לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא
Summary
בסרטון הזה, אנו מראים נוהל משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך הרקמה לחיות עם אקדח גנים רומן זעיר. אנחנו מפילה את הביטוי של מולקולות הנחיה Netrin האקסון בעוברים עלוקה על ידי אספקת מולקולות של dsRNA בקיר גוף הגחון ועל הגרעינים של מגזרים בודדים.
Abstract
בסרטון הזה, אנו מראים את השימוש באקדח פנאומטי נימי עבור משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך רקמת חיים. אנו משתמשים בהליך לביטוי דפוסי להפריע גנים מגזרים נבחרים של עוברים עלוקה, עוזב את פלחי מטופל כמו בקרות פנימיות.
אקדח פנאומטי נימי ניתן להשתמש כדי להגיע לשכבות הפנימיות של תאים בשלבים המוקדמים של הפיתוח מבלי לפתוח את הדגימה. כשיטה מבוא מקומי של חומרים אל תוך רקמות חיות, המסירה biolistic עם האקדח יש מספר יתרונות: הוא מהיר, ללא מגע ולא הרסנית. בנוסף, אקדח נימי יחיד יכול לשמש לאספקת עצמאית של חומרים שונים. אזור המשלוח יכול להיות ממדים לרוחב של ~ 50-150 מיקרומטר והוא משתרע על פני כ ~ 15 מיקרומטר עומק החדירה מתכוון, אשר מתכווננת בין 0 ל 50 מיקרומטר. מסירה זו יש את היתרון של היכולת היעד מספר מוגבל של תאים במיקום שנבחר ביניים בין תא בודד להפיל על ידי microinjection ו מציאה מערכתי באמצעות זריקות או תאיים באמצעות גישות גנטיות.
עבור דריסה או לדפוק בביטוי של Netrin מולקולה הדרכה האקסון, אשר באה לידי ביטוי באופן טבעי על ידי כמה נוירונים המרכזי בקיר גוף הגחון, אך לא את תחום הגבי, אנו מספקים מולקולות של dsRNA או DNA פלסמיד, לתוך הקיר הגוף מרכזי הגרעינים. הליך זה כולל את השלבים הבאים: (א) הכנת תוכנית ההתקנה ניסיוני assay מסוים (התאמת הלחץ מאיץ), (ii) ציפוי חלקיקים עם מולקולות של dsRNA או DNA, (iii) טעינת חלקיקים מצופים לתוך האקדח, עד שני ריאגנטים באחד assay, (ד) הכנת חיות למסירה החלקיקים, (v) משלוח של חלקיקים מצופים לרקמת המטרה (קיר הגוף או הגנגליונים), ו (vi) עיבוד עוברי (immunostaining אימונוהיסטוכימיה ו העצבית תיוג) כדי לחזות את התוצאות, בדרך כלל 2 עד 3 ימים לאחר הלידה.
כאשר החלקיקים היו מצופים netrin dsRNA, הם גרמו בבירור לדפוק למטה הביטוי netrin שרק התרחש התאים המכילים חלקיקים (בדרך כלל, 1-2 חלקיקים בכל תא). חלקיקים מצופים פלואורסצנטי קידוד פלסמיד EGFP המושרה בתאים עצביים כאשר הם עצרו הגרעינים שלהם.
Protocol
Discussion
בהפגנה זו, השתמשנו אקדח פנאומטי נימי להעביר חלקיקי זהב לתוך תאים בנפח מקומי קטן של העובר עלוקה לחיות לדפוק-in לדפוק למטה גנים. אזור היעד היה בדרך כלל בקוטר של ~ 150 מיקרומטר וחלקיקים נמצאו ~ 15 מיקרומטר סביב עומק החדירה מתכוון, אשר מתכווננת בין 0 ל 50 מיקרומטר. כאשר החלקיקים היו מצופים ?…
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר מיכאל בייקר על עזרתו ביצירת מבנים עבור גן עקום פנימה לצורך מתן זמן לשגות סרטים התחזיות החושית הגוברת. אנחנו רוצים גם להודות וירג'יניה Vandelinder לקבלת סיוע טכני עם הניסויים אקדח פנאומטי.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103 (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
