Metoder för att studera mitokondriell bioenergetik under fysiologiskt relevanta substratkoncentrationer i immunceller är begränsade. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll som använder högupplöst fluorespiromometri för att bedöma förändringar i svaret från mitokondriell membranpotential på energibehov i humana T-celler, monocyter och perifera mononukleära celler.
Perifera mononukleära celler (PBMC) uppvisar robusta förändringar i mitokondriell andningskapacitet som svar på hälsa och sjukdom. Även om dessa förändringar inte alltid återspeglar vad som händer i andra vävnader, såsom skelettmuskulatur, är dessa celler en tillgänglig och värdefull källa till livskraftiga mitokondrier från människor. PBMC:er utsätts för systemiska signaler som påverkar deras bioenergetiska tillstånd. Att utöka våra verktyg för att undersöka mitokondriell metabolism i denna population kommer således att belysa mekanismer relaterade till sjukdomsprogression. Funktionella analyser av mitokondrier är ofta begränsade till att använda andningsutgångar efter maximala koncentrationer av substrat, hämmare och frånkopplare för att bestämma hela spektrumet av andningskapacitet, vilket kanske inte kan uppnås in vivo. Omvandlingen av adenosindifosfat (ADP) till adenosintrifosfat (ATP) av ATP-syntas resulterar i en minskning av mitokondriell membranpotential (mMP) och en ökning av syreförbrukningen. För att ge en mer integrerad analys av mitokondriell dynamik beskriver denna artikel användningen av högupplösande fluorespiromemetri för att mäta det samtidiga svaret av syreförbrukning och mitokondriell membranpotential (mMP) på fysiologiskt relevanta koncentrationer av ADP. Denna teknik använder tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) för att mäta mMP-polarisering som svar på ADP-titreringar efter maximal hyperpolarisering med komplexa I- och II-substrat. Denna teknik kan användas för att kvantifiera hur förändringar i hälsotillstånd, såsom åldrande och metabola sjukdomar, påverkar känsligheten hos mitokondriellt svar på energibehov i PBMC, T-celler och monocyter från mänskliga försökspersoner.
En cells förmåga att fungera och överleva under en period av fysiologisk stress är till stor del beroende av dess förmåga att uppfylla det energetiska behovet för att återställa homeostas 1,2. Energibehovet ökar som svar på en mängd olika stimuli. Till exempel ökar ökad muskelkontraktion under träning utnyttjandet av ATP och glukos av skelettmuskulaturen, och en ökning av proteinsyntesen efter infektion ökar utnyttjandet av ATP av immunceller för cytokinproduktion och proliferation 3,4,5,6. En ökning av energibehovet utlöser en serie bioenergetiska processer för att återställa ATP/ADP-förhållandet. När ATP konsumeras stiger ADP-nivåerna och stimulerar F1F0 ATP-syntas (komplex V), vilket kräver en protonmotorisk kraft för att driva dess mekaniska rotation och katalytiska omvandling av ADP till ATP i mitokondrien7. Protonmotorkraften är en elektrokemisk gradient som skapas genom pumpning av protoner under överföringen av elektroner från substrat till syre genom elektrontransportsystemet (ETS) i det inre mitokondriella membranet. Den resulterande skillnaden i protonkoncentration (delta pH) och elektrisk potential (membranpotential) skapar den protonmotoriska kraften som driver ATP-syntesen och syreförbrukningen som svar på energibehovet, vilket minskar ATP/ADP-förhållandet eller höjer ADP-nivåerna. Affiniteten hos mitokondrier till ADP kan bestämmas genom beräkning av Km eller EC50 av ADP-stimulerad andning av isolerade mitokondrier eller permeabiliserade celler 8,9. Denna metod har visat att permeabiliserade muskelfibrer från äldre människor kräver en större koncentration av ADP för att stimulera 50 % av deras maximala oxidativa fosforyleringskapacitet än de hos yngre försökspersoner9. På samma sätt kräver åldrande musskelettmuskler mer ADP för att sänka produktionen av mitokondriella reaktiva syreradikaler (ROS)10,11. Dessutom minskar ADP-känsligheten i permeabiliserade muskelfibrer hos möss med dietinducerad fetma i förhållande till kontroller och förbättras i närvaro av insulin och efter nitratkonsumtion12,13. Mitokondriernas förmåga att svara på energibehov varierar alltså under olika fysiologiska förhållanden, men detta har inte tidigare utforskats i samband med immunceller.
Mononukleära celler i perifert blod (PBMC) används ofta för att undersöka cellulär bioenergetik hos människor 14,15,16,17,18,19,20. Detta beror till stor del på att celler är lätta att få från okoagulerade blodprover i kliniska studier, cellernas känslighet för metabola störningar och de metoder som utvecklats av olika grupper för att undersöka mitokondriell metabolism genom att använda inhibitorer och uncouplers för att bestämma den maximala och minimala kapaciteten hos mitokondriell andning21,22. Dessa metoder har lett till en uppskattning av bioenergetikens roll i åldrande, metabola sjukdomar och immunfunktion 14,20,23,24. Mitokondriell andningskapacitet är ofta nedsatt i skelettmuskulatur och PBMC under tillstånd av hjärtsvikt18,25. PBMC-bioenergetiska ämnen är också korrelerade med kardiometabola riskfaktorer hos friska vuxna17 och svarar på behandlingar som nikotinamidribosid18. PBMC inkluderar neutrofiler, lymfocyter (B-celler och T-celler), monocyter, naturliga mördarceller och dendritiska celler, som alla bidrar till PBMC:s mitokondriella kapacitet 26,27,28. Dessutom spelar cellulära bioenergetiska ämnen en avgörande roll för aktivering, proliferation och förnyelse av immunceller23. En begränsning med dessa metoder är dock att cellerna inte fungerar under ett fysiologiskt intervall av substrat. Ytterligare metoder krävs därför för att undersöka mitokondriell funktion i substratkoncentrationer som är mer relevanta för vad celler upplever in vivo.
Mitokondriell membranpotential (mMP) är huvudkomponenten i en protonmotorisk kraft och är avgörande för en mängd olika mitokondriella processer utöver ATP-produktion, såsom reglering av andningsflöde, produktion av reaktiva syreradikaler, import av protein och joner, autofagi och apoptos. mMP kan bedömas med elektrokemiska sonder eller fluorescerande färgämnen som är känsliga för förändringar i membranpolarisering som JC-1, Rhod123, DiOC6, tetrametylrhodamin (TMRE) eller metylester (TMRM) och safranin. De två senare är lipofila katjoniska färgämnen som framgångsrikt har använts i högupplöst fluorespirometri av vävnadshomogenater, isolerade mitokondrier och permeabiliserad vävnad 11,29,30,31,32,33. I denna teknik används TMRM i släckningsläge, där celler utsätts för en hög koncentration av TMRM som ackumuleras i mitokondriell matris när den polariseras (hög mMP och protonisk kraft), vilket resulterar i släckning av cytosolisk TMRM-fluorescens. När mitokondrier depolariseras som svar på ADP eller kopplare frigörs färgämnet från matrisen, vilket ökar TMRM-fluorescerande signal34,35. Syftet med denna metod är att samtidigt mäta förändringar i mitokondriell andning och mMP som svar på ADP-titreringar i PBMC från människa, cirkulerande monocyter och T-celler, och den kan också tillämpas på Mjält-T-celler hos möss.
Detta protokoll använder högupplöst fluorespiromemetri för att mäta känsligheten hos det mitokondriella svaret på energibehov genom att mäta förlusten av mMP som svar på ökande nivåer av ADP i PBMC, monocyter och T-celler. Detta görs genom att tillsätta komplexa I- och II-substrat för att maximera mitokondriernas membranpotential och titrera ADP för att gradvis stimulera ATP-syntas för att använda protongradienten för ATP-generering.
Kritiska steg i protokollet inkluderar att ställa in fluoroforens förstärkning och intensitet till 1000 och se till att en TMRM-fluorescerande signal förvärvas under TMRM-titreringen. Eftersom TMRM-fluorescensen minskar efter varje titrering (en begränsning med denna metod) är det absolut nödvändigt att köra bakgrundsexperiment med tomma prover. Vi har också funnit att DMSO har en hämmande effekt på mitokondriell andning och membranpotential och rekommenderar därför spädning av arbetslösningen av TMRM i Mir05 (Kompletterande Figur 1).
Några modifieringar som kan användas när du provar detta protokoll är att justera cellkoncentrationerna och använda standardkammaren på 2 ml. Kammaren på 0,5 ml är dock att föredra för T-celler och monocyter på grund av den höga koncentrationen av celler som behövs för optimal respons på membranpotential och syreflöde. En lägre koncentration av celler kan vara optimal när man testar celler med större andningskapacitet, som makrofager.
Ytterligare begränsningar med den metod som presenteras här är kravet på minst 5 miljoner T-celler och 2,5 miljoner monocyter. Vi kan ofta få tillräckligt med celler från ~20 ml blod från friska deltagare, men dessa siffror kan variera beroende på hälsotillstånd, ålder och kön26. Dessutom, som i de flesta metoder för att bedöma mitokondriell kapacitet, måste cellerna isoleras på nytt. Denna metod skulle dock kunna testas i kryokonserverade celler i framtiden. I jämförelse med utbytet från mänskligt blod är T-cellsutbytet från mjälten hos friska möss tillräckligt högt för att utföra denna analys.
Cirkulerande T-celler, särskilt långlivade minnesceller (TM) och regulatoriska celler (Treg), är beroende av oxidativ fosforylering för energi37. Även om deras energibehov och syreförbrukning är låga (t.ex. jämfört med den för vilande muskler), är deras överlevnad avgörande för ett effektivt immunsvar mot återinfektion och cancer 38,39,40. En minskning av T-cells oxidativ fosforylering resulterar i försämrad proliferativ kapacitet och främjar T-cellsutmattning och åldrande 5,41. Dessutom främjar mitokondriell hyperpolarisering en ihållande produktion av cytokiner (IL-4 och IL-21) av effektorns CD4 T-celler under aktivering42. Vid infektion kan energibehovet för aktivering och proliferation av immunceller vara så högt som 25%-30% av den basala ämnesomsättningen43. Därför fungerar immunceller inom ett brett och extremt spektrum av energibehov, och detta protokoll kan testa mitokondriella svar inom det intervallet.
Kronisk inflammation är ett vanligt inslag i fetma, diabetes och åldrande. Dysreglerade nivåer av cirkulerande hormoner, lipider och glukos har systemiska effekter och kan därmed påverka hur mitokondrier svarar på en energetisk utmaning. Här har vi presenterat en metod för att bedöma mitokondriell ADP-känslighet i cirkulerande PBMC. Ytterligare studier behövs för att avgöra hur ADP-känslighet kan moduleras vid metabol sjukdom och hur det påverkar hälsotillståndet.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka de vänliga volontärer som donerade blod till detta projekt. Vi uttrycker också vår uppriktiga uppskattning till Dr. Ellen Schur och hennes team för att ha försett oss med ytterligare prover från deras studie. Vi vill också tacka Andrew Kirsh för att ha granskat manuskriptet och redigerat det för läsbarhet. Detta arbete stöddes av följande finansieringskällor: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.
Adenosine Diphosphate | Sigma-Aldrich | A5285 | Fluorespirometry |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Fluorespirometry |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | Mir05 buffer |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | Cell isolation |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | Fluorespirometry |
Cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Cell isolation |
CD3 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | Cell isolation |
DatLab | Oroboros | Version 8 | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Fluorespirometry |
D-Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Mir05 buffer |
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | Mir05 buffer |
Filter Set AmR | Oroboros | 44321-01 | |
HBSS (10x) | Gibco | 12060-040 | |
HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7523 | Mir05 buffer |
Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell isolation |
K2EDTA blood collection tubes | BD Vacutainer | 366643 | Cell isolation |
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | Mir05 buffer |
L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | Fluorespirometry |
L-Malic Acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Fluorespirometry |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Cell isolation |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | Mir05 buffer |
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | Cell isolation |
O2k-Fluo Smart-Module | Oroboros | 12100-03 | |
O2k-FluoRespirometer series J | Oroboros | 10201-03 | |
O2k-sV-Module (0.5 chamber) | Oroboros | 11200-01 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 04876 | Fluorespirometry |
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi | 130095130 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | Mir05 buffer |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | Mir05 buffer |
Prism | GraphPad | Version 10 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Fluorespirometry |
RPMI Buffer | Corning | 17-105-CV | Cell isolation |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Fluorespirometry |
Succinate disodium salt | Sigma-Aldrich | S2378 | Fluorespirometry |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Mir05 buffer |
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite | Sigma-Aldrich | T5428 | Fluorespirometry |