succes zijn gebruikt in fluorespirometrie met hoge resolutie van weefselhomogenaten, geïsoleerde mitochondriën en gepermeabiliseerd weefsel 11,29,30,31,32,33. In deze techniek wordt TMRM gebruikt in de quench-modus, waarbij cellen worden blootgesteld aan een hoge concentratie TMRM die zich ophoopt in de mitochondriale matrix wanneer ze gepolariseerd zijn (hoge mMP en protonaandrijfkracht), wat resulteert in het doven van cytosolische TMRM-fluorescentie. Wanneer mitochondriën depolariseren als reactie op ADP of ontkoppelaars, komt de kleurstof vrij uit de matrix, waardoor het TMRM-fluorescerende signaal^34,35 toeneemt. Het doel van deze methode is om tegelijkertijd veranderingen in mitochondriale ademhaling en mMP te meten als reactie op ADP-titraties in van mensen afgeleide PBMC’s, circulerende monocyten en T-cellen, en het kan ook worden toegepast op milt-T-cellen van muizen.

Protocol

Het verzamelen van bloedmonsters voor de ontwikkeling van gegevens en methoden die hierin worden gepresenteerd, is goedgekeurd door de Internal Review Board van de Universiteit van Washington. Representatieve resultaten omvatten ook gegevens van mannelijke C57BL/6J-muizen (5-7 maanden oud) gekocht bij Jackson Laboratories. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Office of Animal Welfare van de Universiteit van Washington. Het protocoloverzicht is weergegeven in figuur 1. De voorbereiding van het reagens voor dit protocol is te vinden in aanvullend dossier 1. Figuur 1: Overzicht van het protocol. Workflow met fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in mitochondriaal membraanpotentiaal in geïsoleerde monocyten (CD14+) en T-cellen (CD3+) van verse menselijke bloedmonsters te beoordelen. Afkortingen: TMRM, tetramethylrhodamine methylester; SUIT, titraties van substraat-ontkoppelinger-remmers; ADP, adenosinedifosfaat; Graven, digitonin; Mal, malaat; Pyr, pyruvaat; Glut, glutamaat; D1-10, 10 opeenvolgende ADP-titraties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1. Scheiding van buffy coat van volbloed OPMERKING: Celisolatie is gewijzigd ten opzichte van Kramer et al.27. Laat RPMI, dichtheidsgradiënt en centrifuge op kamertemperatuur komen. Steriliseer de bioveiligheidskast en materialen voordat u begint. Verzamel veneus bloed in drie 10 ml K2EDTA-buisjes. Keer de buizen minstens 3 keer om. Centrifugeer de buisjes bij 500 x g 10 min (22 °C, 9 versnelling [acc], 2 vertraging [dec]). Verwijder 1 ml plasma uit elk buisje en bewaar bij -80 °C voor toekomstige analyses. Breng het plasma en de helft van de rode bloedcellaag van elke buis over in een enkele kegelvormige buis van 50 ml. Voeg RPMI toe tot de markering van 40 ml. Keer minstens 3 keer om. Laag langzaam 10 ml van de plasmaoplossing in vier conische buisjes van 15 ml die 3 ml van de dichtheidsgradiënt bevatten. Centrifugeer op 700 x g gedurende 30 minuten (22 °C, 5 acc, 2 dec). Verzamel al het plasma en de buffy coat die de perifere mononucleaire cellen (PBMC’s) bevat zonder de rode bloedcellen te verstoren. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 minuten (22 °C, 5 acc, 5 dec) en zuig het supernatant op. Was de PBMC-pellet 1x-2x door deze te resuspenderen in 10 ml RPMI en te centrifugeren op 500 x g gedurende 10 minuten (22 °C, 5 acc, 5 dec). 2. Magnetische scheiding van CD14+ en CD3+ cellen Plaats een kolom in het magnetische veld van een magnetische celscheider (zie de Materiaaltabel). Was de kolom met 3 ml RP-5. Resuspendeer de PBMC-pellet in 80 μL RP-5 en 20 μL anti-CD14-microbeads (zie de materiaaltabel). Incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen met 1 ml RP-5 en laad de suspensie op de kolom. Verzamel niet-gelabelde cellen die doorstromen in een conische buis van 15 ml met het label “Flow-through 1”. Wacht tot alle celsuspensie door de kolom is gegaan en ga dan verder met wassen met 3 ml RP-5 3x, waarbij u alle doorstroom opvangt. Haal de kolom voorzichtig uit het magnetische veld en plaats deze op een nieuwe conische buis van 15 ml. Voeg 5 ml RP-5 toe en gebruik onmiddellijk de zuiger om de inhoud van de kolom te zuiveren in een opvangbuis met het label “CD14+”. Centrifugeer “Flow-through 1” bij 500 x g gedurende 10 minuten (22 °C, 5 acc, 5 dec) en zuig het supernatans op. Herhaal stap 2.2-2.5 met behulp van cellen uit Flow-through 1 met behulp van anti-CD3-microbeads (zie de materiaaltabel) om T-cellen te isoleren. Centrifugebuisjes met T-cellen (CD3+) en monocyten (CD14+) bij 300 x g gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en resuspendeer de pellet in 1 ml RP-5. Bepaal de celconcentratie met behulp van een hemocytometer of automatische celteller.OPMERKING: Cellen kunnen worden geteld door 10 μL van een celverdunning van 1:10 of 1:20 toe te voegen aan een hemocytometer. Men kan verwijzen naar eerder gepubliceerde protocollen om cellen te tellen met behulp van een hemocytometer36. Pipette 2,5 miljoen monocyten of 5 miljoen T-cellen in een nieuwe centrifugebuis. Centrifugeer gedurende 30 s bij 2000 x g, zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in MiR05 voor een totaal volume van 20 μl en een eindconcentratie van 125 miljoen monocyten of 250 miljoen T-cellen per ml.OPMERKING: De uiteindelijke concentratie werd gekozen om 2,5 miljoen monocyten of 5 miljoen T-cellen te injecteren in een volume van 20 μL. Muizen-T-cellen geïsoleerd uit de milt zijn ook getest met behulp van deze methode. De procedure is te vinden in aanvullend dossier 1. 3. Fluorespirometrie met hoge resolutie – Zuurstof- en TMRM-fluorescentiekalibratie OPMERKING: Deze methode is aangepast van eerder werk dat is gedaan aan gepermeabiliseerde vezels door Pharaoh et al.11. Een hoge, niet-remmende concentratie van TMRM wordt gebruikt voor de quench-modus, waarbij de relatie tussen mMP en TMRM-concentratie in de matrix wordt omgekeerd. Een afname van mMP leidt dus tot het vrijkomen van TMRM-kleurstof uit de matrix en een toename van de fluorescentie32. Installeer kamers van 0.5 ml in de O2K-ademhalingsmeter volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Schakel het instrument in en sluit het aan op de software die door de fabrikant wordt geleverd voor gegevensverzameling. Stel de temperatuur in op 37 °C en roer de snelheid op 750 tpm. Was de kamers 3x met gedestilleerd water. Vervang het water door 0,54 ml Mir05, sluit de stoppen volledig en verwijder overtollige buffer met het geïntegreerde zuigsysteem (ISS). Til de stoppen op om de zuurstof in de kamer in evenwicht te brengen met de zuurstof in de kamer met behulp van een stopafstandhouder. Zodra de zuurstofflux stabiel is, voert u de luchtzuurstofkalibratie (R1) uit volgens de instructies van de fabrikant.OPMERKING: Het kan >30 minuten duren voordat de zuurstofflux is gestabiliseerd. Zuurstofsensoren vereisen de bepaling van nulpuntszuurstof (R0) en achtergrondzuurstofflux van 50-200 μM uit afzonderlijke experimenten met behulp van dithioniettitraties. Specifieke methoden zijn te vinden in de handleiding van de fabrikant. Sluit de kamer af door de stoppen te sluiten.OPMERKING: In tegenstelling tot experimenten met gepermeabiliseerde vezels, vereisen de kamers geen hyperoxygenatie voor PBMC’s. Het afdichten van de kamer na R1-kalibratie levert voldoende zuurstof op voor het experiment. Het zuurstofgehalte moet tussen 50-250 μM worden gehouden. Als de zuurstofconcentratie onder de drempelwaarde daalt, kan de kamer gedeeltelijk worden geopend, zodat de zuurstof in de kamer in evenwicht kan komen met de zuurstof in de kamerlucht. TMRM-kalibratieGebruik de groene LED fluosensoren (bijv. 525 nm) met de AmR filterset (zie Materiaaltabel). Stel de fluorometerversterking in op 1000 en de intensiteit op 1000. Zet de fluosensoren aan en begin met het opnemen van de basislijn. Injecteer 2,5 μL 0,05 mM TMRM en laat het signaal stabiliseren (~2 min) vóór de volgende injectie van 2,5 μL totdat er in totaal 4 injecties zijn uitgevoerd voor een totale TMRM-concentratie van 1 μM TMRM in de kamer. Gebruik een Hamilton-spuit voor alle injecties. Kalibreer de fluosensor door voor elke injectie het fluorescerende signaal (voltage) te selecteren dat 0, 0,25, 0,5, 0,75 en 1,0 μM TMRM vertegenwoordigt voor een vijfpuntskalibratie. 4. Protocol voor titratie van substraat-ontkoppelingsremmers (SUIT) OPMERKING: Voer blanco experimenten uit waarbij 20 μL Mir05 in de kamer wordt geïnjecteerd in plaats van 20 μL celsuspensie, aangezien het TMRM-signaal zal veranderen als reactie op injecties alleen (besproken in representatieve resultaten). Laat het zuurstoffluxsignaal stabiliseren (ongeveer 2-3 minuten) vóór de volgende injectie voor zowel blanco- als monsterexperimenten. Het volgende titratieprotocol en de verwachte waarnemingen staan in tabel 1. Zodra de zuurstofflux stabiel is, selecteert en labelt u zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal “pre-cel”. Injecteer de celsuspensie met 5 miljoen T-cellen of 2,5 miljoen monocyten in ~20 μL en meet gedurende ongeveer 10 minuten. Selecteer en label zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal als “Cel”. Permeabiliseer cellen door 2 μL van 1 mg/ml digitonine te injecteren (eindconcentratie: 4 μg/ml). Wacht 20 minuten. Selecteer en label zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal als “Dig”.OPMERKING: Er wordt voorgesteld om de digitonineconcentratie in afzonderlijke experimenten te optimaliseren. Voeg 2,5 μL 1 M-succinaat toe (eindconcentratie: 5 mM). Selecteer en label zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal als “SUCC”. Zodra de zuurstofflux stabiel is, voegt u 5 μL 100 mM malaat (eindconcentratie: 1,0 mM), 5 μL 1 M glutamaat (eindconcentratie: 10 mM) en 5 μL 500 mM pyruvaat (eindconcentratie: 5 mM) toe. Selecteer en label zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal als “MPG”. Zodra de zuurstofflux stabiel is, titreert u ADP. Selecteer de snelheden voor elke titratie en label ze achtereenvolgens “D” van 1 tot en met 10, afhankelijk van het aantal titraties. Gebruik het titratieschema in tabel 2. Zodra de zuurstofflux stabiel is, voert u een reeks titraties van 1 μl uit van 0,25 mM carbonylcyanide p-(tri-fluromethoxy) fenylhydrazon (FCCP) totdat het fluorescerende signaal zijn maximum bereikt. Selecteer en label zowel de zuurstofflux als het TMRM-signaal dat het minimale membraanpotentiaal vertegenwoordigt en label het “FCCP”.OPMERKING: FCCP-concentratie van 0,5-1,0 μM is meestal vereist om het mitochondriale membraanpotentieel uit te putten.LET OP: FCCP is giftig. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (SDS) voor de juiste behandeling. OPTIONEEL: Zodra de zuurstofflux stabiel is, injecteert u 1 μL 0,25 mM rotenon om complex I te remmen en de ademhalingscapaciteit te bepalen via complex II.OPMERKING: Veranderingen in de membraanpotentiaal zijn niet langer relevant na titreren met de ontkoppelaar.LET OP: Rotenon is giftig. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad voor de juiste behandeling. Zodra de zuurstofflux stabiel is, injecteert u 1 μL van 1,25 mM (eindconcentratie: 2,5 μM) antimycine A om de mitochondriale ademhaling te remmen.LET OP: Antimycine A is giftig. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad voor de juiste behandeling. 5. Berekening van de mitochondriale membraanpotentiaal en analyse Noteer met behulp van blanco experimenten de gekalibreerde TMRM-waarden (micromolaire TMRM) vóór de injectie van het blanco monster (“pre-sample”) en voor elk van de injecties. Zie figuur 2. Bereken voor elk blanco experiment de achtergrondverhouding door de TMRM-concentratie “pre-sample” in te stellen op 1,0. Bereken de daaropvolgende proportionele afname van TMRM. Bereken de gemiddelde achtergrondverhouding van alle lege experimenten.OPMERKING: Het aantal lege experimenten dat moet worden opgenomen, kan afhangen van de precisie van het instrument. Zie het rekenvoorbeeld in tabel 3 van vijf verschillende blanco experimenten, waarbij de standaarddeviatie van de gemiddelde achtergrondverhouding voor elke titratie tussen 0 en 0,016 lag. Achtergrondberekening: Bereken de achtergrond voor elk voorbeeldexperiment door het “pre-monster” TMRM van het monsterexperiment te vermenigvuldigen met de gemiddelde achtergrondverhouding voor elke injectie. Zie het rekenvoorbeeld in tabel 3. Achtergrondcorrectie: Trek de achtergrond van het experiment af van de gemeten TMRM-waarden van het monster. Zie het rekenvoorbeeld in tabel 4. FCCP-correctie: Trek de FCCP-achtergrondgecorrigeerde mMP af van elke injectie. Zie het rekenvoorbeeld in tabel 4. ADP-gevoeligheidscurve: Normaliseer de ADP-gestuurde afname van mMP door het hoogste en laagste membraanpotentieel in te stellen op respectievelijk 100% en 0%, met behulp van de mMP-waarden die tijdens de ADP-titratie zijn verzameld. Pas de gegevens in een niet-lineair fit-regressiemodel met behulp van de statistische software van voorkeur om de halfmaximale remmende concentratie (IC50) van ADP op mMP te berekenen.OPMERKING: De curve past bij de [Inhibitor] vs. genormaliseerde respons – Variabele helling in Prisma. Figuur 2: Berekening van mitochondriale membraanpotentiaal (mMP) en ADP-gevoeligheid op basis van TMRM-fluorescentie. Stappen voor het berekenen van mitochondriale membraanpotentiaal (mMP) en ADP-gevoeligheid op basis van metingen van TMRM-fluorescentie door fluorespirometrie met hoge resolutie van één monster van T-cellen (n = 1). Stap 1: TMRM-fluorescentie wordt gemeten in blanco monsters zoals gedaan in het biologische monster. Stap 2: Bepaal de verhouding in het TMRM-signaal bij elke titratie ten opzichte van het signaal voorafgaand aan het monster voor elk blanco experiment. Bereken het gemiddelde voor elke titratie van alle lege experimenten. Stap 3: Bereken de achtergrond voor elk voorbeeldexperiment door de “pre-sample”-fluorescentie te vermenigvuldigen met de gemiddelde achtergrondverhouding voor elke titratie. Stap 4: Bereken het verschil tussen achtergrond- en monster-TMRM-fluorescentie voor elke titratie om gegevens uit te drukken als mMP of mitochondriale TMRM-opname. Stap 5: Corrigeer mMP zodat volledige ontkoppeling met FCCP nul mMP weerspiegelt. Stap 6: Voer niet-lineaire regressie uit om veranderingen in mMP in grafieken weer te geven met toenemende ADP-concentraties. Metingen werden uitgevoerd in kamers van 0,5 ml, waarvan er één 5 miljoen T-cellen van een gezonde vrijwilliger bevatte. Gemiddelde gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Enkele gegevenspunten van een enkele replicatie worden uitgedrukt zonder foutbalken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Om de verschillen in optimale celconcentratie voor de test te illustreren, werden 5 miljoen T-cellen in een kamer van 0,5 ml (10 miljoen cellen/ml) geladen en 1,25 miljoen cellen in een andere kamer (2,5 miljoen cellen/ml) die 1 μM TMRM bevatte (figuur 3A-G). Er werden ook drie lege experimenten opgenomen om de TMRM-achtergrond te berekenen. We ontdekten dat een hogere concentratie T-cellen resulteerde in een beter waarneembare verandering in TMRM-fluorescentie ten opzichte van de achtergrond (Figuur 3B,D). Bovendien stelde een hogere celconcentratie ons in staat om de verwachte toename van het zuurstofverbruik en gelijktijdige uitputting van de mMP te detecteren als reactie op de toevoeging van FCCP (Figuur 3E,F). Het gebruik van een lage concentratie cellen leverde een zwakke verandering in fluorescentie op die parallel liep met de achtergrond. Aangezien de berekening van mMP de achtergrond van het signaal aftrekt, maakt een lage celconcentratie het niet mogelijk om veranderingen in mMP te bepalen als reactie op substraten en ontkoppelaars. Naast het gebruik van de hogere concentraties cellen in deze test, raden we aan om de celconcentratie voor elk celtype tussen de experimenten constant te houden. Om de invloed van ATP-synthase op de dissipatie van mMP met ADP-titraties te valideren, voerden we parallelle experimenten uit op PBMC’s en T-cellen waarbij één kamer oligomycine ontving vóór ADP-titratie (Figuur 4). We vonden geen dissipatie van mMP als reactie op ADP in cellen behandeld met oligomycine, wat suggereert dat de geleidelijke afname van mMP met ADP het gevolg is van protonflux door ATP-synthase (Figuur 4A-F). We vergeleken ook de ADP-gevoeligheid tussen T-cellen en PBMC’s van dezelfde deelnemer en ontdekten dat de ADP-gevoeligheid lager was (hogere EC50) in de T-celfractie (Figuur 4G,H). We voerden een reeks blanco experimenten uit om de invloed van tijd of het SUIT-protocol op TMRM-fluorescentie te bepalen. We ontdekten dat het TMRM-signaal in blanco experimenten voornamelijk wordt beïnvloed door SUIT-titraties (Figuur 5A) in tegenstelling tot de timing van de titraties (Figuur 5B). We vergeleken ADP-gestuurde veranderingen in zuurstofverbruik (OCR) en in mMP in T-cellen en monocyten van 11 gezonde, thuiswonende vrijwilligers (Figuur 6A-H). Net als de resultaten van eerder gepubliceerde experimenten met extracellulaire flux en enzymatische tests, vertoonden monocyten een grotere mitochondriale ademhalingscapaciteit dan lymfocyten26,27 (Figuur 6A,H). We ontdekten echter geen typische dosis-responsverhoging in OCR met ADP in beide celtypen (Figuur 6C,D), in tegenstelling tot wat deze methode laat zien bij het gebruik van zeer metabolische weefsels zoals muizenlever (Figuur 7A-H). Aan de andere kant stelde het gebruik van TMRM ons in staat om een geleidelijke afname van mMP met ADP te detecteren in menselijke immuuncellen (Figuur 6E-G) en in milt-T-cellen van muizen (Figuur 7E-H). Hoewel we menselijke en muizen-T-cellen niet rechtstreeks hebben vergeleken met hetzelfde titratieprotocol, ontdekten we wel dat de IC50 van Muizen-T-cellen een factor 10 lager was in vergelijking met die van circulerende T-cellen van menselijke proefpersonen. Figuur 3: Experimenten met fluorespirometrie met hoge resolutie. (A-D) Spoor van experimenten met fluorespirometrie met hoge resolutie met T-celconcentraties van 10 miljoen cellen/ml en 2,5 miljoen cellen/ml in kamers van 0,5 ml. (A) 10 miljoen cellen/ml in kamers van 0,5 ml. (C) 2,5 miljoen cellen/ml in kamers van 0,5 ml. De zuurstofflux (pmol/s/ml) wordt weergegeven in het bovenste paneel (rood) en het gekalibreerde TMRM-signaal wordt weergegeven in het onderste paneel (zwart). Veranderingen in TMRM gedurende de SUIT voor het monster en de berekende achtergrond werden uitgezet voor de kamers met (B) 10 miljoen cellen/ml en (D) 2,5 miljoen cellen/ml. (E) Voor elke celconcentratie werden de zuurstofflux (pmol/s/miljoen cellen) en (F) mitochondriale membraanpotentiaal berekend. (G) De ADP-gevoeligheidscurve werd uitgezet en aangepast aan een niet-lineair regressiemodel (ononderbroken lijnen). Afkortingen: mMP, mitochondriale membraanpotentiaal; TMRM, tetramethylrhodamine methylester; SUIT, titraties van substraat-ontkoppelinger-remmers; ADP, adenosinedifosfaat; Graven, digitonin; Mal, malaat; Pyr, pyruvaat; Glut, glutamaat; D1-11, 11 opeenvolgende ADP-titraties; U, ontkoppelaar FCCP van 0,5 en 1,0 μM; AMA, antimycine A. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: ATP-synthase zorgt voor ADP-gedreven afname van membraanpotentiaal in T-cellen en PBMC’s. (A-H) Het hier beschreven protocol is getest in PBMC’s en T-cellen. Twee O2K-kamers werden geïnjecteerd met PBMC’s en twee kamers met een extra O2K werden geïnjecteerd met T-cellen van dezelfde deelnemer. Na het injecteren van substraten malaat, pyruvaat en glutamaat in alle kamers, kreeg één kamer met PBMC’s en T-cellen oligomycine. Oligomycine verhinderde elke ADP-gestuurde stijging van de ademhaling in (A) PBMC’s en (D) T-cellen of afname van de mitochondriale membraanpotentiaal in (B,C) PBMC’s en (E,F) T-cellen. (G,H) ADP-gevoeligheid was groter in PBMC’s in vergelijking met T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Blanco experimenten tonen de verandering in TMRM-fluorescentie als reactie op tijd en titraties van substraten, ontkoppelaars en remmers (SUIT). (A) Verandering in TMRM-fluorescentie als reactie op titratie. (B) Verandering in TMRM-fluorescentie als reactie op de tijd. Experimenten werden uitgevoerd in kamers van 0,5 ml gevuld met Mir05 met 1 μM TMRM. In één kamer werden geen SUIT-titraties uitgevoerd (geen injectie); twee kamers in twee verschillende instrumenten kregen een standaard pakprotocol (standaardinjectie); één kamer kreeg dezelfde SUIT-titraties, maar met een vertraging tussen elke injectie (vertraagde injectie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Verschillen in ADP-gevoeligheid tussen T-cellen en monocyten met behulp van OCR en mMP. (A) Spoor van een fluorespirometrie-experiment met hoge resolutie uit het monocyten- en T-celmonster van een proefpersoon. (B) Zuurstofverbruik in monocyten (n= 11) en T-cellen (n= 13) uit het bloed van gezonde vrijwilligers. (C,D) Niet-lineaire regressieaanpassing van de geplotte stijging van de ademhaling met ADP-titraties om een EC50 te berekenen. (E) Gelijktijdige meting van de mitochondriale membraanpotentiaal (F,G) Niet-lineaire regressieaanpassing van de geplotte afname van het mitochondriaal membraanpotentiaal met ADP-titraties om een IC50 te berekenen. (H) Parameters van de ademhalingscapaciteit van monocyten en T-cellen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM voor lijngrafieken en gemiddelde ± SD voor staafdiagrammen. Statistisch significante verschillen na t-toetsen worden uitgedrukt als *p < 0,05. **p < 0,01 en ****p < voor 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Vergelijking van ADP-respons in ademhaling en mitochondriaal membraanpotentiaal (mMP) in gepermeabiliseerde milt-T-cellen van muizen en lever. (A-D) Respons in ademhaling in gepermeabiliseerde milt-T-cellen van muizen en lever. (E-H) Respons in mMP in gepermeabiliseerde milt-T-cellen en lever van muizen. Verse lever en milt werden ontleed van drie muizen na cervicale dislocatie. Milt Pan T-cellen werden geïsoleerd met behulp van antilichaam-geconjugeerde magnetische parelscheiding. Beide monsters ondergingen hetzelfde SUIT-protocol in aanwezigheid van 1 μM TMRM. (I,J) Vergelijking van EC50 berekend op basis van de toename van het zuurstofverbruik (OCR) en IC50 op basis van de afname van mMP als reactie op ADP. N = 3 per groep. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Voorbeeld SUIT-protocol voor het beoordelen van mitochondriaal membraanpotentieel in vers geïsoleerde T-cellen en monocyten met behulp van de kamers van 0,5 ml. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: Aanbevolen ADP-titratie voor een kamer van 0,5 ml. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 3: Berekening van de gemiddelde achtergrondverhouding met behulp van vijf onafhankelijke lege experimenten. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 4: Berekening van het mitochondriale membraanpotentiaal (mMP) op basis van een steekproefexperiment. Klik hier om deze tabel te downloaden. Aanvullende figuur 1: Effect van Mir05 en DMSO op mitochondriale ademhaling en membraanpotentiaal. Klik hier om dit bestand te downloaden. Aanvullend dossier 1: Reagensbereiding en protocol voor het isoleren van T-cellen uit de milt van muizen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol maakt gebruik van fluorespirometrie met hoge resolutie om de gevoeligheid van de mitochondriale respons op de energievraag te meten door de dissipatie van mMP te meten als reactie op toenemende niveaus van ADP in PBMC’s, monocyten en T-cellen. Dit wordt gedaan door complexe I- en II-substraten toe te voegen om het mitochondriale membraanpotentieel te maximaliseren en ADP te titreren om ATP-synthase geleidelijk te stimuleren om de protongradiënt te gebruiken voor ATP-generatie.

Kritieke stappen in het protocol zijn onder meer het instellen van de versterking en intensiteit van de fluorofoor op 1000 en ervoor zorgen dat een TMRM-fluorescerend signaal wordt verkregen tijdens de TMRM-titratie. Omdat de TMRM-fluorescentie na elke titratie afneemt (een beperking van deze methode), is het absoluut noodzakelijk om achtergrondexperimenten uit te voeren met blanco monsters. We hebben ook ontdekt dat DMSO een remmend effect heeft op de mitochondriale ademhaling en het membraanpotentiaal en raden daarom aan om de werkoplossing van TMRM in Mir05 te verdunnen (aanvullende figuur 1).

Enkele aanpassingen die kunnen worden gebruikt bij het proberen van dit protocol zijn het aanpassen van de celconcentraties en het gebruik van de standaard kamer van 2 ml. De kamer van 0,5 ml heeft echter de voorkeur voor T-cellen en monocyten vanwege de hoge concentratie cellen die nodig zijn voor een optimale respons in membraanpotentiaal en zuurstofflux. Een lagere concentratie cellen kan optimaal zijn bij het testen van cellen met een grotere ademhalingscapaciteit, zoals macrofagen.

Aanvullende beperkingen van de hier gepresenteerde methode zijn onder meer de vereiste van ten minste 5 miljoen T-cellen en 2,5 miljoen monocyten. We kunnen vaak voldoende cellen halen uit ~20 ml bloed van gezonde deelnemers, maar deze aantallen kunnen variëren per gezondheidstoestand, leeftijd^{en geslacht.} Bovendien moeten de cellen, zoals bij de meeste methoden die de mitochondriale capaciteit beoordelen, vers worden geïsoleerd. Deze methode zou in de toekomst echter in gecryopreserveerde cellen kunnen worden uitgeprobeerd. In vergelijking met de opbrengst van menselijk bloed is de T-celopbrengst van milten van gezonde muizen hoog genoeg om deze test uit te voeren.

Circulerende T-cellen, met name langlevende geheugencellen (_T-M) en regulerende (Treg) cellen, zijn afhankelijk van oxidatieve fosforylering voor energie³⁷. Hoewel hun energiebehoefte en zuurstofverbruik laag zijn (bijvoorbeeld in vergelijking met die van rustende spieren), is hun overleving essentieel voor een effectieve immuunrespons op herinfectie en kanker 38,39,40. Een vermindering van de oxidatieve fosforylering van T-cellen resulteert in een verminderde proliferatieve capaciteit en bevordert de uitputting en veroudering van T-cellen ^5,41. Bovendien bevordert mitochondriale hyperpolarisatie een aanhoudende productie van cytokines (IL-4 en IL-21) door effector CD4 T-cellen tijdens activering⁴². Bij infectie kan de energiebehoefte voor activering en proliferatie van immuuncellen oplopen tot 25%-30% van het basaal metabolisme⁴³. Daarom functioneren immuuncellen in een breed en extreem scala aan energiebehoeften, en dit protocol kan mitochondriale reacties binnen dat bereik testen.

Chronische ontsteking is een veelvoorkomend kenmerk van obesitas, diabetes en veroudering. Ontregelde niveaus van circulerende hormonen, lipiden en glucose hebben systemische effecten en kunnen dus van invloed zijn op hoe mitochondriën reageren op een energetische uitdaging. Hier hebben we een methode gepresenteerd om de mitochondriale ADP-gevoeligheid bij circulerende PBMC’s te beoordelen. Verdere studies zijn nodig om te bepalen hoe ADP-gevoeligheid kan worden gemoduleerd bij stofwisselingsziekten en hoe dit de gezondheidstoestand beïnvloedt.

Materials

Adenosine Diphosphate	Sigma-Aldrich	A5285	Fluorespirometry
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003	Mir05 buffer
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A6003	Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	Fluorespirometry
Cell strainers	Fisher Scientific	22-363-548	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	Cell isolation
CD3 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-101	Cell isolation
DatLab	Oroboros	Version 8
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141	Fluorespirometry
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	84097	Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	Mir05 buffer
Filter Set AmR	Oroboros	44321-01
HBSS (10x)	Gibco	12060-040
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7523	Mir05 buffer
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Cell isolation
K2EDTA blood collection tubes	BD Vacutainer	366643	Cell isolation
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	153516	Mir05 buffer
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1626	Fluorespirometry
L-Malic Acid	Sigma-Aldrich	M1000	Fluorespirometry
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M9272	Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-301	Cell isolation
O2k-Fluo Smart-Module	Oroboros	12100-03
O2k-FluoRespirometer series J	Oroboros	10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber)	Oroboros	11200-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	04876	Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi	130095130	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	221473	Mir05 buffer
Prism	GraphPad	Version 10
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Fluorespirometry
RPMI Buffer	Corning	17-105-CV	Cell isolation
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Fluorespirometry
Succinate disodium salt	Sigma-Aldrich	S2378	Fluorespirometry
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite	Sigma-Aldrich	T5428	Fluorespirometry