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Biology

मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में गतिशील परिवर्तनों का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री

Published: May 24, 2024
doi:
10.3791/66863
, , ,
1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, Department of Medicine,University of Washington, 2Department of Radiology,University of Washington, 3Department of Laboratory Medicine and Pathology,University of Washington

Summary

प्रतिरक्षा कोशिकाओं में शारीरिक रूप से प्रासंगिक सब्सट्रेट सांद्रता के तहत माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनेरगेटिक्स का अध्ययन करने के तरीके सीमित हैं। हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो मानव टी-कोशिकाओं, मोनोसाइट्स और परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं में ऊर्जा की मांग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता की प्रतिक्रिया में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री का उपयोग करता है।

Abstract

परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं (पीबीएमसी) स्वास्थ्य और बीमारी के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता में मजबूत परिवर्तन प्रदर्शित करती हैं। हालांकि ये परिवर्तन हमेशा अन्य ऊतकों में क्या होता है, जैसे कि कंकाल की मांसपेशी, ये कोशिकाएं मानव विषयों से व्यवहार्य माइटोकॉन्ड्रिया का एक सुलभ और मूल्यवान स्रोत हैं। PBMCs प्रणालीगत संकेतों के संपर्क में आते हैं जो उनकी बायोएनेरगेटिक स्थिति को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, इस आबादी में माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय से पूछताछ करने के लिए हमारे उपकरणों का विस्तार रोग की प्रगति से संबंधित तंत्र को स्पष्ट करेगा। माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक परख अक्सर श्वसन क्षमता की पूरी श्रृंखला निर्धारित करने के लिए अधिकतम सब्सट्रेट, अवरोधक और अनकपलर सांद्रता के बाद श्वसन आउटपुट का उपयोग करने तक सीमित होते हैं, जो विवो में प्राप्त करने योग्य नहीं हो सकता है। एटीपी-सिंथेज़ द्वारा एडेनोसिन डाइफॉस्फेट (एडीपी) को एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) में बदलने से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) में कमी और ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि होती है। माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता का अधिक एकीकृत विश्लेषण प्रदान करने के लिए, यह आलेख एडीपी की शारीरिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता के लिए ऑक्सीजन की खपत और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपीपी) की एक साथ प्रतिक्रिया को मापने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री के उपयोग का वर्णन करता है। यह तकनीक जटिल I और II सब्सट्रेट के साथ अधिकतम हाइपरपोलराइजेशन के बाद ADP अनुमापन के जवाब में mMP ध्रुवीकरण को मापने के लिए टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइलस्टर (TMRM) का उपयोग करती है। इस तकनीक का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि स्वास्थ्य की स्थिति में परिवर्तन, जैसे कि उम्र बढ़ने और चयापचय संबंधी रोग, पीबीएमसी में ऊर्जा की मांग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता को प्रभावित करते हैं, टी-कोशिकाओं और मानव विषयों से मोनोसाइट्स।

Introduction

शारीरिक तनाव की अवधि में कार्य करने और जीवित रहने की एक सेल की क्षमता काफी हद तक होमियोस्टैसिस 1,2 को बहाल करने के लिए ऊर्जावान आवश्यकता को पूरा करने की क्षमता पर निर्भर है। विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं के जवाब में ऊर्जा की मांग बढ़ जाती है। उदाहरण के लिए, व्यायाम के दौरान मांसपेशियों के संकुचन में वृद्धि कंकाल की मांसपेशी द्वारा एटीपी और ग्लूकोज के उपयोग बढ़ जाती है, और संक्रमण के बाद प्रोटीन संश्लेषण में वृद्धि साइटोकिन उत्पादन और प्रसार 3,4,5,6 के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा एटीपी के उपयोग बढ़ जाती है. ऊर्जा की मांग में वृद्धि एटीपी/एडीपी अनुपात को बहाल करने के लिए बायोएनेरजेटिक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला को ट्रिगर करती है। जैसा कि एटीपी का उपभोग किया जाता है, एडीपी का स्तर बढ़ता है और एफ1एफ0 एटीपी-सिंथेज़ (जटिल वी) को उत्तेजित करता है, जिसके लिए माइटोकॉन्ड्रियन7 के भीतर एटीपी के यांत्रिक रोटेशन और एडीपी के उत्प्रेरक रूपांतरण को चलाने के लिए एक प्रोटॉनमोटिव बल की आवश्यकता होती है। प्रोटॉनमोटिव बल एक विद्युत रासायनिक ढाल है जो आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली के भीतर इलेक्ट्रॉन परिवहन प्रणाली (ईटीएस) के माध्यम से सब्सट्रेट से ऑक्सीजन तक इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण के दौरान प्रोटॉन के पंपिंग द्वारा बनाया गया है। प्रोटॉन एकाग्रता (डेल्टा पीएच) और विद्युत क्षमता (झिल्ली क्षमता) में परिणामी अंतर प्रोटॉनमोटिव बल बनाता है जो ऊर्जा की मांग के जवाब में एटीपी संश्लेषण और ऑक्सीजन की खपत को चलाता है, एटीपी/एडीपी अनुपात को कम करता है या एडीपी स्तर बढ़ाता है। एडीपी के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की आत्मीयता अलग माइटोकॉन्ड्रिया या पारगम्य कोशिकाओं 8,9 के एडीपी-उत्तेजित श्वसनके कश्मीर या ईसी50 की गणना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। इस विधि से पता चला है कि पुराने मनुष्यों से पारगम्य मांसपेशी फाइबर एडीपी की एक बड़ी एकाग्रता की आवश्यकता होती है युवा विषयों9 की तुलना में उनके अधिकतम ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण क्षमता का 50% को उत्तेजित करने के लिए. इसी तरह, उम्र बढ़ने माउस कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)10,11के उत्पादन को कम करने के लिए अधिक एडीपी की आवश्यकता होती है. इसके अतिरिक्त, एडीपी संवेदनशीलता नियंत्रण के सापेक्ष आहार प्रेरित मोटापे के साथ चूहों की पारगम्य मांसपेशी फाइबर में कम हो जाती है और इंसुलिन की उपस्थिति में और नाइट्रेट की खपत12,13 के बाद बढ़ाया जाता है. इस प्रकार, ऊर्जा की मांग का जवाब देने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की क्षमता विभिन्न शारीरिक स्थितियों में भिन्न होती है, लेकिन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संदर्भ में पहले इसका पता नहीं लगाया गया है।

परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) का उपयोग आमतौर पर मानव विषयों 14,15,16,17,18,19,20में सेलुलर बायोएनेरगेटिक्स की जांच के लिए किया जाता है। यह काफी हद तक कोशिकाओं नैदानिक अध्ययन में uncoagulated रक्त के नमूनों से आसानी से प्राप्य किया जा रहा है, चयापचय गड़बड़ी के लिए कोशिकाओं की जवाबदेही, और तरीकों से inhibitors और uncouplers का उपयोग करके mitochondrial चयापचय पूछताछ करने के लिए विभिन्न समूहों द्वारा विकसित तरीकों माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन21,22 की अधिकतम और न्यूनतम क्षमता निर्धारित करने के लिए. इन तरीकों से उम्र बढ़ने, चयापचय रोग और प्रतिरक्षा समारोह 14,20,23,24में बायोएनेरगेटिक्स की भूमिकाओं की सराहना हुई है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता अक्सर कंकाल की मांसपेशी और पीबीएमसी में दिल की विफलता18,25 की शर्तों के तहत कम हो जाती है। पीबीएमसी बायोएनेरगेटिक्स स्वस्थ वयस्कों17 में कार्डियोमेटाबोलिक जोखिम कारकों के साथ भी सहसंबद्ध हैं और निकोटिनमाइड राइबोसाइड18 जैसे उपचारों के लिए उत्तरदायी हैं। पीबीएमसी में न्यूट्रोफिल, लिम्फोसाइट्स (बी-कोशिकाएं और टी-कोशिकाएं), मोनोसाइट्स, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाएं और डेंड्राइटिक कोशिकाएं शामिल हैं, जो सभी पीबीएमसी माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता 26,27,28में योगदान करते हैं। इसके अलावा, सेलुलर bioenergetics प्रतिरक्षा सेल सक्रियण, प्रसार, औरनवीकरण 23 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. हालांकि, इन विधियों की एक सीमा यह है कि कोशिकाएं सब्सट्रेट की शारीरिक सीमा के तहत काम नहीं कर रही हैं। इसलिए सब्सट्रेट सांद्रता में माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से पूछताछ करने के लिए अतिरिक्त तरीकों की आवश्यकता होती है जो विवो में कोशिकाओं के अनुभव के लिए अधिक प्रासंगिक हैं।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपीपी) एक प्रोटॉनमोटिव बल का प्रमुख घटक है और एटीपी उत्पादन से परे विभिन्न प्रकार की माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है, जैसे श्वसन प्रवाह का विनियमन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन, प्रोटीन और आयन आयात, ऑटोफैगी और एपोप्टोसिस। एमएमपी का मूल्यांकन इलेक्ट्रोकेमिकल जांच या फ्लोरोसेंट रंगों के साथ किया जा सकता है जो झिल्ली ध्रुवीकरण जैसे जेसी -1, रोड 123, डीआईओसी6, टेट्रामेथिल रोडामाइन (टीएमआरई) या मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम), और सैफ्रानिन में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हैं। बाद के दो लिपोफिलिक धनायनित रंजक हैं जिनका उपयोग ऊतक समरूपताओं, पृथक माइटोकॉन्ड्रिया और पारगम्य ऊतक 11,29,30,31,32,33के उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री में सफलतापूर्वक किया गया है। इस तकनीक में, टीएमआरएम का उपयोग क्वेंच मोड में किया जाता है, जहां कोशिकाओं को टीएमआरएम की उच्च सांद्रता से अवगत कराया जाता है जो ध्रुवीकृत (उच्च एमएमपी और प्रोटॉनमोटिव बल) होने पर माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में जमा होता है, जिसके परिणामस्वरूप साइटोसोलिक टीएमआरएम प्रतिदीप्ति का शमन होता है। जब एडीपी या अनकपलर्स के जवाब में माइटोकॉन्ड्रिया विध्रुवण करते हैं, तो डाई मैट्रिक्स से जारी की जाती है, जिससे टीएमआरएम फ्लोरोसेंट सिग्नल34,35 बढ़ जाता है। इस पद्धति का उद्देश्य मानव-व्युत्पन्न पीबीएमसी में एडीपी अनुमापन के जवाब में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और एमएमपी में परिवर्तन को एक साथ मापना है, मोनोसाइट्स और टी-कोशिकाओं को प्रसारित करना है, और इसे माउस प्लीहा टी-कोशिकाओं पर भी लागू किया जा सकता है।

Protocol

यहां प्रस्तुत डेटा और विधियों के विकास के लिए रक्त के नमूनों के संग्रह को वाशिंगटन विश्वविद्यालय के आंतरिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रतिनिधि परिणामों में जैक्सन प्रयोगशालाओं से खरीदे गए पुरुष C57BL/6J चूहों (5-7 महीने पुराने) के डेटा भी शामिल हैं। सभी पशु प्रक्रियाओं को वाशिंगटन विश्वविद्यालय के पशु कल्याण कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल अवलोकन चित्रा 1 में चित्रित किया गया है. इस प्रोटोकॉल के लिए अभिकर्मक तैयारी पूरक फ़ाइल 1 में पाया जा सकता है. चित्रा 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन। ताजा मानव रक्त के नमूनों से पृथक मोनोसाइट्स (सीडी 14 +) और टी-कोशिकाओं (सीडी 3 +) में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री का उपयोग करके वर्कफ़्लो। संक्षिप्ताक्षर: टीएमआरएम, टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर; सूट, सब्सट्रेट-अनकपलर-अवरोधक अनुमापन; एडीपी, एडेनोसिन डिफॉस्फेट; खोदो, डिजिटोनिन; मल, मैलेट; पायर, पाइरूवेट; ग्लूट, ग्लूटामेट; डी 1-10, लगातार 10 एडीपी अनुमापन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 1. पूरे रक्त से बफी कोट का पृथक्करण नोट: सेल अलगाव क्रेमर एट अल.27से संशोधित किया गया है। RPMI, घनत्व ढाल और अपकेंद्रित्र को कमरे के तापमान तक पहुंचने दें। शुरू करने से पहले जैव सुरक्षा कैबिनेट और सामग्री को स्टरलाइज़ करें। तीन 10 एमएल के2ईडीटीए ट्यूबों में शिरापरक रक्त लीजिए। ट्यूबों को कम से कम 3 बार पलटें। 500 x ग्राम 10 मिनट (22 डिग्री सेल्सियस, 9 त्वरण [एसीसी], 2 मंदी [दिसंबर]) पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। प्रत्येक ट्यूब से प्लाज्मा के 1 एमएल निकालें और भविष्य के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्लाज्मा और आधा लाल रक्त कोशिका परत प्रत्येक ट्यूब से एक एकल 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण. 40 एमएल निशान तक आरपीएम जोड़ें। कम से कम 3 बार पलटें। धीरे-धीरे प्लाज्मा समाधान के 10 एमएल को चार 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में परत करें जिसमें घनत्व ढाल के 3 एमएल हों। 30 मिनट (22 डिग्री सेल्सियस, 5 एसीसी, 2 दिसंबर) के लिए 700 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। लाल रक्त कोशिकाओं को बाधित किए बिना परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) युक्त सभी प्लाज्मा और बफी कोट एकत्र करें। 10 मिनट (22 डिग्री सेल्सियस, 5 एसीसी, 5 दिसंबर) के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें। पीबीएमसी गोली 1x-2x को आरपीएमआई के 10 एमएल में निलंबित करके और 10 मिनट (22 डिग्री सेल्सियस, 5 एसीसी, 5 दिसंबर) के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके धोएं। 2. CD14+ और CD3+ कोशिकाओं का चुंबकीय पृथक्करण चुंबकीय सेल विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एक स्तंभ रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। आरपी-5 के 3 एमएल के साथ स्तंभ धो लें. आरपी -5 के 80 माइक्रोन और एंटी-सीडी 14 माइक्रोबीड्स के 20 माइक्रोन में पीबीएमसी गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। आरपी -5 के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और स्तंभ पर निलंबन लोड करें। “फ्लो-थ्रू 1” लेबल वाले 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बहने वाली बिना लेबल वाली कोशिकाओं को इकट्ठा करें। रुको जब तक सभी सेल निलंबन स्तंभ के माध्यम से चला गया है, तो आरपी -5 3x के 3 एमएल के साथ धोने जारी है, सभी प्रवाह के माध्यम से एकत्र. ध्यान से चुंबकीय क्षेत्र से स्तंभ को हटा दें और इसे एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर रखें। आरपी-5 के 5 एमएल जोड़ें और तुरंत “सीडी 14 +” लेबल एक संग्रह ट्यूब में स्तंभ सामग्री शुद्ध करने के लिए सवार का उपयोग करें. अपकेंद्रित्र “फ्लो-थ्रू 1” 10 मिनट (22 डिग्री सेल्सियस, 5 एसीसी, 5 दिसंबर) के लिए 500 x ग्राम पर और सतह पर तैरनेवाला महाप्राण करें। फ्लो-थ्रू 1 से कोशिकाओं का उपयोग करना, टी-कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंटी-सीडी 3 माइक्रोबीड्स (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके चरण 2.2-2.5 दोहराएं। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर टी-कोशिकाओं (सीडी 3 +) और मोनोसाइट्स (सीडी 14 +) युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूब। सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और आरपी 5 के 1 एमएल में गोली resuspend. एक हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता निर्धारित करें।नोट: कोशिकाओं को हेमोसाइटोमीटर में 1:10 या 1:20 के सेल कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोन जोड़कर गिना जा सकता है। एक हेमोसाइटोमीटर36 का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती करने के लिए पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल का उल्लेख कर सकते हैं. पिपेट 2.5 मिलियन मोनोसाइट्स या 5 मिलियन टी-कोशिकाओं को एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में। 2000 x ग्राम पर 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला महाप्राण और 20 माइक्रोन की कुल मात्रा और 125 मिलियन मोनोसाइट्स या 250 मिलियन टी-कोशिकाओं प्रति एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए एमआईआर 05 में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।नोट: अंतिम एकाग्रता को 20 माइक्रोन की मात्रा में 2.5 मिलियन मोनोसाइट्स या 5 मिलियन टी-कोशिकाओं को इंजेक्ट करने के लिए चुना गया था। प्लीहा से अलग माउस टी-कोशिकाओं को भी इस विधि का उपयोग करके परीक्षण किया गया है। प्रक्रिया पूरक फ़ाइल 1 में पाई जाती है। 3. उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री – ऑक्सीजन और टीएमआरएम प्रतिदीप्ति अंशांकन नोट: इस विधि फिरौन एट अल11द्वारा permeabilized फाइबर पर किए गए पिछले काम से अनुकूलित किया गया था. टीएमआरएम की एक उच्च, गैर-निरोधात्मक एकाग्रता का उपयोग शमन मोड के लिए किया जाता है, जहां मैट्रिक्स में एमएमपी और टीएमआरएम एकाग्रता का संबंध उलटा होता है। इस प्रकार, एमएमपी में कमी मैट्रिक्स से टीएमआरएम डाई की रिहाई औरप्रतिदीप्ति 32 में वृद्धि की ओर जाता है। निर्माता के निर्देशों के अनुसार O2K रेस्पिरोमीटर में 0.5 एमएल कक्ष स्थापित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। उपकरण चालू करें और इसे डेटा अधिग्रहण के लिए निर्माता द्वारा प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर से कनेक्ट करें। तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें और गति को 750 आरपीएम तक हिलाएं। कक्षों को आसुत जल 3x से धोएं। Mir05 के 0.54 एमएल के साथ पानी बदलें, स्टॉपर्स को पूरी तरह से बंद करें, और एकीकृत सक्शन सिस्टम (आईएसएस) के साथ अतिरिक्त बफर को हटा दें। स्टॉपर-स्पेसर का उपयोग करके चैम्बर ऑक्सीजन के साथ संतुलन बनाने के लिए कमरे की ऑक्सीजन की अनुमति देने के लिए स्टॉपर्स बढ़ाएं। एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार वायु ऑक्सीजन अंशांकन (R1) करें।नोट: ऑक्सीजन प्रवाह को स्थिर करने में >30 मिनट लग सकते हैं। ऑक्सीजन सेंसर को डाइथियोनाइट टाइट्रेशन का उपयोग करके अलग-अलग प्रयोगों से 50-200 माइक्रोन से शून्य-बिंदु ऑक्सीजन (आर0) और पृष्ठभूमि ऑक्सीजन प्रवाह के निर्धारण की आवश्यकता होती है। निर्माता के मैनुअल में विशिष्ट तरीके पाए जा सकते हैं। स्टॉपर्स को बंद करके चैंबर को सील करें।नोट: पारगम्य फाइबर का उपयोग कर प्रयोगों के विपरीत, कक्षों PBMCs के लिए hyperoxygenation की आवश्यकता नहीं है. R1 अंशांकन के बाद चैम्बर सील प्रयोग के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन प्रदान करता है. ऑक्सीजन का स्तर 50-250 माइक्रोन के बीच बनाए रखा जाना चाहिए। यदि ऑक्सीजन एकाग्रता दहलीज से नीचे आती है, तो कक्ष को आंशिक रूप से खोला जा सकता है ताकि कक्ष ऑक्सीजन कमरे की वायु ऑक्सीजन के साथ संतुलित हो सके। टीएमआरएम अंशांकनएएमआर फिल्टर सेट के साथ ग्रीन एलईडी फ्लो-सेंसर (पूर्व 525 एनएम) का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)। फ्लोरोमीटर लाभ को 1000 और तीव्रता को 1000 पर सेट करें। फ्लो-सेंसर चालू करें और बेसलाइन रिकॉर्ड करना शुरू करें। 0.05 एमएम टीएमआरएम के 2.5 माइक्रोन इंजेक्ट करें और अगले 2.5 माइक्रोन इंजेक्शन से पहले सिग्नल को स्थिर (~ 2 मिनट) करने की अनुमति दें जब तक कि चैम्बर में 1 माइक्रोन टीएमआरएम की कुल टीएमआरएम एकाग्रता के लिए कुल 4 इंजेक्शन नहीं किए जाते हैं। सभी इंजेक्शन के लिए एक हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग करें। पांच बिंदु अंशांकन के लिए टीएमआरएम के 0, 0.25, 0.5, 0.75 और 1.0 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रत्येक इंजेक्शन के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल (वोल्टेज) का चयन करके फ्लो-सेंसर को कैलिब्रेट करें। 4. सब्सट्रेट-अनकपलर-अवरोधक अनुमापन (SUIT) प्रोटोकॉल नोट: रिक्त प्रयोगों को चलाएं जहां मिर05 के 20 माइक्रोन को सेल निलंबन के 20 माइक्रोन के बजाय कक्ष में इंजेक्ट किया जाता है, क्योंकि टीएमआरएम सिग्नल अकेले इंजेक्शन के जवाब में बदल जाएगा (प्रतिनिधि परिणामों में चर्चा की गई)। ऑक्सीजन प्रवाह संकेत दोनों रिक्त और नमूना प्रयोगों के लिए अगले इंजेक्शन से पहले (लगभग 2-3 मिनट) स्थिर करने के लिए अनुमति दें. निम्नलिखित अनुमापन प्रोटोकॉल और अपेक्षित अवलोकन तालिका 1 में हैं। एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, ऑक्सीजन प्रवाह और टीएमआरएम सिग्नल “प्री-सेल” दोनों का चयन करें और लेबल करें। ~ 20 माइक्रोन में 5 मिलियन टी-कोशिकाओं या 2.5 मिलियन मोनोसाइट्स युक्त सेल निलंबन को इंजेक्ट करें और लगभग 10 मिनट के लिए उपाय करें। ऑक्सीजन फ्लक्स और टीएमआरएम सिग्नल दोनों को “सेल” के रूप में चुनें और लेबल करें। 1 मिलीग्राम/एमएल डिजिटोनिन (अंतिम एकाग्रता: 4 माइक्रोग्राम/एमएल) के 2 माइक्रोन को इंजेक्ट करके कोशिकाओं को पारगम्य बनाएं। 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. ऑक्सीजन फ्लक्स और टीएमआरएम सिग्नल दोनों को “डिग” के रूप में चुनें और लेबल करें।नोट: अलग-अलग प्रयोगों में डिजिटोनिन एकाग्रता को अनुकूलित करने का सुझाव दिया गया है। 1 एम succinate (अंतिम एकाग्रता: 5 मिमी) के 2.5 माइक्रोन जोड़ें। ऑक्सीजन फ्लक्स और टीएमआरएम सिग्नल दोनों को “एसयूसीसी” के रूप में चुनें और लेबल करें। एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर है, 100 मिमी पालना (अंतिम एकाग्रता: 1.0 मिमी), 1 एम ग्लूटामेट के 5 माइक्रोन (अंतिम एकाग्रता: 10 मिमी), और 500 मिमी पाइरूवेट के 5 माइक्रोन (अंतिम एकाग्रता: 5 मिमी) जोड़ें। ऑक्सीजन फ्लक्स और टीएमआरएम सिग्नल दोनों को “एमपीजी” के रूप में चुनें और लेबल करें। एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, एडीपी का अनुमापन करें। प्रत्येक अनुमापन के लिए दरों का चयन करें और अनुमापन की संख्या के आधार पर उन्हें क्रमिक रूप से 1 से 10 तक “डी” लेबल करें। तालिका 2 में अनुमापन योजना का उपयोग करें। एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, फ्लोरोसेंट सिग्नल अपने अधिकतम तक पहुंचने तक 0.25 मिमी कार्बोनिल साइनाइड पी- (त्रि-फ्लुरोमेथॉक्सी) फिनाइल-हाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) के 1 माइक्रोन अनुमापन की एक श्रृंखला करें। न्यूनतम झिल्ली क्षमता का प्रतिनिधित्व करने वाले ऑक्सीजन प्रवाह और टीएमआरएम सिग्नल दोनों का चयन करें और लेबल करें और इसे “एफसीसीपी” लेबल करें।नोट: 0.5-1.0 माइक्रोन की एफसीसीपी एकाग्रता आमतौर पर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को समाप्त करने के लिए आवश्यक है।चेतावनी: एफसीसीपी विषाक्त है। उचित हैंडलिंग के लिए सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) देखें। वैकल्पिक: एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर है, जटिल मैं को बाधित करने और जटिल द्वितीय के माध्यम से श्वसन क्षमता का निर्धारण करने के लिए 0.25 मिमी rotenone के 1 μL इंजेक्षन.नोट: झिल्ली क्षमता में परिवर्तन अब uncoupled के साथ अनुमापन के बाद प्रासंगिक नहीं हैं.चेतावनी: रोटेनोन विषाक्त है। उचित हैंडलिंग के लिए एसडीएस देखें। एक बार ऑक्सीजन प्रवाह स्थिर होने के बाद, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को बाधित करने के लिए एंटीमाइसिन ए के 1.25 एमएम (अंतिम एकाग्रता: 2.5 माइक्रोन) के 1 माइक्रोन इंजेक्ट करें।चेतावनी: एंटीमाइसिन ए विषाक्त है। उचित हैंडलिंग के लिए एसडीएस देखें। 5. माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और विश्लेषण की गणना रिक्त प्रयोगों का उपयोग करना, रिक्त नमूना (“पूर्व नमूना”) के इंजेक्शन से पहले और इंजेक्शन में से प्रत्येक के लिए calibrated TMRM मूल्यों (micromolar TMRM) रिकॉर्ड. चित्र 2 देखें। प्रत्येक रिक्त प्रयोग के लिए, 1.0 के लिए “पूर्व नमूना” टीएमआरएम एकाग्रता की स्थापना करके पृष्ठभूमि अनुपात की गणना. टीएमआरएम में बाद में आनुपातिक कमी की गणना करें। सभी रिक्त प्रयोगों से औसत पृष्ठभूमि अनुपात की गणना.नोट: शामिल करने के लिए रिक्त प्रयोगों की संख्या साधन की सटीकता पर निर्भर हो सकता है. पांच अलग-अलग रिक्त प्रयोगों से तालिका 3 में गणना उदाहरण देखें, जहां औसत पृष्ठभूमि अनुपात का मानक विचलन प्रत्येक अनुमापन के लिए 0 और 0.016 के बीच गिर गया। पृष्ठभूमि गणना: नमूना प्रयोग के “पूर्व नमूना” TMRM गुणा करके प्रत्येक नमूना प्रयोग के लिए पृष्ठभूमि की गणना प्रत्येक इंजेक्शन के लिए औसत पृष्ठभूमि अनुपात. तालिका 3 में गणना उदाहरण देखें। पृष्ठभूमि सुधार: नमूने के मापा टीएमआरएम मूल्यों के लिए प्रयोग की पृष्ठभूमि घटाना. तालिका 4 में गणना उदाहरण देखें। FCCP सुधार: प्रत्येक इंजेक्शन से FCCP पृष्ठभूमि-सही mMP घटाएं। तालिका 4 में गणना उदाहरण देखें। ADP संवेदनशीलता वक्र: ADP अनुमापन भर में एकत्र mMP मूल्यों का उपयोग करके, क्रमशः 100% और 0% के रूप में उच्चतम और निम्नतम झिल्ली क्षमता सेट करके mMP में ADP संचालित कमी को सामान्य करें। एमएमपी पर एडीपी के आधे-अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता (आईसी50) की गणना करने के लिए पसंदीदा सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा को गैर-रैखिक फिट प्रतिगमन मॉडल में फिट करें।नोट: वक्र [अवरोधक] बनाम सामान्यीकृत प्रतिक्रिया फिट बैठता है – प्रिज्म में चर ढलान। चित्रा 2: टीएमआरएम प्रतिदीप्ति से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपी) और एडीपी संवेदनशीलता की गणना। टी-कोशिकाओं के एक नमूने (एन = 1) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री द्वारा टीएमआरएम प्रतिदीप्ति के माप से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपी) और एडीपी संवेदनशीलता की गणना के लिए कदम। चरण 1: टीएमआरएम प्रतिदीप्ति को रिक्त नमूनों में मापा जाता है जैसा कि जैविक नमूने में किया जाता है। चरण 2: प्रत्येक रिक्त प्रयोग के लिए नमूना से पहले संकेत के सापेक्ष प्रत्येक अनुमापन के साथ टीएमआरएम संकेत में अनुपात निर्धारित करें। सभी रिक्त प्रयोगों के प्रत्येक अनुमापन के लिए औसत की गणना. चरण 3: प्रत्येक अनुमापन के लिए औसत पृष्ठभूमि अनुपात से “पूर्व नमूना” प्रतिदीप्ति गुणा करके प्रत्येक नमूना प्रयोग के लिए पृष्ठभूमि की गणना. चरण 4: mMP या mitochondrial TMRM तेज के रूप में डेटा व्यक्त करने के लिए प्रत्येक अनुमापन के लिए पृष्ठभूमि और नमूना TMRM प्रतिदीप्ति के बीच अंतर की गणना. चरण 5: सही mMP ताकि FCCP के साथ पूर्ण uncoupling शून्य mMP को दर्शाता है। चरण 6: एडीपी सांद्रता बढ़ाने के साथ एमएमपी में ग्राफ परिवर्तनों के लिए गैर-रैखिक प्रतिगमन करें। माप 0.5 एमएल कक्षों में प्रदर्शन किया गया, एक स्वस्थ स्वयंसेवक से 5 लाख टी कोशिकाओं युक्त. औसत डेटा को SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। एकल प्रतिकृति के एकल डेटा बिंदु त्रुटि सलाखों के बिना व्यक्त किए जाते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

परख के लिए इष्टतम सेल एकाग्रता में अंतर को स्पष्ट करने के लिए, 5 मिलियन टी-कोशिकाओं को एक 0.5 एमएल कक्ष (10 मिलियन कोशिकाओं / एमएल) में लोड किया गया था, और 1.25 मिलियन कोशिकाओं को दूसरे कक्ष (2.5 मिलियन कोशिकाओं / एमएल) में लोड किया गया था जिसमें 1 माइक्रोन टीएमआरएम(चित्रा 3ए-जी)था। टीएमआरएम पृष्ठभूमि की गणना करने के लिए तीन रिक्त प्रयोग भी शामिल किए गए थे। हमने पाया कि टी-कोशिकाओं की एक उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि (चित्रा 3बी, डी) के सापेक्ष टीएमआरएम प्रतिदीप्ति में अधिक विशिष्ट परिवर्तन हुआ। इसके अलावा, एक उच्च सेल एकाग्रता ने हमें एफसीसीपी (चित्रा 3ई, एफ) के अतिरिक्त के जवाब में ऑक्सीजन की खपत में अपेक्षित वृद्धि और एमएमपी की एक साथ कमी का पता लगाने की अनुमति दी। कोशिकाओं की कम एकाग्रता का उपयोग करने से प्रतिदीप्ति में एक कमजोर परिवर्तन हुआ जो पृष्ठभूमि के समानांतर था। चूंकि एमएमपी की गणना सिग्नल से पृष्ठभूमि को घटाती है, इसलिए कम सेल एकाग्रता सब्सट्रेट और अनकपलर्स के जवाब में एमएमपी में परिवर्तन के निर्धारण की अनुमति नहीं देती है। इस परख में कोशिकाओं की उच्च सांद्रता का उपयोग करने के अलावा, हम प्रयोगों के बीच प्रत्येक सेल प्रकार के लिए सेल एकाग्रता स्थिर रखने की सलाह देते हैं। एडीपी अनुमापन के साथ एमएमपी के अपव्यय में एटीपी-सिंथेज़ के प्रभाव को मान्य करने के लिए, हमने पीबीएमसी और टी-कोशिकाओं पर समानांतर प्रयोग चलाए जहां एक कक्ष को एडीपी अनुमापन (चित्रा 4)से पहले ओलिगोमाइसिन प्राप्त हुआ। हमें ऑलिगोमाइसिन के साथ इलाज की गई कोशिकाओं में एडीपी के जवाब में एमएमपी का कोई अपव्यय नहीं मिला, यह सुझाव देते हुए कि एडीपी के साथ एमएमपी में क्रमिक कमी एटीपी-सिंथेज़(चित्रा 4ए-एफ)के माध्यम से प्रोटॉन प्रवाह का परिणाम है। हमने एक ही प्रतिभागी के टी-कोशिकाओं और पीबीएमसी के बीच एडीपी संवेदनशीलता की तुलना भी की और टी-सेल अंश(चित्रा 4जी,एच)में एडीपी संवेदनशीलता कम (उच्च ईसी50) पाया। हमने टीएमआरएम प्रतिदीप्ति पर समय या सूट प्रोटोकॉल के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए रिक्त प्रयोगों की एक श्रृंखला आयोजित की। हमने पाया कि रिक्त प्रयोगों में टीएमआरएम सिग्नल ज्यादातर अनुमापन (चित्रा 5 ए) से प्रभावित होता है, जैसा कि अनुमापन (चित्रा 5बी) के समय के विपरीत होता है। हमने ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) में एडीपी-संचालित परिवर्तनों की तुलना की और 11 स्वस्थ, समुदाय-निवास स्वयंसेवकों (चित्रा 6ए-एच) से टी-कोशिकाओं और मोनोसाइट्स में एमएमपी में। बाह्य प्रवाह और एंजाइमी परख का उपयोग करके पहले प्रकाशित प्रयोगों के परिणामों के समान, मोनोसाइट्स ने लिम्फोसाइटों26,27(चित्रा 6ए,एच)की तुलना में अधिक माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता का प्रदर्शन किया। हालांकि, हमने माउस लीवर(चित्रा 7ए-एच)जैसे अत्यधिक चयापचय ऊतकों का उपयोग करते समय इस विधि से पता चलता है कि इस विधि के विपरीत, किसी भी सेल प्रकार(चित्रा 6सी,डी)में एडीपी के साथ ओसीआर में एक विशिष्ट खुराक-प्रतिक्रिया वृद्धि का पता नहीं लगाया। दूसरी ओर, टीएमआरएम के उपयोग ने हमें मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं (चित्रा 6ई-जी) में एडीपी के साथ एमएमपी में क्रमिक गिरावट का पता लगाने और चूहों से प्लीहा टी-कोशिकाओं में(चित्रा 7ई-एच)का पता लगाने की अनुमति दी। जबकि हमने सीधे एक ही अनुमापन प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव और माउस टी-कोशिकाओं की तुलना नहीं की, हमने पाया कि माउस टी कोशिकाओं के आईसी50 मानव विषयों से टी-कोशिकाओं को प्रसारित करने की तुलना में 10 के कारक से कम थे। चित्रा 3: उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री प्रयोग। (ए-डी) 0.5 एमएल कक्षों में 10 मिलियन कोशिकाओं/एमएल और 2.5 मिलियन कोशिकाओं/एमएल की टी-सेल सांद्रता का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री प्रयोगों का ट्रेस। (ए) 0.5 एमएल कक्षों में 10 मिलियन सेल / (सी) 0.5 एमएल कक्षों में 2.5 मिलियन सेल / ऑक्सीजन फ्लक्स (pmol/s/mL) शीर्ष पैनल (लाल) में दिखाया गया है, और कैलिब्रेटेड TMRM सिग्नल नीचे के पैनल (काला) में दिखाया गया है। नमूने के लिए पूरे सूट में टीएमआरएम में परिवर्तन और इसकी गणना की गई पृष्ठभूमि (बी) 10 मिलियन कोशिकाओं / एमएल और (डी) 2.5 मिलियन कोशिकाओं / एमएल युक्त कक्षों के लिए प्लॉट की गई थी। (ई) प्रत्येक सेल एकाग्रता के लिए, ऑक्सीजन प्रवाह (पीएमओएल/एस/मिलियन कोशिकाओं) और (एफ) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता की गणना की गई थी। (जी) एडीपी संवेदनशीलता वक्र प्लॉट किया गया था और एक गैर-रैखिक प्रतिगमन मॉडल (ठोस लाइनों) के लिए फिट था। संक्षिप्ताक्षर: mMP, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता; टीएमआरएम, टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर; सूट, सब्सट्रेट-अनकपलर-अवरोधक अनुमापन; एडीपी, एडेनोसिन डिफॉस्फेट; खोदो, डिजिटोनिन; मल, मैलेट; पायर, पाइरूवेट; ग्लूट, ग्लूटामेट; डी 1-11, लगातार 11 एडीपी अनुमापन; यू, 0.5 और 1.0 माइक्रोन के एफसीसीपी को अनकपलर करें; एएमए, एंटीमाइसिन ए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4: एटीपी-सिंथेज़ टी-कोशिकाओं और पीबीएमसी में झिल्ली क्षमता में एडीपी-संचालित कमी को चलाता है। (ए-एच) यहां वर्णित प्रोटोकॉल का परीक्षण पीबीएमसी और टी-कोशिकाओं में किया गया था। दो O2K कक्षों को PBMC के साथ इंजेक्ट किया गया था, और एक अतिरिक्त O2K के दो कक्षों को एक ही प्रतिभागी से T-कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था। सभी कक्षों में सब्सट्रेट मैलेट, पाइरूवेट और ग्लूटामेट को इंजेक्ट करने के बाद, पीबीएमसी और टी-कोशिकाओं के एक कक्ष को ओलिगोमाइसिन प्राप्त हुआ। ओलिगोमाइसिन ने (ए) पीबीएमसी और (डी) टी-कोशिकाओं में श्वसन में किसी भी एडीपी-संचालित वृद्धि या (बी, सी) पीबीएमसी और (ई, एफ) टी-कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में गिरावट को रोका। (जी, एच) टी-कोशिकाओं की तुलना में पीबीएमसी में एडीपी संवेदनशीलता अधिक थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 5: रिक्त प्रयोगों समय और substrates, uncouplers, और inhibitors (सूट) के अनुमापन के जवाब में TMRM प्रतिदीप्ति में परिवर्तन दिखा. (ए) अनुमापन के जवाब में टीएमआरएम प्रतिदीप्ति में परिवर्तन। (बी) समय के जवाब में टीएमआरएम प्रतिदीप्ति में परिवर्तन। प्रयोग 1 माइक्रोन टीएमआरएम युक्त Mir05 से भरे 0.5 एमएल कक्षों में आयोजित किए गए थे। एक कक्ष को कोई SUIT अनुमापन (कोई इंजेक्शन नहीं) नहीं मिला; दो अलग-अलग उपकरणों में दो कक्षों को एक मानक सूट प्रोटोकॉल (मानक इंजेक्शन) प्राप्त हुआ; एक कक्ष को एक ही सूट अनुमापन प्राप्त हुआ, लेकिन प्रत्येक इंजेक्शन (विलंबित इंजेक्शन) के बीच देरी के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 6: ओसीआर और एमएमपी का उपयोग करके टी-कोशिकाओं और मोनोसाइट्स के बीच एडीपी संवेदनशीलता में अंतर। (ए) एक विषय के मोनोसाइट और टी-सेल नमूने से उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री प्रयोग का ट्रेस। (बी) स्वस्थ स्वयंसेवकों के रक्त से मोनोसाइट्स (एन = 11) और टी-कोशिकाओं (एन = 13) में ऑक्सीजन की खपत। (सी, डी) ईसी50 की गणना करने के लिए एडीपी अनुमापन के साथ श्वसन में प्लॉट किए गए वृद्धि के गैर-रैखिक प्रतिगमन फिटिंग। (ई) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का एक साथ माप। (एफ, जी) आईसी50 की गणना करने के लिए एडीपी अनुमापन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में प्लॉट की गई गिरावट का गैर-रैखिक प्रतिगमन फिटिंग। (एच) मोनोसाइट्स और टी-कोशिकाओं की श्वसन क्षमता के पैरामीटर। डेटा को लाइन ग्राफ़ के लिए SEM ± माध्य और बार ग्राफ़ के लिए माध्य ± SD के रूप में व्यक्त किया जाता है। टी-परीक्षणों के बाद सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर * पी < 0.05 के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। ** पी < 0.01, और **** पी 0.0001 के लिए <। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. चित्रा 7: पारगम्य माउस स्प्लेनिक टी-कोशिकाओं और यकृत में श्वसन और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपीपी) में एडीपी प्रतिक्रिया की तुलना करना। (ए-डी) पारगम्य माउस प्लीहा टी-कोशिकाओं और यकृत में श्वसन में प्रतिक्रिया। (ई-एच) पारगम्य माउस स्प्लेनिक टी-कोशिकाओं और यकृत में एमएमपी में प्रतिक्रिया। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद तीन चूहों से ताजा जिगर और प्लीहा विच्छेदित किया गया था। स्प्लेनिक पैन टी कोशिकाओं एंटीबॉडी संयुग्मित चुंबकीय मनका जुदाई का उपयोग कर अलग किया गया. दोनों नमूने 1 माइक्रोन टीएमआरएम की उपस्थिति में एक ही सूट प्रोटोकॉल से गुजरे। (मैं, जे) EC50 की तुलना ADP के जवाब में mMP में कमी से ऑक्सीजन की खपत (OCR) और IC50 में वृद्धि से गणना की जाती है। एन = 3 प्रति समूह। डेटा SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. तालिका 1: उदाहरण सूट प्रोटोकॉल 0.5 एमएल कक्षों का उपयोग कर ताजा पृथक टी कोशिकाओं और मोनोसाइट्स में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का आकलन करने के लिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. तालिका 2: 0.5 एमएल कक्ष के लिए अनुशंसित एडीपी अनुमापन। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. तालिका 3: पांच स्वतंत्र रिक्त प्रयोगों का उपयोग कर औसत पृष्ठभूमि अनुपात की गणना. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. तालिका 4: नमूना प्रयोग से माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमपी) की गणना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. अनुपूरक चित्र 1: माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और झिल्ली क्षमता पर Mir05 और DMSO का प्रभाव। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें. पूरक फ़ाइल 1: माउस प्लीहा से टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए अभिकर्मक तैयारी और प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल पीबीएमसी, मोनोसाइट्स और टी-कोशिकाओं में एडीपी के बढ़ते स्तर के जवाब में एमएमपी के अपव्यय को मापकर ऊर्जा की मांग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता को मापने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेस्पिरोमेट्री का उपयोग करता है। यह जटिल I और II सब्सट्रेट जोड़कर माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता को अधिकतम करने के लिए किया जाता है और एटीपी पीढ़ी के लिए प्रोटॉन ढाल का उपयोग करने के लिए एटीपी-सिंथेज़ को धीरे-धीरे उत्तेजित करने के लिए एडीपी का अनुमापन करता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदमों में फ्लोरोफोर के लाभ और तीव्रता को 1000 तक सेट करना और यह सुनिश्चित करना शामिल है कि टीएमआरएम अनुमापन के दौरान टीएमआरएम फ्लोरोसेंट सिग्नल हासिल किया गया है। क्योंकि टीएमआरएम प्रतिदीप्ति प्रत्येक अनुमापन (इस विधि की एक सीमा) के बाद गिरावट आती है, यह रिक्त नमूनों का उपयोग कर पृष्ठभूमि प्रयोगों को चलाने के लिए जरूरी है. हमने यह भी पाया है कि डीएमएसओ का माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन और झिल्ली क्षमता पर निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है और इसलिए, Mir05 (अनुपूरक चित्रा 1) में टीएमआरएम के कामकाजी समाधान को पतला करने की सलाह देते हैं।

कुछ संशोधनों है कि जब इस प्रोटोकॉल की कोशिश कर इस्तेमाल किया जा सकता सेल सांद्रता को समायोजित करने और मानक 2 एमएल कक्ष का उपयोग कर रहे हैं. हालांकि, झिल्ली क्षमता और ऑक्सीजन प्रवाह में इष्टतम प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक कोशिकाओं की उच्च एकाग्रता के कारण टी-कोशिकाओं और मोनोसाइट्स के लिए 0.5 एमएल कक्ष को प्राथमिकता दी जाती है। मैक्रोफेज की तरह अधिक श्वसन क्षमता वाले कोशिकाओं का परीक्षण करते समय कोशिकाओं की कम एकाग्रता इष्टतम हो सकती है।

यहां प्रस्तुत विधि की अतिरिक्त सीमाओं में कम से कम 5 मिलियन टी-कोशिकाओं और 2.5 मिलियन मोनोसाइट्स की आवश्यकता शामिल है। हम अक्सर स्वस्थ प्रतिभागियों से ~ 20 एमएल रक्त से पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन ये संख्या स्वास्थ्य की स्थिति, आयु औरलिंग 26 से भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता का आकलन करने वाले अधिकांश तरीकों के रूप में, कोशिकाओं को ताजा रूप से अलग करने की आवश्यकता होती है। हालांकि, भविष्य में क्रायोप्रिजर्व्ड कोशिकाओं में इस विधि की कोशिश की जा सकती है। मानव रक्त से उपज की तुलना में, स्वस्थ चूहों की तिल्ली से टी-सेल उपज इस परख का संचालन करने के लिए पर्याप्त है।

परिसंचारी टी कोशिकाओं, विशेष रूप से लंबे समय तक रहने स्मृति (टीएम) और नियामक (Treg) कोशिकाओं, ऊर्जा37 के लिए oxidative फास्फारिलीकरण पर भरोसा. जबकि उनकी ऊर्जा की मांग और ऑक्सीजन की खपत कम है (उदाहरण के लिए, मांसपेशियों को आराम करने की तुलना में), उनके अस्तित्व पुन: संक्रमण और कैंसर 38,39,40 के लिए एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है. टी-सेल ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण में कमी के परिणामस्वरूप बिगड़ा हुआ प्रोलिफेरेटिव क्षमता होती है और टी-सेल थकावट और जीर्णता 5,41को बढ़ावा देता है। इसके अतिरिक्त, माइटोकॉन्ड्रियल हाइपरपोलराइजेशन सक्रियण42 के दौरान प्रभावक सीडी 4 टी-कोशिकाओं द्वारा साइटोकिन्स (आईएल -4 और आईएल -21) के निरंतर उत्पादन को बढ़ावा देता है। संक्रमण पर, सक्रियण और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रसार के लिए ऊर्जा की आवश्यकता बेसल चयापचय दर43 के 25% -30% के रूप में उच्च हो सकती है. इसलिए, प्रतिरक्षा कोशिकाएं ऊर्जा मांगों की एक विस्तृत और चरम सीमा में कार्य करती हैं, और यह प्रोटोकॉल उस सीमा के भीतर माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रियाओं का परीक्षण कर सकता है।

पुरानी सूजन मोटापे, मधुमेह और उम्र बढ़ने की एक सामान्य विशेषता है। परिसंचारी हार्मोन, लिपिड और ग्लूकोज के अनियमित स्तरों का प्रणालीगत प्रभाव पड़ता है और इस प्रकार यह प्रभावित कर सकता है कि माइटोकॉन्ड्रिया एक ऊर्जावान चुनौती का जवाब कैसे देता है। यहां, हमने पीबीएमसी को प्रसारित करने में माइटोकॉन्ड्रियल एडीपी संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की है। यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है कि एडीपी संवेदनशीलता को चयापचय रोग में कैसे संशोधित किया जा सकता है और यह स्वास्थ्य की स्थिति को कैसे प्रभावित करता है।

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम उन स्वयंसेवकों को धन्यवाद देना चाहते हैं जिन्होंने इस परियोजना के लिए रक्तदान किया। हम डॉ. एलेन शूर और उनकी टीम को उनके अध्ययन से अतिरिक्त नमूने प्रदान करने के लिए भी अपनी ईमानदारी से प्रशंसा करते हैं। हम पांडुलिपि की समीक्षा करने और इसे सुगमता के लिए संपादित करने के लिए एंड्रयू किर्श को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को निम्नलिखित फंडिंग स्रोतों द्वारा समर्थित किया गया था: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574।

Materials

Adenosine Diphosphate Sigma-Aldrich A5285 Fluorespirometry
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674 Fluorespirometry
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A6003 Mir05 buffer
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A6003 Cell isolation
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920 Fluorespirometry
Cell strainers Fisher Scientific 22-363-548 Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201 Cell isolation
CD3 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-101 Cell isolation
DatLab Oroboros Version 8
Digitonin Sigma-Aldrich D141 Fluorespirometry
D-Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Mir05 buffer
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E4378 Mir05 buffer
Filter Set AmR Oroboros 44321-01
HBSS (10x) Gibco 12060-040
HEPES sodium salt Sigma-Aldrich H7523 Mir05 buffer
Histopaque 1077 Sigma-Aldrich 10771 Cell isolation
K2EDTA blood collection tubes BD Vacutainer 366643 Cell isolation
Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516 Mir05 buffer
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich G1626 Fluorespirometry
L-Malic Acid Sigma-Aldrich M1000 Fluorespirometry
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Cell isolation
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M9272 Mir05 buffer
Multi-MACS stand and MidiMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-301 Cell isolation
O2k-Fluo Smart-Module Oroboros 12100-03
O2k-FluoRespirometer series J Oroboros 10201-03
O2k-sV-Module (0.5 chamber) Oroboros 11200-01
Oligomycin Sigma-Aldrich 04876 Fluorespirometry
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse Miltenyi 130095130 Isolation of T-cells from mouse spleen protocol
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662 Mir05 buffer
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 221473 Mir05 buffer
Prism GraphPad Version 10
Rotenone Sigma-Aldrich R8875 Fluorespirometry
RPMI Buffer Corning 17-105-CV Cell isolation
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich P2256 Fluorespirometry
Succinate disodium salt Sigma-Aldrich S2378 Fluorespirometry
Taurine Sigma-Aldrich T0625 Mir05 buffer
Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite Sigma-Aldrich T5428 Fluorespirometry
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References

  1. Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
  2. Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224 (Pt Suppl 1), jeb.236802 (2021).
  3. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochem J. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  4. Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
  5. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
  6. Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
  7. Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070 (2019).
  8. Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709 (2011).
  9. Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
  10. Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
  11. Pharaoh, G. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
  12. Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
  13. Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307 (2022).
  14. Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
  15. Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489 (2020).
  16. Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol (1985). 126 (2), 454-461 (2019).
  17. DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
  18. Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
  19. Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239 (2021).
  20. Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes. Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
  21. van der Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 3.16B.11-3.16B.14 (2016).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
  24. Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857 (2020).
  25. Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
  26. Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899 (2021).
  27. Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. 85, 51301 (2014).
  28. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
  29. Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
  30. Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
  31. Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147.e111 (2020).
  32. Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
  33. Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), e00286 (2015).
  34. Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
  35. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  36. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. , (2023).
  37. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  38. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
  39. Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
  40. MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
  41. Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
  42. Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, e06376 (2015).
  43. Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).

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Valencia, A. P., Pharaoh, G., Brandao, A. F., Marcinek, D. J. High-Resolution Fluorespirometry to Assess Dynamic Changes in Mitochondrial Membrane Potential in Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (207), e66863, doi:10.3791/66863 (2024).
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