A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue
Summary
Bis vor kurzem waren Ausdruck Studien über menschliche Gehirn zu Quantifizierung von RNA oder Proteine beschränkt. Mit dem Chromatin-Immunopräzipitation Techniken in diesem Papier beschrieben wurde, wird es möglich sein, Histon-Methylierung und andere epigenetische Regulatoren der Genexpression in postmortem Gehirn abzubilden.
Abstract
Chronische neuropsychiatrische Erkrankungen wie Schizophrenie, bipolare Erkrankung und Autismus werden gedacht, um aus einer Kombination von genetischen und umweltbedingten Faktoren, die in epigenetischen Veränderungen der Genexpression und andere molekulare Pathologie Ergebnis führen könnte. Traditionell wurden jedoch Ausdruck Studien in post mortem Gehirn Quantifizierung von mRNA oder Protein beschränkt. Die Einschränkungen in postmortem Hirnforschung wie Variabilitäten in Autolyse Zeit und Gewebe Ganzheiten angetroffen werden wahrscheinlich auch keine Studien höherer Ordnung Chromatin-Strukturen auswirken. Doch die nukleosomalen Organisation der genomischen DNA mit DNA: Kern Histon-Bindung – offenbar weitgehend in repräsentativen Stichproben von verschiedenen Hirn-Banken erhalten. Daher ist es möglich, die Methylierungsmuster und andere kovalente Modifikationen der Core-Histone in definierten genomischen Loci in post mortem Gehirn zu studieren. Hier präsentieren wir eine vereinfachte nativen Chromatin-Immunopräzipitation (NChIP)-Protokoll für gefrorene (nie fest) menschliche Gehirn Proben. Beginnend mit Mikrokokken-Nuclease Verdauung von Hirnhomogenaten, gefolgt NChIP von qPCR können innerhalb von drei Tagen abgeschlossen sein. Die Methodik hier vorgestellten sollte nützlich sein, um epigenetische Mechanismen der Gen-Expression in normalen und erkrankten menschlichen Gehirn aufzuklären.
Protocol
Discussion
Das Protokoll hier skizzierte ist besonders nützlich für die Ermittler in Histon und / oder DNA-Methylierungs-Signaturen des menschlichen Gehirns interessiert, weil diese Chromatin Markierungen möglicherweise weniger anfällig für postmortale Artefakte als andere Arten von Änderungen, einschließlich (Histon) Acetylierung und Phosphorylierung 1 verglichen, 2. Die Obduktion des Gehirns ist offen für das Studium der Mono-nukleosomalen Präparate, die DNA bleibt weitgehend auf die Core-Histone angebracht, zumindest in Proben m…
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute of Mental Health (5R01MH071476) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tris-HCl | EMD | 9310 | ||
| Magnesium Chloride Hexahydrate | OmniPur | 5980 | ||
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-3 | ||
| EDTA, 0.5M Solution, pH8.0 | OmniPur | 4055 | ||
| Sodium Chloride | Mallinckrodt Chemicals | 7581-06 | ||
| SDS Solution 10% (w/v) | Bio-Rad | 161-0416 | ||
| Triton X-100 | Fluka | 93426 | ||
| Igepal CA-630 | Sigma | I-3021 | ||
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-25G | ||
| Lithium Chloride | Sigma | L9650-100G | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S7277-250G | ||
| Sodium Acetate (anhydrous) | Sigma | S-2889 | ||
| Nuclease micrococcal from Staphylococcus | Sigma | N3755-200UN | ||
| Benzamidine | Fluka | 12072 | ||
| Phenylmethanesulfonylfluoride | Sigma | P7626-1G | ||
| 3M DTT | Fluka | 43815 | ||
| Protein G Agarose, Fast Flow | Upstate | 16-266 | ||
| Sonicated Salmon Sperm DNA Kit | Stratagene | 201190 | ||
| Proteinase K from Engyodontium album | Sigma | P2308 | ||
| Phenol:Chloroform 1:1 | OmniPur | 6810 | ||
| Glycogen, From Mussels | Sigma | G1767-1VL | ||
| Ethyl Alcohol (200 Proof) | Pharmco-AAPER | 111000200 |
Solutions:
- nChIP Douncing Buffer : 10 mM Tris, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 adjust pH to 7.5
- 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl adjust pH to 7.5
- Low salt washing buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl
- High salt washing Buffer: 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (Ph 8), 500 mM NaCl
- Lithium Chloride Buffer: 1% IGEPAL-CA 630, 1% Deoxycholic acid, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0.25 M LiCl
- TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA
- Elution Buffer: 0.1M NaHCO3, 1% SDS
- Proteinase K digestion buffer (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, 2M NaCl adjust pH to 8.0
- 3 M Sodium Acetate: 24.61 g anhydrous sodium acetate (M.W.=82.03) in 100 mL of autoclaved distilled water. Adjust pH to 5.2 using concentrated acetic acid.
References
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