Summary
Одноклеточный электропорации (SCE) является специализированной техники позволяет доставки ДНК или других макромолекул на отдельные клетки в неповрежденной ткани, в том числе в естественных препаратов. Здесь мы подробно процедура SCE из флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны в мозгу нетронутыми Xenopus laevis головастика.
Abstract
Одноклеточный электропорации (SCE) является специализированной техники позволяет доставки ДНК или других макромолекул на отдельные клетки в неповрежденной ткани, в том числе в естественных препаратов. Явное преимущество этого метода в том, что экспериментальные манипуляции могут быть выполнены на отдельные клетки, оставляя окружающую ткань без изменений, тем самым проводя различие клеточной автономных эффектов от тех, в результате глобального лечения. В сочетании с передовыми в естественных методов визуализации, SCE флуоресцентных маркеров позволяет прямой визуализации клеточной морфологии, рост клеток и внутриклеточных событий за сроки от нескольких секунд до нескольких дней. Хотя эта техника используется в разнообразных в естественных условиях и экс подготовки естественных условиях, мы оптимизировали эту технику для использования в Xenopus laevis головастиков. В этом видео статье мы подробно процедура SCE из флуоресцентного красителя или плазмидной ДНК в нейроны в мозгу нетронутыми альбиноса Xenopus головастика. Мы также обсудим методы для оптимизации доходности и показать примеры жить двухфотонной флуоресценции нейронов флуоресцентно помеченных SCE.
Protocol
Оборудование установки:
- Электротехническое оборудование, необходимое для этой техники стимулятор, осциллограф, и микропипетки держатель оснащен серебряную проволоку для вставки в микропипетки. Обычно мы используем инструменты Axon Axoporator 800A стимулятор, однако другие общие стимуляторы, такие как трава инструментов SD9 стимуляторы, также пригодны для одноклеточных электропорации. Стимулятор подключен к headstage, который взаимодействует с электродом серебряной проволоки, чтобы быть помещен внутрь стеклянной микропипетки содержащих внутренние проведении решение. Другие ведут от стимулятора подключен к входной осциллографа, который также получает данные от внешних головастика землю. Головастика внешних землю просто серебряной проволоки, которая остается в контакте с электротонических головастика во время электропорации. Схема полного раз микропипетки находится в контакте с головастика.
- Одноместный электропорации клетка требует микроскоп с хорошим рабочим расстоянием (по крайней мере 5 см), так как это дает пространство для маневра и позволяет микропипетки быть приведены в под углом примерно 30-45 градусов.
Изготовление микропипетки:
Подготовка соответствующих микропипетки является важным шагом в этом протоколе. Трудность заключается в балансировании узкий наконечник (менее 1 мкм в диаметре) с тем, который не будет легко ломаются, когда прокола ткани. Мы также обнаружили, что советы с коническим углом более 10 градусов, предпочтительнее.
- Подготовка вытащил стекло микропипетки с диаметром кончика менее 1 мкм, а угол кончика конусность превышает 10 градусов.
- Боросиликатного стекла с внутренней нити с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,75 мм хорошо подходит для этой цели.
- Относительно толстые стекла обеспечивает степень жесткости к кончику.
- Внутренние нити важно при составлении обратно заполненные жидкостью к кончику микропипетки.
- Боросиликатного стекла с внутренней нити с внешним диаметром 1,5 мм и внутренним диаметром 0,75 мм хорошо подходит для этой цели.
- Изготовление подходящих советов, которые могут потребовать нескольких модификациях на основе полученных результатов. Различные ткани может потребовать наконечник с немного другой формы или диаметр кончика.
Одноклеточный электропорации протокола:
Для новых пользователей, то целесообразно начинать с флуоресцентными красителями декстран, поскольку, в отличие от генетически закодированы флуоресцентных белков, их можно сразу же увидеть под epifluorescence. Использование флуоресцентных красителей позволяет пользователю непосредственно видеть расположение микропипетки на высоту не более тканей, и на электропорация дает мгновенную обратную связь относительно того, что оборудование было правильно настроить и будет ли кончика микропипетки является целесообразным.
- Заполните микропипетки с решением соединения на электропорации либо с помощью загрузки шприца или восполнения.
- При использовании ДНК плазмиды, убедитесь, что образцы эндотоксина свободной и концентрации между 1-2μg/ml, подготовленный в воде.
- Концентрация флуоресцентных красителей декстрана должны быть определены эмпирически. Мы часто используем флуоресцентными красителями, разбавленным водой примерно до 300μM.
- Как правило, объемы 0.5-1 мкл достаточно.
- Перед загрузкой, кратко центрифуги решения с высокой скоростью, чтобы уменьшить количество частиц мусора вовлечены в микропипетки, что может привести к засорению.
- Пузырьки воздуха в наконечник часто влияют на ток и должны быть выбиты энергично стряхивая микропипетки до монтажа на headstage.
- Вставьте в держатель микропипетки или headstage установлен на 3-х осевой микроманипулятора. Убедитесь, что электрод серебряной проволоки вставляется в микропипетки, и находится в контакте с электротонических внутреннее решение.
- Обезболить головастиков путем погружения в 0,02% MS-222 (3-аминобензойной кислоты этиловый эфир), подготовленный в головастика средой воспитания (раствор Стейнберга, рН 7,4).
- Мы обычно используем стадии 44-48 альбиносы Xenopus laevis головастиков в наших экспериментах.
- Головастики, как правило, полностью под наркозом после примерно 5 минут.
- Несколько головастиков может быть под наркозом одновременно сократить времени ожидания, однако, избегать контакта с MS-222 на период после 1 часа.
- Передача одного наркоза головастика до электропорации камеры использованием пластиковых микропипетки передачи.
- Электропорации камеру можно легко сделать в доме резьбы головастика формы полости в небольших Sylgard ® силиконовых блоков и вставки серебряной проволоки землю в полости такова, что она будет находиться в контакте с электротонических головастика в камере.
- Позиция головастика спинной стороны с использованием смоченной кистью.
- Нижняя микропипетки, пока он находится в контакте с кожей, непосредственно примыкающих к области интересов.
- Ориентация на регионы с плотно упакованными органов клетка значительно повысит шансы на успешное электропорации.Как правило, мы целевой головастика оптических покрышки.
- Принесите микропипетки под углом от 30 до 45 градусов. Меньшую траектории сделать кожу прокол сложнее, а круче углы зачастую препятствуют своим видом.
- Продолжение снижения микропипетки первоначально будет углубление кожи, а затем пройти в основную ткань.
- Поверхностные клетки являются предпочтительными для прижизненного изображения, и могут быть направлены на обеспечение того, чтобы кончик микропипетки медленно опускается на рябь кожи.
- Надо постоянно следить за микропипетки сопротивление раз помещен в ткани. При использовании Axoporator 800A (Axon Instruments), сопротивления около 10-40мОм являются оптимальными. Сопротивление является хорошим индикатором того, диаметр кончика подходит для одноклеточных электропорации.
- Высокое сопротивление микропипетки (> 100 МОм), свидетельствуют о забитых советы микропипетки с советами, которые являются слишком узкими.
- Низкое сопротивление микропипетки (<10 МОм) указывают на диаметр кончика, который является слишком большим, часто в результате сломанный наконечник.
- При использовании стимулятора, который не обеспечивает прямое измерение сопротивления, микропипетки сопротивление может косвенно измеряется путем наблюдения амплитуды импульсов напряжения измеряется осциллографа (см. ниже).
- Применить напряжения поезда.
- Для ДНК плазмиды, импульсов оказалась наиболее эффективной состоят из отрицательных прямоугольных импульсов волны 1 мс в срок, сделанное на 300Hz с импульсов длительностью 500 мс.
- Импульса напряжения определяется эмпирически, что амплитуды импульсов, измеренных на осциллограф между 0,75 и 1.5μA.
- Для флуоресцентных красителей декстран, положительные прямоугольные импульсы волна 300μs продолжительность поставляются на частоте 300 Гц с импульсов длительностью 10 мс.
- Как и протокол для ДНК, импульса напряжения определяется эмпирически, что амплитуды импульсов, измеренных на осциллограф между 0,75 и 1.5μA.
- Дополнительные корректировки стимул параметры могут быть сделаны на основе наблюдений результаты электропорации под epifluorescence.
- Если электропорации клетки появляются тусклые, параметры импульсов должны быть постепенно увеличена до клетки появляются ярче.
- С другой стороны, если кластеры клеток, помечены, параметры импульсов должны быть сокращены до одной клетки помечены.
- Для ДНК плазмиды, импульсов оказалась наиболее эффективной состоят из отрицательных прямоугольных импульсов волны 1 мс в срок, сделанное на 300Hz с импульсов длительностью 500 мс.
- Уберите микропипетки, повторно вставить в другое место в пределах тканей, и применять напряжение поезд.
- Для повышения урожайности, мы обычно electroporate нескольких сайтах в каждом полушарии головастика оптических покрышки с достаточным расстоянием, чтобы меченых клеток не перекрываются.
- Передача электропорации головастика в контейнере с воспитанием решение Стейнберга.
- Головастики быстро оправиться от наркоза в течение нескольких минут.
- Микропипетки же может быть использован для многочисленных головастиков. Важно постоянно наблюдать амплитуды импульсов наблюдается на осциллографе.
- Если амплитуда импульса остается на низком уровне после значительного увеличения интенсивности импульса это, вероятно, в результате засорения наконечника, часто видели, когда electroporating много головастиков в один присест.
- Метод выбить незначительных забивают наконечник должен применяться один положительный импульс после вставки микропипетки в ткань.
- Если забивать не могут быть смещены или засорение часто повторяется, замените микропипетки.
- Если амплитуда импульса остается очень большим после значительного снижения параметров импульса, это признак того, что кончик сломался и его необходимо заменить.
- Если амплитуда импульса остается на низком уровне после значительного увеличения интенсивности импульса это, вероятно, в результате засорения наконечника, часто видели, когда electroporating много головастиков в один присест.
Скрининг для успешного электропорации клеток:
- После электропорации, головастиков, проверяются на меченых клеток с использованием вертикально epifluorescence микроскопом.
- В случае с флуоресцентными красителями, головастиков могут просматриваться после всего лишь 30 минут после электропорации.
- Мы нашли, однако, что более длительные интервалы связаны с более низким уровнем фона флуоресценции.
- Для генетически закодированы флуоресцентные белки, обследование обычно проводится в течение 12 часов после электропорации.
- Клетки, экспрессирующие флуоресцентных белков будет продолжать становиться ярче с течением времени, поэтому тусклый клетки могут быть повторный скрининг после дополнительного интервалом 12-24 часов.
- Головастики анестезируют, как описано выше, размещенных в Sylgard ® камеры и coverslipped. Индивидуальные головастиков, затем рассматривается в соответствии с epifluorescence.
- Обратите внимание, что чрезмерное воздействие света epifluorescence приведет фототоксичности, которые могут убить меченых клеток. Таким образом, свести к минимуму количество времени, что клетки подвергаются воздействию дневного света.
- Вернуться головастиков в контейнер с воспитанием решение Стейнберга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одноклеточный электропорации (SCE) является мощным инструментом для определения функций генов и выполнение целевых генетических манипуляций. Прозрачность альбиноса головастика и доступности мозга делают эту модель системы идеально подходят для визуализации нейронных роста и внутриклеточных событий в живой организм. SCE позволяет визуализировать рост одного нейрона, а также для выполнения автономных клеточных манипуляций в противном случае неизменным мозга. Хотя эта статья демонстрирует видео процедура одноклеточных электропорации в Xenopus laevis головастиков, эта техника была использована и в других организмов, а также используется в срезах гиппокампа и диссоциированных культурах клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Шармин Хоссейн для покадровой съемки фильма рост незрелых нейронов и Дерек Данфилд для электронных изображений микроскопии SCE советы micromicropipette.
References
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).
- Dunfield, D., Haas, K.
Single cell electroporation. Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming. - Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).