Fluorrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios dinámicos en el potencial de la membrana mitocondrial en células inmunitarias humanas

Summary

Los métodos para estudiar la bioenergética mitocondrial bajo concentraciones de sustrato fisiológicamente relevantes en las células inmunitarias son limitados. Proporcionamos un protocolo detallado que utiliza fluororrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios en la respuesta del potencial de la membrana mitocondrial a la demanda de energía en células T humanas, monocitos y células mononucleares periféricas.

Abstract

Las células mononucleares periféricas (PBMC) exhiben cambios robustos en la capacidad respiratoria mitocondrial en respuesta a la salud y la enfermedad. Si bien estos cambios no siempre reflejan lo que ocurre en otros tejidos, como el músculo esquelético, estas células son una fuente accesible y valiosa de mitocondrias viables de sujetos humanos. Las PBMC están expuestas a señales sistémicas que afectan su estado bioenergético. Por lo tanto, la expansión de nuestras herramientas para interrogar el metabolismo mitocondrial en esta población dilucidará los mecanismos relacionados con la progresión de la enfermedad. Los ensayos funcionales de las mitocondrias a menudo se limitan a utilizar los gastos respiratorios después de las concentraciones máximas de sustrato, inhibidor y desacoplador para determinar el rango completo de capacidad respiratoria, que puede no ser alcanzable in vivo. La conversión de difosfato de adenosina (ADP) en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP-sintasa da lugar a una disminución del potencial de membrana mitocondrial (mMP) y un aumento del consumo de oxígeno. Para proporcionar un análisis más integrado de la dinámica mitocondrial, este artículo describe el uso de la fluorrespirometría de alta resolución para medir la respuesta simultánea del consumo de oxígeno y el potencial de membrana mitocondrial (mMP) a concentraciones fisiológicamente relevantes de ADP. Esta técnica utiliza éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) para medir la polarización mMP en respuesta a las valoraciones de ADP después de la hiperpolarización máxima con sustratos de complejos I y II. Esta técnica se puede utilizar para cuantificar cómo los cambios en el estado de salud, como el envejecimiento y las enfermedades metabólicas, afectan la sensibilidad de la respuesta mitocondrial a la demanda de energía en PBMC, células T y monocitos de sujetos humanos.

Introduction

La capacidad de una célula para funcionar y sobrevivir en un período de estrés fisiológico depende en gran medida de su capacidad para satisfacer el requisito energético para restaurar la homeostasis ^1,2. La demanda de energía aumenta en respuesta a una variedad de estímulos. Por ejemplo, el aumento de la contracción muscular durante el ejercicio aumenta la utilización de ATP y glucosa por el músculo esquelético, y un aumento en la síntesis de proteínas después de una infección aumenta la utilización de ATP por parte de las células inmunitarias para la producción y proliferación de citocinas 3,4,5,6. Un aumento en la demanda de energía desencadena una serie de procesos bioenergéticos para restaurar la relación ATP/ADP. A medida que se consume ATP, los niveles de ADP aumentan y estimulan la F₁F₀ ATP-sintasa (complejo V), que requiere una fuerza protonmotriz para impulsar su rotación mecánica y la conversión catalítica de ADP a ATP dentro de la mitocondria⁷. La fuerza protonmotriz es un gradiente electroquímico creado por el bombeo de protones durante la transferencia de electrones de los sustratos al oxígeno a través del sistema de transporte de electrones (ETS) dentro de la membrana mitocondrial interna. La diferencia resultante en la concentración de protones (delta pH) y el potencial eléctrico (potencial de membrana) crea la fuerza protónita que impulsa la síntesis de ATP y el consumo de oxígeno en respuesta a la demanda de energía, reduciendo la relación ATP/ADP o elevando los niveles de ADP. La afinidad de las mitocondrias con el ADP puede determinarse mediante el cálculo de la K_m o EC₅₀ de la respiración estimulada por ADP de mitocondrias aisladas o células permeabilizadas ^8,9. Este método ha demostrado que las fibras musculares permeabilizadas de humanos mayores requieren una mayor concentración de ADP para estimular el 50% de su capacidad máxima de fosforilación oxidativa que las de sujetos más jóvenes⁹. De manera similar, el envejecimiento del músculo esquelético del ratón requiere más ADP para reducir la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales10,11. Además, la sensibilidad a la ADP se reduce en las fibras musculares permeabilizadas de ratones con obesidad inducida por la dieta en relación con los controles y aumenta en presencia de insulina y tras el consumo de nitratos^12,13. Por lo tanto, la capacidad de las mitocondrias para responder a la demanda de energía varía en diferentes condiciones fisiológicas, pero esto no se ha explorado previamente en el contexto de las células inmunitarias.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se utilizan comúnmente para investigar la bioenergética celular en sujetos humanos 14,15,16,17,18,19,20. Esto se debe en gran medida a que las células se pueden obtener fácilmente a partir de muestras de sangre no coaguladas en estudios clínicos, la capacidad de respuesta de las células a las perturbaciones metabólicas y los métodos desarrollados por varios grupos para interrogar el metabolismo mitocondrial mediante el uso de inhibidores y desacopladores para determinar la capacidad máxima y mínima de la respiración mitocondrial^21,22. Estos métodos han llevado a una apreciación de las funciones de la bioenergética en el envejecimiento, las enfermedades metabólicas y la función inmune 14,20,23,24. La capacidad respiratoria mitocondrial a menudo se reduce en el músculo esquelético y las PBMC en condiciones de insuficiencia cardíaca^18,25. La bioenergética de PBMC también se correlaciona con los factores de riesgo cardiometabólico en adultos sanos¹⁷ y responde a tratamientos como el ribósido de nicotinamida¹⁸. Las PBMC incluyen neutrófilos, linfocitos (células B y células T), monocitos, células asesinas naturales y células dendríticas, que contribuyen a la capacidad mitocondrial de las PBMC 26,27,28. Además, la bioenergética celular desempeña un papel crucial en la activación, proliferación y renovación de las células inmunitarias²³. Sin embargo, una limitación de estos métodos es que las células no funcionan bajo un rango fisiológico de sustratos. Por lo tanto, se requieren métodos adicionales para interrogar la función mitocondrial en concentraciones de sustrato que sean más relevantes para lo que las células experimentan in vivo.

El potencial de membrana mitocondrial (mMP) es el componente principal de una fuerza protonmotriz y es esencial para una variedad de procesos mitocondriales más allá de la producción de ATP, como la regulación del flujo respiratorio, la producción de especies reactivas de oxígeno, la importación de proteínas e iones, la autofagia y la apoptosis. El mMP puede evaluarse con sondas electroquímicas o tintes fluorescentes sensibles a los cambios en la polarización de la membrana como JC-1, Rhod123, DiOC₆, tetrametilrodamina (TMRE) o éster metílico (TMRM) y safranina. Los dos últimos son colorantes catiónicos lipofílicos que se han utilizado con éxito en la fluorrespirometría de alta resolución de homogeneizados de tejidos, mitocondrias aisladas y tejido permeabilizado 11,29,30,31,32,33. En esta técnica, la TMRM se utiliza en modo de enfriamiento, donde las células se exponen a una alta concentración de TMRM que se acumula en la matriz mitocondrial cuando se polariza (alta mMP y fuerza protonmotriz), lo que resulta en el enfriamiento de la fluorescencia citosólica de TMRM. Cuando las mitocondrias se despolarizan en respuesta a ADP o desacoplantes, el colorante se libera de la matriz, aumentando la señal fluorescente TMRM^34,35. El propósito de este método es medir simultáneamente los cambios en la respiración mitocondrial y la mMP en respuesta a las titulaciones de ADP en PBMC derivadas de humanos, monocitos circulantes y células T, y también se puede aplicar a células T esplénicas de ratón.

Protocol

La recolección de muestras de sangre para el desarrollo de datos y métodos presentados en este documento fue aprobada por la Junta de Revisión Interna de la Universidad de Washington. Los resultados representativos también incluyen datos de ratones machos C57BL/6J (de 5 a 7 meses de edad) comprados a Jackson Laboratories. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por la Oficina de Bienestar Animal de la Universidad de Washington. La descripción general del protocolo se muestra en la Figura 1. La preparación de reactivos para este protocolo se puede encontrar en el Archivo Complementario 1. Figura 1: Descripción general del protocolo. Flujo de trabajo que utiliza fluorrespirometría de alta resolución para evaluar los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial en monocitos aislados (CD14+) y células T (CD3+) a partir de muestras de sangre humana fresca. Abreviaturas: TMRM, éster metílico de tetrametilrodamina; SUIT, valoraciones de inhibidor de acoplador de sustrato; ADP: difosfato de adenosina; Excavar, digitonina; Mal, malato; Pyr, piruvato; Exceso, glutamato; D1-10, 10 valoraciones ADP consecutivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1. Separación del pelaje leucocitario de la sangre entera NOTA: El aislamiento celular es una modificación de Kramer et al.27. Permita que el RPMI, el gradiente de densidad y la centrífuga alcancen la temperatura ambiente. Esterilice el gabinete de bioseguridad y los materiales antes de comenzar. Recolectar sangre venosa en tres tubos de 10 mL de K2EDTA. Invierta los tubos al menos 3 veces. Centrifugar los tubos a 500 x g 10 min (22 °C, 9 aceleración [acc], 2 deceleraciones [dec]). Extraiga 1 ml de plasma de cada tubo y guárdelo a -80 °C para futuros análisis. Transfiera el plasma y la mitad de la capa de glóbulos rojos de cada tubo a un solo tubo cónico de 50 ml. Agregue RPMI hasta la marca de 40 mL. Invierta al menos 3 veces. Coloque lentamente 10 mL de la solución de plasma en cuatro tubos cónicos de 15 mL que contienen 3 mL del gradiente de densidad. Centrifugar a 700 x g durante 30 min (22 °C, 5 acc, 2 dec). Recolectar todo el plasma y la capa leucocitaria que contiene las células mononucleares periféricas (PBMC) sin alterar los glóbulos rojos. Centrifugar a 500 x g durante 10 min (22 °C, 5 acc, 5 dec) y aspirar el sobrenadante. Lave el pellet de PBMC 1x-2x resuspendiéndolo en 10 mL de RPMI y centrifugando a 500 x g durante 10 min (22 °C, 5 acc, 5 dec). 2. Separación magnética de células CD14+ y CD3+ Coloque una columna en el campo magnético de un separador de celdas magnéticas (consulte la Tabla de materiales). Lave la columna con 3 mL de RP-5. Vuelva a suspender el pellet de PBMC en 80 μL de RP-5 y 20 μL de microesferas anti-CD14 (consulte la Tabla de Materiales). Incubar durante 15 min a 4 °C. Vuelva a suspender las celdas con 1 mL de RP-5 y cargue la suspensión en la columna. Recoja las células no marcadas que fluyen a través de un tubo cónico de 15 mL etiquetado como “Flujo a través 1”. Espere hasta que toda la suspensión celular haya pasado por la columna, luego continúe lavando con 3 mL de RP-5 3x, recogiendo todo el flujo. Retire con cuidado la columna del campo magnético y colóquela en un nuevo tubo cónico de 15 mL. Agregue 5 mL de RP-5 e inmediatamente use el émbolo para purgar el contenido de la columna en un tubo de recolección etiquetado como “CD14+”. Centrifugar “Flow-through 1” a 500 x g durante 10 min (22 °C, 5 acc, 5 dec) y aspirar el sobrenadante. Usando celdas de Flow-through 1, repita los pasos 2.2-2.5 usando microperlas anti-CD3 (consulte la Tabla de materiales) para aislar las células T. Tubos de centrífuga que contienen células T (CD3+) y monocitos (CD14+) a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de RP-5. Determine la concentración celular utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células.NOTA: Las células se pueden contar añadiendo 10 μL de una dilución celular de 1:10 o 1:20 a un hemocitómetro. Se puede hacer referencia a los protocolos publicados anteriormente para contar células utilizando un hemocitómetro36. Pipetee 2,5 millones de monocitos o 5 millones de células T en un nuevo tubo de centrífuga. Centrifugar durante 30 s a 2000 x g, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en MiR05 para un volumen total de 20 μL y una concentración final de 125 millones de monocitos o 250 millones de células T por mL.NOTA: La concentración final se seleccionó para inyectar 2,5 millones de monocitos o 5 millones de células T en un volumen de 20 μL. También se han probado células T de ratón aisladas del bazo utilizando este método. El procedimiento se encuentra en el Legajo Complementario 1. 3. Fluorrespirometría de alta resolución – Calibración de fluorescencia de oxígeno y TMRM NOTA: Este método fue adaptado de trabajos previos realizados en fibras permeabilizadas por Pharaoh et al.11. Se utiliza una concentración alta y no inhibitoria de TMRM para el modo de enfriamiento, donde la relación de la concentración de mMP y TMRM en la matriz se invierte. Por lo tanto, una disminución de mMP conduce a la liberación de colorante TMRM de la matriz y un aumento de la fluorescencia32. Instale cámaras de 0,5 mL en el respirómetro de O2K de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Encienda el instrumento y conéctelo al software proporcionado por el fabricante para la adquisición de datos. Ajuste la temperatura a 37 °C y la velocidad de agitación a 750 rpm. Lave las cámaras con agua destilada 3 veces. Reemplace el agua con 0,54 mL de Mir05, cierre los tapones por completo y elimine el exceso de tampón con el sistema de succión integrado (ISS). Levante los tapones para permitir que el oxígeno de la habitación se equilibre con el oxígeno de la cámara mediante un espaciador de tapón. Una vez que el flujo de oxígeno esté estable, realice la calibración de oxígeno en el aire (R1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.NOTA: El flujo de oxígeno puede tardar >30 minutos en estabilizarse. Los sensores de oxígeno requieren la determinación del oxígeno de punto cero (R0) y el flujo de oxígeno de fondo de 50 a 200 μM a partir de experimentos separados utilizando valoraciones de ditionito. Los métodos específicos se pueden encontrar en el manual del fabricante. Selle la cámara cerrando los tapones.NOTA: A diferencia de los experimentos que utilizan fibras permeabilizadas, las cámaras no requieren hiperoxigenación para las PBMC. El sellado de la cámara después de la calibración R1 proporciona suficiente oxígeno para el experimento. Los niveles de oxígeno deben mantenerse entre 50-250 μM. Si la concentración de oxígeno cae por debajo del umbral, la cámara puede abrirse parcialmente para que el oxígeno de la cámara pueda equilibrarse con el oxígeno del aire ambiente. Calibración TMRMUtilice los sensores fluorescentes LED verdes (por ejemplo, 525 nm) con el juego de filtros AmR (consulte la tabla de materiales). Ajuste la ganancia del fluorímetro a 1000 y la intensidad a 1000. Encienda los sensores fluorescentes y comience a registrar la línea de base. Inyecte 2,5 μL de TMRM de 0,05 mM y deje que la señal se estabilice (~2 min) antes de la siguiente inyección de 2,5 μL hasta que se realicen un total de 4 inyecciones para una concentración total de TMRM de 1 μM de TMRM en la cámara. Use una jeringa Hamilton para todas las inyecciones. Calibre el sensor fluorescente seleccionando la señal fluorescente (voltaje) para cada inyección que representa 0, 0,25, 0,5, 0,75 y 1,0 μM de TMRM para una calibración de cinco puntos. 4. Protocolo de valoración de inhibidor de desacoplador de sustrato (SUIT) NOTA: Realice experimentos en blanco en los que se inyecten 20 μL de Mir05 en la cámara en lugar de 20 μL de suspensión celular, ya que la señal TMRM cambiará en respuesta solo a las inyecciones (discutido en resultados representativos). Permita que la señal de flujo de oxígeno se estabilice (aproximadamente 2-3 minutos) antes de la siguiente inyección tanto para experimentos en blanco como en muestra. El siguiente protocolo de valoración y las observaciones esperadas se encuentran en la Tabla 1. Una vez que el flujo de oxígeno sea estable, seleccione y etiquete tanto el flujo de oxígeno como la señal TMRM como “pre-celda”. Inyecte la suspensión celular que contiene 5 millones de células T o 2,5 millones de monocitos en ~ 20 μL y mida durante unos 10 minutos. Seleccione y etiquete tanto el flujo de oxígeno como la señal TMRM como “Celda”. Permeabilizar las células inyectando 2 μL de 1 mg/mL de digitonina (concentración final: 4 μg/mL). Espere 20 min. Seleccione y etiquete tanto el flujo de oxígeno como la señal TMRM como “Dig”.NOTA: Se sugiere optimizar la concentración de digitonina en experimentos separados. Añadir 2,5 μL de succinato 1 M (concentración final: 5 mM). Seleccione y etiquete tanto el flujo de oxígeno como la señal TMRM como “SUCC”. Una vez que el flujo de oxígeno sea estable, agregue 5 μL de malato de 100 mM (concentración final: 1,0 mM), 5 μL de glutamato 1 M (concentración final: 10 mM) y 5 μL de piruvato de 500 mM (concentración final: 5 mM). Seleccione y etiquete tanto el flujo de oxígeno como la señal TMRM como “MPG”. Una vez que el flujo de oxígeno sea estable, valore el ADP. Seleccione las tasas para cada valoración y etiquételas como “D” secuencialmente del 1 al 10, en función del número de valoraciones. Utilice el esquema de valoración del Cuadro 2. Una vez que el flujo de oxígeno sea estable, realice una serie de valoraciones de 1 μL de 0,25 mM de cianuro de carbonilo p-(tri-flurometoxi) fenil-hidrazona (FCCP) hasta que la señal fluorescente alcance su máximo. Seleccione y etiquete tanto el flujo de oxígeno como la señal TMRM que representa el potencial mínimo de membrana y etiquételo como “FCCP”.NOTA: Por lo general, se requiere una concentración de FCCP de 0,5-1,0 μM para agotar el potencial de membrana mitocondrial.PRECAUCIÓN: El FCCP es tóxico. Consulte la hoja de datos de seguridad (SDS) para un manejo adecuado. OPCIONAL: Una vez que el flujo de oxígeno sea estable, inyecte 1 μL de 0,25 mM de rotenona para inhibir el complejo I y determinar la capacidad respiratoria a través del complejo II.NOTA: Los cambios en el potencial de membrana ya no son relevantes después de la valoración con desacoplador.PRECAUCIÓN: La rotenona es tóxica. Consulte SDS para obtener información sobre el manejo adecuado. Una vez que el flujo de oxígeno sea estable, inyecte 1 μL de 1,25 mM (concentración final: 2,5 μM) de Antimicina A para inhibir la respiración mitocondrial.PRECAUCIÓN: La antimicina A es tóxica. Consulte SDS para obtener información sobre el manejo adecuado. 5. Cálculo y análisis del potencial de membrana mitocondrial Utilizando experimentos en blanco, registre los valores calibrados de TMRM (TMRM micromolar) antes de la inyección de la muestra en blanco (“premuestra”) y para cada una de las inyecciones. Véase la figura 2. Para cada experimento en blanco, calcule la proporción de fondo ajustando la concentración de TMRM “previa a la muestra” a 1,0. Calcule la disminución proporcional posterior de la TMRM. Calcule la proporción de fondo promedio de todos los experimentos en blanco.NOTA: El número de experimentos en blanco a incluir puede depender de la precisión del instrumento. Vea el ejemplo de cálculo en la Tabla 3 de cinco experimentos diferentes en blanco, donde la desviación estándar de la relación de fondo promedio cayó entre 0 y 0.016 para cada valoración. Cálculo de fondo: Calcule el fondo de cada experimento de muestra multiplicando el TMRM de “pre-muestra” del experimento de muestra por la relación de fondo promedio para cada inyección. Vea el ejemplo de cálculo en la Tabla 3. Corrección de fondo: Reste el fondo del experimento a los valores de TMRM medidos de la muestra. Vea el ejemplo de cálculo en la Tabla 4. Corrección FCCP: Reste el mMP corregido en fondo FCCP de cada inyección. Vea el ejemplo de cálculo en la Tabla 4. Curva de sensibilidad de ADP: Normalice la disminución de mMP impulsada por ADP estableciendo el potencial de membrana más alto y más bajo como 100% y 0%, respectivamente, utilizando los valores de mMP recopilados a lo largo de la valoración de ADP. Ajuste los datos en un modelo de regresión de ajuste no lineal utilizando el software estadístico preferido para calcular la concentración inhibitoria semimáxima (IC50) de ADP en mMP.NOTA: La curva se ajusta a la [Inhibidor] frente a la respuesta normalizada – Pendiente variable en el prisma. Figura 2: Cálculo del potencial de membrana mitocondrial (mMP) y la sensibilidad de ADP a partir de la fluorescencia de TMRM. Pasos para calcular el potencial de membrana mitocondrial (mMP) y la sensibilidad de ADP a partir de mediciones de fluorescencia de TMRM mediante fluorrespirometría de alta resolución de una muestra de células T (n = 1). Paso 1: La fluorescencia de TMRM se mide en muestras en blanco como se hace en la muestra biológica. Paso 2: Determine la relación en la señal TMRM con cada valoración en relación con la señal anterior a la muestra para cada experimento en blanco. Calcule el promedio de cada valoración de todos los experimentos en blanco. Paso 3: Calcule el fondo de cada experimento de muestra multiplicando la fluorescencia “previa a la muestra” por la relación de fondo promedio para cada valoración. Paso 4: Calcular la diferencia entre la fluorescencia de TMRM de fondo y la de muestra para cada titulación para expresar los datos como mMP o absorción de TMRM mitocondrial. Paso 5: Corrija los mMP para que el desacoplamiento completo con FCCP refleje cero mMP. Paso 6: Realice una regresión no lineal para graficar los cambios en mMP con concentraciones crecientes de ADP. Las mediciones se realizaron en cámaras de 0,5 ml, una de las cuales contenía 5 millones de células T de un voluntario sano. Los datos promediados se expresan como media ± SEM. Los puntos de datos individuales de una sola réplica se expresan sin barras de error. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

Para ilustrar las diferencias en la concentración celular óptima para el ensayo, se cargaron 5 millones de células T en una cámara de 0,5 mL (10 millones de células/mL) y 1,25 millones de células se cargaron en otra cámara (2,5 millones de células/mL) que contenía 1 μM de TMRM (Figura 3A-G). También se incluyeron tres experimentos en blanco para calcular el fondo de TMRM. Descubrimos que una mayor concentración de células T resultó en un cambio más distinguible en la fluorescencia de TMRM en relación con el fondo (Figura 3B, D). Además, una mayor concentración de células nos permitió detectar el aumento esperado en el consumo de oxígeno y el agotamiento simultáneo de la mMP en respuesta a la adición de FCCP (Figura 3E,F). El uso de una baja concentración de células produjo un cambio débil en la fluorescencia que fue paralelo al fondo. Dado que el cálculo de mMP resta el fondo de la señal, una concentración de celda baja no permite determinar los cambios en mMP en respuesta a sustratos y desacopladores. Además de utilizar las concentraciones más altas de células en este ensayo, recomendamos mantener constante la concentración de células para cada tipo de célula entre experimentos. Para validar la influencia de la ATP-sintasa en la disipación de mMP con titulaciones de ADP, realizamos experimentos paralelos en PBMCs y células T donde una cámara recibió oligomicina antes de la titulación de ADP (Figura 4). No encontramos disipación de mMP en respuesta a ADP en células tratadas con oligomicina, lo que sugiere que la disminución gradual de mMP con ADP es el resultado del flujo de protones a través de la ATP-sintasa (Figura 4A-F). También comparamos la sensibilidad de ADP entre las células T y las PBMC del mismo participante y encontramos que la sensibilidad de la ADP era menor (mayor EC50) en la fracción de células T (Figura 4G, H). Llevamos a cabo una serie de experimentos en blanco para determinar la influencia del tiempo o del protocolo SUIT en la fluorescencia de TMRM. Descubrimos que la señal de TMRM en experimentos en blanco está influenciada principalmente por las valoraciones SUIT (Figura 5A) en lugar de la sincronización de las valoraciones (Figura 5B). Comparamos los cambios impulsados por ADP en las tasas de consumo de oxígeno (OCR) y en mMP en células T y monocitos de 11 voluntarios sanos que vivían en la comunidad (Figura 6A-H). De manera similar a los resultados de experimentos publicados anteriormente utilizando flujo extracelular y ensayos enzimáticos, los monocitos exhibieron una mayor capacidad respiratoria mitocondrial que los linfocitos26,27 (Figura 6A,H). Sin embargo, no detectamos un aumento típico de la dosis-respuesta en el OCR con ADP en ninguno de los dos tipos de células (Figura 6C,D), al contrario de lo que muestra este método cuando se utilizan tejidos altamente metabólicos como el hígado de ratón (Figura 7A-H). Por otro lado, el uso de TMRM nos permitió detectar una disminución gradual de mMP con ADP en células inmunitarias humanas (Figura 6E-G) y en células T esplénicas de ratones (Figura 7E-H). Si bien no comparamos directamente las células T humanas y de ratón utilizando el mismo protocolo de valoración, sí encontramos que el IC50 de las células T de ratón era menor en un factor de 10 en comparación con el de las células T circulantes de sujetos humanos. Figura 3: Experimentos de fluorrespirometría de alta resolución. (A-D) Traza de experimentos de fluorrespirometría de alta resolución utilizando concentraciones de células T de 10 millones de células/mL y 2,5 millones de células/mL en cámaras de 0,5 mL. (A) 10 millones de células/mL en cámaras de 0,5 mL. (C) 2,5 millones de células/mL en cámaras de 0,5 mL. El flujo de oxígeno (pmol/s/mL) se muestra en el panel superior (rojo) y la señal TMRM calibrada se muestra en el panel inferior (negro). Los cambios en la TMRM a lo largo del SUIT para la muestra y su fondo calculado se graficaron para las cámaras que contenían (B) 10 millones de células/mL y (D) 2,5 millones de células/mL. (E) Para cada concentración celular, se calculó el flujo de oxígeno (pmol/s/millón de células) y (F) el potencial de membrana mitocondrial. (G) Se trazó la curva de sensibilidad ADP y se ajustó a un modelo de regresión no lineal (líneas continuas). Abreviaturas: mMP, potencial de membrana mitocondrial; TMRM: éster metílico de tetrametilrodamina; SUIT, valoraciones de inhibidor de acoplador de sustrato; ADP: difosfato de adenosina; Excavar, digitonina; Mal, malato; Pyr, piruvato; Exceso, glutamato; D1-11, 11 valoraciones consecutivas de ADP; U, desacoplador FCCP de 0,5 y 1,0 μM; AMA, antimicina A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: La ATP-sintasa impulsa la disminución del potencial de membrana impulsada por ADP en células T y PBMC. (A-H) El protocolo descrito aquí se probó en PBMC y células T. Dos cámaras de O2K se inyectaron con PBMC, y dos cámaras de O2K adicional se inyectaron células T del mismo participante. Después de inyectar los sustratos malato, piruvato y glutamato en todas las cámaras, una cámara de PBMC y células T recibió oligomicina. La oligomicina evitó cualquier aumento de la respiración impulsado por el ADP en las células PBMC (A) y las células T (D) o la disminución del potencial de la membrana mitocondrial en las PBMC (B,C) y las células T (E,F). (G,H) La sensibilidad de ADP fue mayor en las PBMC en comparación con las células T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Los experimentos en blanco muestran el cambio en la fluorescencia de TMRM en respuesta al tiempo y las titulaciones de sustratos, desacopladores e inhibidores (SUIT). (A) Cambio en la fluorescencia de TMRM en respuesta a la titulación. (B) Cambio en la fluorescencia de TMRM en respuesta al tiempo. Los experimentos se llevaron a cabo en cámaras de 0,5 mL llenas de Mir05 que contenían 1 μM de TMRM. Una cámara no recibió ninguna valoración de SUIT (sin inyección); Dos cámaras en dos instrumentos diferentes recibieron un protocolo de traje estándar (inyección estándar); una cámara recibió las mismas titulaciones SUIT, pero con un retraso entre cada inyección (inyección diferida). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Diferencias en la sensibilidad de ADP entre células T y monocitos utilizando OCR y mMP. (A) Traza de un experimento de fluorespirometría de alta resolución de la muestra de monocitos y células T de un sujeto. (B) Consumo de oxígeno en monocitos (n= 11) y células T (n= 13) de la sangre de voluntarios sanos. (C,D) Ajuste de regresión no lineal del aumento de la respiración trazado con valoraciones de ADP para calcular una EC50. (E) Medición simultánea del potencial de membrana mitocondrial. (F,G) Ajuste de regresión no lineal de la disminución trazada en el potencial de membrana mitocondrial con valoraciones de ADP para calcular un IC50. (H) Parámetros de la capacidad respiratoria de los monocitos y células T. Los datos se expresan como media ± SEM para los gráficos de líneas y media ± SD para los gráficos de barras. Las diferencias estadísticamente significativas después de las pruebas t se expresan como *p < 0,05. **p < 0,01 y ****p < para 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Comparación de la respuesta de ADP en la respiración y el potencial de membrana mitocondrial (mMP) en células T esplénicas de ratón permeabilizadas e hígado. (A-D) Respuesta en la respiración en células T esplénicas de ratón permeabilizadas e hígado. (E-H) Respuesta en mMP en células T esplénicas de ratón permeabilizadas e hígado. Se diseccionaron hígado y bazo frescos de tres ratones después de una dislocación cervical. Las células T Pan esplénicas se aislaron mediante separación de perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos. Ambas muestras se sometieron al mismo protocolo SUIT en presencia de TMRM de 1 μM. (I,J) Comparación de EC50 calculada a partir del aumento del consumo de oxígeno (OCR) e IC50 a partir de la disminución de mMP en respuesta a ADP. N = 3 por grupo. Los datos se expresan como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Tabla 1: Ejemplo de protocolo SUIT para evaluar el potencial de membrana mitocondrial en linfocitos T y monocitos recién aislados utilizando cámaras de 0,5 mL. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 2: Titulación recomendada de ADP para cámara de 0,5 mL. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 3: Cálculo de la relación media de fondo utilizando cinco experimentos independientes en blanco. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 4: Cálculo del potencial de membrana mitocondrial (mMP) a partir de un experimento de muestra. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Figura complementaria 1: Efecto de Mir05 y DMSO sobre la respiración mitocondrial y el potencial de membrana. Haga clic aquí para descargar este archivo. Archivo complementario 1: Preparación de reactivos y protocolo para aislar células T del bazo de ratón. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Este protocolo utiliza fluororrespirometría de alta resolución para medir la sensibilidad de la respuesta mitocondrial a la demanda de energía mediante la medición de la disipación de mMP en respuesta al aumento de los niveles de ADP en PBMC, monocitos y células T. Esto se hace mediante la adición de sustratos complejos I y II para maximizar el potencial de la membrana mitocondrial y la titulación de ADP para estimular gradualmente la ATP-sintasa para que utilice el gradiente de protones para la generación de ATP.

Los pasos críticos en el protocolo incluyen establecer la ganancia y la intensidad del fluoróforo en 1000 y asegurarse de que se adquiera una señal fluorescente TMRM durante la valoración de TMRM. Debido a que la fluorescencia de TMRM disminuye después de cada valoración (una limitación de este método), es imperativo realizar experimentos de fondo utilizando muestras en blanco. También hemos encontrado que el DMSO tiene un efecto inhibidor sobre la respiración mitocondrial y el potencial de membrana y, por lo tanto, recomendamos diluir la solución de trabajo de TMRM en Mir05 (Figura suplementaria 1).

Algunas modificaciones que se pueden utilizar al probar este protocolo son el ajuste de las concentraciones celulares y el uso de la cámara estándar de 2 mL. Sin embargo, se prefiere la cámara de 0,5 ml para las células T y los monocitos debido a la alta concentración de células necesarias para una respuesta óptima en el potencial de membrana y el flujo de oxígeno. Una concentración más baja de células puede ser óptima cuando se analizan células con mayor capacidad respiratoria, como los macrófagos.

Las limitaciones adicionales del método presentado aquí incluyen el requisito de al menos 5 millones de células T y 2,5 millones de monocitos. A menudo podemos obtener suficientes células de ~ 20 mL de sangre de participantes sanos, pero estos números pueden variar según el estado de salud, la edad y el sexo²⁶. Además, como en la mayoría de los métodos que evalúan la capacidad mitocondrial, las células deben estar recién aisladas. Sin embargo, este método podría probarse en células criopreservadas en el futuro. En comparación con la producción de sangre humana, la producción de células T de los bazos de ratones sanos es lo suficientemente alta como para realizar este ensayo.

Las células T circulantes, en particular las células de memoria de larga duración_(TM) y las células reguladoras (Treg), dependen de la fosforilación oxidativa^{para obtener energía}. Si bien su demanda de energía y consumo de oxígeno son bajos (por ejemplo, en comparación con el del músculo en reposo), su supervivencia es esencial para una respuesta inmune efectiva a la reinfección y al cáncer 38,39,40. Una reducción en la fosforilación oxidativa de las células T resulta en una disminución de la capacidad proliferativa y promueve el agotamiento y la senescencia de las células T ^5,41. Además, la hiperpolarización mitocondrial promueve una producción sostenida de citocinas (IL-4 e IL-21) por parte de las células T efectoras CD4 durante la activación⁴². Tras la infección, el requerimiento de energía para la activación y proliferación de las células inmunitarias puede ser tan alto como el 25%-30% de la tasa metabólica basal⁴³. Por lo tanto, las células inmunitarias funcionan en una amplia y extrema gama de demandas de energía, y este protocolo puede probar las respuestas mitocondriales dentro de ese rango.

La inflamación crónica es una característica común de la obesidad, la diabetes y el envejecimiento. Los niveles desregulados de hormonas circulantes, lípidos y glucosa tienen impactos sistémicos y, por lo tanto, pueden afectar la forma en que las mitocondrias responden a un desafío energético. Aquí, hemos presentado un método para evaluar la sensibilidad mitocondrial de ADP en PBMCs circulantes. Se necesitan más estudios para determinar cómo se puede modular la sensibilidad a la ADP en la enfermedad metabólica y cómo afecta al estado de salud.

Materials

Adenosine Diphosphate	Sigma-Aldrich	A5285	Fluorespirometry
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674	Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A6003	Mir05 buffer
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A6003	Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma-Aldrich	C2920	Fluorespirometry
Cell strainers	Fisher Scientific	22-363-548	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	Cell isolation
CD3 Microbeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-101	Cell isolation
DatLab	Oroboros	Version 8
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141	Fluorespirometry
D-Sucrose	Sigma-Aldrich	84097	Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E4378	Mir05 buffer
Filter Set AmR	Oroboros	44321-01
HBSS (10x)	Gibco	12060-040
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7523	Mir05 buffer
Histopaque 1077	Sigma-Aldrich	10771	Cell isolation
K2EDTA blood collection tubes	BD Vacutainer	366643	Cell isolation
Lactobionic acid	Sigma-Aldrich	153516	Mir05 buffer
L-Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G1626	Fluorespirometry
L-Malic Acid	Sigma-Aldrich	M1000	Fluorespirometry
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M9272	Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-301	Cell isolation
O2k-Fluo Smart-Module	Oroboros	12100-03
O2k-FluoRespirometer series J	Oroboros	10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber)	Oroboros	11200-01
Oligomycin	Sigma-Aldrich	04876	Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi	130095130	Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P0662	Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	221473	Mir05 buffer
Prism	GraphPad	Version 10
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Fluorespirometry
RPMI Buffer	Corning	17-105-CV	Cell isolation
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256	Fluorespirometry
Succinate disodium salt	Sigma-Aldrich	S2378	Fluorespirometry
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625	Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite	Sigma-Aldrich	T5428	Fluorespirometry