Lokaliserad RNAi och ektopisk Gene Expression i läkemedlet Leech
Summary
I denna video visar vi ett förfarande för en korrekt biolistic leverans av reagens till levande vävnad med en ny miniatyr gen pistol. Vi knackar ner ett uttryck för axonet vägledning molekylen Netrin i akterliket embryon genom att leverera molekyler av dsRNA i ventrala kroppen väggen och ganglier av enstaka segment.
Abstract
I denna video visar vi användning av en pneumatisk kapillär pistol för korrekt biolistic leverans av reagens till levande vävnad. Vi använder förfarandet för att störa mönster genuttryck i utvalda segment av blodigel embryon, lämnar obehandlade segment som intern kontroll.
Den pneumatiska kapillära pistolen kan användas för att nå interna lager av celler i tidiga stadier av utveckling utan att öppna provet. Som en metod för lokal införande av ämnen i levande vävnader, har biolistic leverans med pistolen flera fördelar: den är snabb, beröringsfri och oförstörande. Dessutom kan en enskild kapillär pistol användas för oberoende leverans av olika ämnen. Leveransen region kan ha laterala mått ~ 50-150 ìm och sträcker sig över ~ 15 ìm kring medelvärdet penetrationsdjupet, som är inställbart mellan 0 och 50 ìm. Denna leverans har fördelen av att kunna rikta ett begränsat antal celler i en vald plats mellanting mellan enskild cell slå ner genom mikroinjektion och systemiska knockdown genom extracellulära injektioner eller med hjälp av genetiska metoder.
För knackar ner eller knackar i uttryck av axonet vägledning molekylen Netrin, vilket naturligtvis uttrycks av några centrala neuron och i den ventrala kroppen väggen, men inte rygg-domänen, vi levererar molekyler av dsRNA eller plasmid-DNA i kroppen väggen och centrala ganglierna. Detta förfarande omfattar följande steg: (i) utarbetande av experimentuppställning för en specifik analys (justering av den accelererande trycket), (ii) beläggning partiklarna med molekyler av dsRNA eller DNA, (iii) Laddar den belagda partiklar i pistolen, upp till två reagenser i en analys, (iv) förbereda djur för partikeln leverans, (v) leverans av belagda partiklar i målvävnad (body vägg eller ganglier), och (vi) behandla embryon (immunfärgning, immunohistokemi och neuronala märkning) för att visualisera resultaten, vanligtvis 2 till 3 dagar efter leverans.
När partiklarna var belagd med netrin dsRNA orsakade de tydligt synliga knock-down av netrin uttryck som bara skett i celler som innehåller partiklar (vanligtvis 1-2 partiklar per cell). Partiklar belagd med en plasmid kodning EGFP inducerad fluorescens i neuronala celler när de stannade i sina kärnor.
Protocol
Discussion
I denna demonstration använde vi den pneumatiska kapillär pistolen för att leverera guldpartiklar till celler i små lokaliserade volymen av en levande blodigel embryo till knock-in och knock-down gener. Målet regionen hade generellt en diameter på ~ 150 ìm och partiklar hittades ~ 15 ìm kring medelvärdet inträngningsdjup, som var inställbart mellan 0 och 50 ìm. När partiklarna var belagda med dsRNA molekyler av axonet vägledning faktorn netrin, orsakade de tydligt synliga knock-down av netrin uttryck som bara förekommit i cel…
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Michael Baker för hans hjälp i att skapa konstruktioner för gen knock-in och för att tillhandahålla tidsförlopp filmer av växande sensoriska prognoser. Vi vill också tacka Virginia Vandelinder för tekniskt bistånd med experimenten tryckluftspistol.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
1. Baker, M. W. & Macagno, E. R. .RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology 10, 1071-1074 (2000).
2. Baker M.W. and Macagno E.R., Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods 156: 145-153 (2006).
3. Gan, W. B. et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology 40, 103-115 (1999).
4. Juven-Gershon T., Cheng S. and Kadonaga J.T., Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods 3(11): 917-922 (2006).
5. Rinberg, D., Simonnet, C. & Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters 87, 014103 (2005).
6. Shefi O., Simonnet C., Baker M.W., Glass J.R. and Macagno E.R., Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience 26: 6119-6123 (2006).
