Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Summary

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Abstract

Hematopoietische stamcellen (HSC's) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van alle celtypen van het bloed lijnen gedurende het hele leven van een individu. Alle HSCs ontstaan ​​tijdens de embryonale ontwikkeling, waarna de pool grootte wordt onderhouden door zelf-vernieuwing celdelingen. Het identificeren van de anatomische oorsprong van HSC en de kritische ontwikkeling gebeurtenissen reguleren van het proces van HSC ontwikkeling is ingewikkeld als veel lokalisaties deel te nemen tijdens de foetale hematopoiesis. Recent identificeerden we de placenta als een belangrijk orgaan waar hematopoietische HSC's worden gegenereerd en uitgebreid in een unieke microenvironmental niches (Gekas, et al. 2005, Rhodos, et al. 2008). Bijgevolg is de placenta is een belangrijke bron van HSC tijdens hun opkomst en de eerste uitbreiding.

In dit artikel tonen we dissectie technieken voor de isolatie van murine placenta van E10.5 en E12.5 embryo's, die overeenkomen met de ontwikkelingsstadia van de inleiding van HSC en de piek in de grootte van de HSC zwembad in de placenta, respectievelijk. Daarnaast presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor enzymatische en mechanische dissociatie van placenta weefsel in de single-cell suspensie voor gebruik in de flowcytometrie of functionele assays. We hebben gevonden dat het gebruik van collagenase voor single-celsuspensie van placenta voldoende opbrengsten van HSC geeft. Een belangrijke factor die van invloed HSC opbrengst van de placenta is de mate van mechanische dissociatie voorafgaand aan, en de duur van, enzymatische behandeling.

We bieden ook een protocol voor de bereiding van vaste-ingevroren placenta weefsel secties voor de visualisatie van de ontwikkeling van HSC door middel van immunohistochemie in hun precieze cellulaire niches. Als hematopoietische specifieke antigenen zijn niet bewaard gebleven tijdens de bereiding van paraffine ingebedde coupes, we routinematig gebruik van vaste vriescoupes voor het lokaliseren van de placenta HSCs en voorouders.

Protocol

1. Embryo verwijdering en placenta dissectie Om te beginnen, moeten embryo's eerst worden geïsoleerd van zwangere dammen. Dieren worden gedood volgens goedgekeurde procedures – in ons geval gaan we een dodelijke dosis van het verdovingsmiddel isofluraan gebruiken De eerste, spray de buik met ethanol en een kleine incisie met een schaar. Afscheuren van de huid met beide handen op de buik bloot te leggen en open snijden het buikvlies. Met een pincet, pak de baarmoeder…

Discussion

De experimentele procedures beschreven in dit protocol zal zorgen voor isolatie en visualisatie van placenta weefsel en hematopoietische stamcellen en progenitorcellen. Voor een uitgebreide samenvatting over de verwachte opbrengst en het aantal cellen van HSC in de placenta en andere foetale hematopoietische organen gedurende de foetale ontwikkeling verwijzen we naar Gekas, et al.. 2005. Voor het lokaliseren van het ontwikkelen van HSC en andere hematopoietische cellen in de placenta verwijzen we naar Rhodos, et al.. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)