मानव मस्तिष्क के ऊतकों के लिए एक chromatin परख
Summary
हाल ही में जब तक, मानव मस्तिष्क पर अभिव्यक्ति के अध्ययन शाही सेना या प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए सीमित थे. Chromatin immunoprecipitation इस पत्र में वर्णित तकनीकों के साथ, यह संभव हो सकता है और शवपरीक्षा मस्तिष्क में जीन की अभिव्यक्ति के histone मेथिलिकरण अन्य epigenetic नियामकों नक्शा है.
Abstract
एक प्रकार का पागलपन, द्विध्रुवी रोग और autism के रूप में लगातार neuropsychiatric बीमारियों आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों है कि जीन अभिव्यक्ति और अन्य आणविक विकृति के epigenetic परिवर्तन में परिणाम हो सकता है की एक संयोजन से परिणाम के लिए लगा रहे हैं. परंपरागत रूप से, तथापि, शवपरीक्षा मस्तिष्क में अभिव्यक्ति अध्ययन mRNA या प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए ही सीमित थे. autolysis समय और ऊतक integrities में variabilities जैसे शवपरीक्षा मस्तिष्क अनुसंधान में आई सीमाओं को भी उच्च आदेश chromatin संरचनाओं के किसी भी अध्ययन के प्रभाव की संभावना है. हालांकि, जीनोमिक डीएनए के nucleosomal डीएनए सहित संगठन: histone कोर – बाध्यकारी प्रतिनिधि मस्तिष्क के विभिन्न बैंकों द्वारा उपलब्ध कराई गई नमूनों में काफी हद तक संरक्षित प्रतीत होता है. इसलिए, यह संभव है मेथिलिकरण पैटर्न और शवपरीक्षा मस्तिष्क में परिभाषित जीनोमिक loci में कोर histones के अन्य सहसंयोजक संशोधनों का अध्ययन. यहाँ, हम एक सरलीकृत जमी (निर्धारित कभी नहीं) मानव मस्तिष्क नमूनों के लिए देशी chromatin immunoprecipitation प्रोटोकॉल (NChIP) उपस्थित थे. Micrococcal मस्तिष्क homogenates की nuclease पाचन के साथ शुरू, NChIP qPCR द्वारा पीछा तीन दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत पद्धति सामान्य और रोगग्रस्त मानव मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति के epigenetic तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Protocol
Discussion
प्रोटोकॉल यहाँ उल्लिखित मानव मस्तिष्क के histone और / या डीएनए मेथिलिकरण हस्ताक्षर में रुचि जांचकर्ताओं के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, क्योंकि इन chromatin चिह्नों कम शवपरीक्षा कलाकृतियों के लिए प्रवण के रूप में संशोधन…
Acknowledgements
इस काम के मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (5R01MH071476) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
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