Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Summary

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik, die Abgabe von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Hier haben wir ausführlich das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Xenopus laevis Kaulquappen.

Abstract

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist eine spezialisierte Technik ermöglicht die Bereitstellung von DNA oder andere Makromoleküle in einzelne Zellen innerhalb intakten Gewebe, auch in vivo Präparate. Der entscheidende Vorteil dieser Technik ist, dass experimentelle Manipulationen an einzelnen Zellen durchgeführt werden, während die umgebenden Gewebe unverändert, so unterscheiden Zell-autonome Effekte aus, die sich aus globalen Behandlungen. Wenn mit fortgeschrittenen In-vivo-Bildgebung kombiniert, ermöglicht SCE von fluoreszierenden Markern direkte Visualisierung der zellulären Morphologie, Zellwachstum, und intrazelluläre Ereignisse, auf Zeitskalen von Sekunden bis zu Tagen. Während diese Technik in einer Vielzahl von in vivo und ex vivo Präparaten verwendet wird, haben wir diese Technik für den Einsatz in Xenopus laevis Kaulquappen optimiert. In diesem Video-Beitrag, Detail, das wir das Verfahren für die SCE von einem fluoreszierenden Farbstoff-oder Plasmid-DNA in die Neuronen im intakten Gehirn des Albino Xenopus Kaulquappen. Wir diskutieren auch Methoden, um die Ausbeute zu optimieren, und zeigen Beispiele von Live-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Imaging von Neuronen Fluoreszenz von SCE gekennzeichnet.

Protocol

Gerätesatz-up: Die elektrische Ausrüstung für diese Technik erforderlich sind, ein Stimulator, ein Oszilloskop und einer Mikropipette Halter mit einem Silberdraht in die Mikropipette eingefügt ausgestattet. Wir verwenden in der Regel einem Axon Instrumente Axoporator 800A Stimulator, aber auch andere gemeinsame Stimulatoren wie Grass Instrumente SD9 Stimulatoren sind auch für Single-Cell-Elektroporation geeignet. Der Stimulator ist es, die headstage, die mit dem Silberdraht-Elektrode im Inneren der Glasmi…

Discussion

Einzel-Zell-Elektroporation (SCE) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Bestimmung der Genfunktion und Durchführung von gezielten genetischen Manipulation. Die Transparenz des Albino-Kaulquappe und die Zugänglichkeit des Gehirns lässt sich dieses Modell, das ideal für die Visualisierung von neuronalen Wachstums-und intrazelluläre Ereignisse innerhalb eines lebenden Organismus geeignet. SCE ermöglicht die Visualisierung des Wachstums eines einzelnen Neurons, und Zell-autonome Manipulationen innerhalb eines ansonsten unveränderten Geh…