Isolering och analys av hematopoetiska stamceller från moderkakan

Summary

Vi har identifierat moderkakan som en viktig hematopoetiska organ under utvecklingen. Vi fann att hematopoetiska stamceller (HSCs) är både genereras och expanderat i moderkakan i unika microenvironmental nischer. Här beskriver vi experimentella tekniker som krävs för isolering och visualisering av HSCs i musen moderkakan.

Abstract

Hematopoetiska stamceller (HSCs) har förmågan att själv förnya och generera alla celltyper i blodet linjerna under hela livslängden för en individ. Alla HSCs uppstår under fosterutvecklingen, varefter deras pool storlek upprätthålls av själva förnya celldelningar. Identifiera anatomiska ursprung HSCs och den kritiska utvecklingsmässiga händelser som reglerar processen med HSC utveckling har komplicerat som många anatomiska ställen delta under fosterstadiet blodbildningen. Nyligen identifierade vi moderkakan som ett stort hematopoetiska organ där HSCs genereras och expanderade i unika microenvironmental nischer (Gekås, et al 2005, Rhodos, et al 2008). Därför är moderkakan en viktig källa till HSCs under deras uppkomst och inledande expansion.

I den här artikeln visar vi dissektion tekniker för isolering av murina moderkakan från E10.5 och E12.5 embryon, motsvarande utvecklingsstadier för insättande av HSCs och toppen i storlek HSC poolen i moderkakan, respektive. Dessutom presenterar vi ett optimerat protokoll för enzymatisk och mekanisk dissociation av moderkakan vävnad till encelliga suspension för användning i flödescytometri eller funktionella analyser. Vi har funnit att användningen av kollagenas för encelliga suspension av moderkakan ger tillräcklig avkastning av HSCs. En viktig faktor som påverkar HSC avkastningen från moderkakan är graden av mekaniska dissociation före, och varaktighet, enzymatisk behandling.

Vi erbjuder även ett protokoll för beredning av fast frusna moderkakan vävnadssnitt för visualisering för att utveckla HSCs genom immunhistokemi i deras exakta cellulära nischer. Som hematopoetiska specifika antigener inte bevaras under beredning av paraffininbäddade sektioner, vi använder rutinmässigt fast frysta snitt för att lokalisera moderkakan HSCs och stamceller.

Protocol

1. Embryo borttagning och moderkakan dissektion Till att börja med måste embryon först isoleras från gravida dammar. Djur avlivas i enlighet med godkända förfaranden – i vårt fall kommer vi att använda en dödlig dos av bedövningsmedel isofluran Först spraya magen med etanol och göra ett litet snitt med en sax. Riv bort huden med båda händerna för att avslöja buken och skära upp bukhinnan. Med pincett, plocka upp livmodern horn och samla dem med en sax i …

Discussion

Den experimentella procedurer som beskrivs i detta protokoll kommer att möjliggöra isolering och visualisering av moderkakan vävnad och hematopoetiska stamceller och progenitorceller. För en uttömmande sammanfattning om förväntade cellulär avkastning och antal HSCs i moderkaka och andra fostrets hematopoetiska organ under fosterutvecklingen hänvisar vi till Gekås, et al. 2005. För lokalisering av att utveckla HSCs och andra hematopoetiska celler i moderkakan hänvisar vi till Rhodos, et al. 2008.

Materials

Materials List:
100mM Glucose
10mM NaN3
15-ml conical tubes (BD)
16-G, 18-G, 20-G, 22-G and 25-G needles (BD)
30% Sucrose Solution
35mm Petri Dishes (BD)
4% Paraformaldehyde
50- m cell filters (Celltrics)
5-ml syringes (BD)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (Vector Red, Vector)
Alkaline Phosphatase Substrate Kit III (Vector Blue, Vector)
Antibiotic (Penicillin/Streptomycin, P/S) solution
Collagenase type I (Sigma)
Cryomold Disposable Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek)
Cytokeratin Primary Antibody (DakoCytomation)
Dissection forceps, stainless steel or titanium, number 5 or 55
Drierite
Fetal Bovine Serum (FBS)
Fisherbrand Plastic Microscope Slide Mailer (Fisher)
Glucose Oxidase 1000u/ml
Levamisole (Vector)
Mounting media, Aqueous-based Mounting Medium (VectamountTM AQ)
Normal Horse Serum (Vector)
Optimal Cutting Temperature (O.C.T., Tissue-Tek)
Peroxidase Substrate Kit DAB (Vector)
Phosphate Buffered Saline (PBS) with Calcium/Magnesium (w Ca2+/Mg2+)
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium/Magnesium (w/o Ca2+/Mg2+)
Plastic Slide Box (holds 100 slides)
Plastic Tubing (Nalgene 180 PVC Non-toxic Autoclavable)
Polypropylene Round-Bottom Test Tube, 5 ml (12×75 mm, BD Falcon)
Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco)
Research Products International Corp Super Pap Pen HT* Slide Markers (2,5 mm, Fisher)
Tissue-culture treated U-shaped (round-bottom) 96-well or 24-well plates (BD Falcon)
Tween20, SigmaUltra (Sigma)
Tyramide Amplification Kit (Invitrogen)
Vectastain ABC Alkaline Phosphatase Standard Kit (Vector)
Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)